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淋巴细胞信号转导通路匍察淋巴细胞是免疫系统中的重要组成部分，负责识别和攻击体内的病原体。
为了实现这一功能，淋巴细胞需要通过一系列复杂的信号转导通路来传递和响应外界的信号刺激。
本文将对淋巴细胞信号转导通路进行匍察，以期更好地理解免疫系统中的免疫应答机制。
淋巴细胞信号转导通路通常被分为两条主要的信号通路：T细胞受体（TCR）信号通路和B细胞受体（BCR）信号通路。
这两条通路在淋巴细胞中起着关键的作用，通过激活一系列蛋白质和转录因子来调节细胞的增殖、分化和功能。
在TCR信号通路中，TCR与特定的抗原结合后，会引发一系列的信号传递过程。
首先，TCR与辅助蛋白共受体CD3结合，形成TCR-CD3复合物。
这一复合物激活下游的蛋白酪氨酸激酶Lck，进而磷酸化免疫受体酪氨酸激酶（ITAMs）位于CD3链上的胞内区域。
磷酸化的ITAMs再进一步结合并激活锌指蛋白ZAP70。
激活的ZAP70通过磷酸化下游信号分子，包括LAT、SOS1和PLCγ1等，最终导致细胞内信号的增强和转导。
与TCR信号通路类似，BCR信号通路也经历一系列的信号传递过程。
当BCR与特定抗原结合后，它会形成一个受体聚集簇。
这种聚集簇激活下游的酪氨酸激酶，包括Src家族激酶Lyn，进而磷酸化免疫受体聚集区域的免疫受体酪氨酸激酶（ITAMs）。
ITAMs的磷酸化激活下游的蛋白质，如Syk和Btk，最终促使细胞内的信号转导。
除了TCR和BCR信号通路外，淋巴细胞还可以通过共刺激分子和辅助细胞来调节其信号传递。
共刺激分子，如CD28和CD40，可以与淋巴细胞表面的相应配体结合，从而激活细胞内的信号转导通路。
辅助细胞，如树突状细胞和辅助T细胞，通过细胞间的接触和分泌的细胞因子来激活和调节淋巴细胞的免疫应答。
淋巴细胞信号转导通路的研究已经取得了显著的进展，并为我们理解和治疗多种免疫相关疾病提供了重要的线索。
例如，选择性抑制特定信号通路的药物已经被广泛应用于肿瘤治疗，通过抑制淋巴细胞的增殖和功能来控制肿瘤的发展。
陕西医学杂志期刊征稿：陕西医学陕西医学期刊级别：统计源期刊主管单位：陕西省卫生厅主办单位：陕西省中医药研究院出版地方：陕西快捷分类：医学国际刊号：1000-7377国内刊号：61-1104/R邮发代号：52-40创刊时间：1972陕西医学杂志简介期刊之家医学核心学术期刊杂志社结成了学术联盟，如果您有医学学术论文需要发表到统计源期刊(中国科技核心期刊)、中文核心期刊（北大核心）、南大核心（cssci）或SCI检索收录期刊等需求的作者请及时与我们联系，进行学术期刊选刊与时间安排等相关事务联系杨老师微信LunwenFz《陕西医学》（月刊）创刊于1972年，由陕西省中医药研究院主办。
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生物技术进展２０２１年㊀第１１卷㊀第２期㊀２１４~２２２ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ㊀ＩＳＳＮ２０９５￣２３４１研究论文Ａｒｔｉｃｌｅｓ㊀收稿日期:２０２１￣０１￣１４ꎻ接受日期:２０２１￣０１￣２７㊀基金项目:上海市浦东新区科技发展基金(ＰＫＸ２０１９￣Ｓ０９)ꎮ㊀联系方式:张博慧Ｅ￣ｍａｉｌ:ｙａｏｙａｏｚｈｄ＠１６３.ｃｏｍꎻ∗通信作者许俊彦Ｅ￣ｍａｉｌ:ｊｕｎｙａｎ.ｘｕ＠ｄｒａｇｏｎｂｏａｔｂｉｏ.ｃｏｍ利用Ｎ糖苷酶Ｆ对单克隆抗体Ｎ糖酶解条件的优化张博慧ꎬ㊀贾戴辉ꎬ㊀程倩ꎬ㊀许俊彦∗ꎬ㊀邵喆ꎬ㊀黄应峰宝船生物医药科技(上海)有限公司药物分析部门ꎬ上海２０１２０３摘㊀要:为了优化利用Ｎ糖苷酶Ｆ(ＰＮＧａｓｅＦ)酶解单克隆抗体中Ｎ糖的方法ꎬ应用本公司生产的单抗对ＰＮＧａｓｅＦ酶的酶解条件进行优化ꎬ包括缓冲液ｐＨ㊁酶种类㊁仪器㊁酶解程度㊁变性缓冲液及酶加入量等ꎬ总结酶解条件对Ｎ糖谱结果的影响ꎮ结果显示ꎬ置换缓冲液至１ˑＰＢＳ中可以避免某些单抗在低ｐＨ酶解时Ｇ０Ｆ转化为Ｇ０Ｆ￣ＧＮ并可改善峰型ꎻ快速ＰＮＧａｓｅＦ和加入变性缓冲液能有效提高酶解效率ꎻＵＰＬＣ和１.７μｍ粒径色谱柱能提高分离度ꎻ不完全酶解影响Ｎ糖含量结果ꎮ研究结果表明ꎬ采用优化的酶解条件可快速㊁有效的酶解单抗上的Ｎ糖ꎬ使Ｎ糖谱结果准确可靠ꎬ为细胞株筛选和单抗药物质量控制提供有效手段ꎮ关键词:单克隆抗体ꎻＮ糖ꎻＰＮＧａｓｅＦ酶ＤＯＩ:１０.１９５８６/ｊ.２０９５￣２３４１.２０２１.０００５中图分类号:Ｑ８１９ꎬＲ９７㊀㊀㊀文献标识码:ＡＯｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆＨｙｄｒｏｌｙｓｉｓＣｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆＮ￣ｇｌｙｃａｎｆｒｏｍＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓｂｙＰＮＧａｓｅＦ㊀ＺＨＡＮＧＢｏｈｕｉꎬＪＩＡＤａｉｈｕｉꎬＣＨＥＮＧＱｉａｎꎬＸＵＪｕｎｙａｎ∗ꎬＳＨＡＯＺｈｅꎬＨＵＡＮＧＹｉｎｇｆｅｎｇＤｒｕｇＡｎａｌｙｓｉｓＤｅｐａｒｔｍｅｎｔꎬＤｒａｇｏｎｂｏａｔＢｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＣｏ.ꎬＬｔｄꎬＳｈａｎｇｈａｉ２０１２０３ꎬＣｈｉｎａＡｂｓｔｒａｃｔ:ＩｎｏｒｄｅｒｔｏｄｅｖｅｌｏｐａｎｄｏｐｔｉｍｉｚｅａｍｅｔｈｏｄｏｆｈｙｄｒｏｌｙｚｉｎｇＮ￣ｇｌｙｃａｎｆｒｏｍｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｂｙｕｓｉｎｇＰＮＧａｓｅＦꎬａｓｅｒｉｅｓｏｆｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓꎬｉｎｃｌｕｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒｐＨꎬｅｎｚｙｍｅｔｙｐｅꎬｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓꎬｄｅｇｒｅｅｏｆｅｎｚｙｍａｔｉｃｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓꎬｄｅｎａｔｕｒｉｎｇｂｕｆｆｅｒｓｏｌｕｔｉｏｎａｎｄｅｎｚｙｍｅｄｏｓａｇｅｗｅｒｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄｂｙｕｓｉｎｇｓｅｖｅｒａｌｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ.Ｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔꎬｂｕｆｆｅｒｅｘｃｈａｎｇｉｎｇｉｎｔｏ１ˑＰＢＳｃｏｕｌｄａｖｏｉｄｔｈｅｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎｏｆｓｏｍｅｍＡｂｓｆｒｏｍＧ０ＦｔｏＧ０Ｆ￣ＧＮａｔｌｏｗｐＨａｎｄｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｐｅａｋｓｈａｐｅ.ＲａｐｉｄＰＮＧａｓｅＦａｎｄｄｅｎａｔｕｒｅｂｕｆｆｅｒｃｏｕｌｄｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆｅｎｚｙｍａｔｉｃｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ.ＣｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｏｆＵＰＬＣａｎｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃｃｏｌｕｍｎｗｉｔｈ１.７μｍｐａｒｔｉｃｌｅｓｉｚｅｃｏｕｌｄｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ.ＩｎｃｏｍｐｌｅｔｅｅｎｚｙｍａｔｉｃｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｃｏｕｌｄａｆｆｅｃｔｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆＮ￣ｇｌｙｃａｎｃｏｎｔｅｎｔ.ＲｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄｈｙｄｒｏｌｙｚｉｎｇｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆＰＮＧａｓｅＦｃａｎｑｕｉｃｋｌｙａｎｄｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙｈｙｄｒｏｌｙｚｅｔｈｅＮ￣ｇｌｙｃａｎｆｒｏｍｔｈｅｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙꎬｗｈｉｃｈｃａｎｐｒｏｖｉｄｅａｎｅｆｆｅｃｔｉｖｅｍｅｔｈｏｄｆｏｒｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇＮ￣ｇｌｙｃａｎｃｏｎｔｅｎｔｉｎｃｅｌｌｌｉｎｅｓｃｒｅｅｎｉｎｇａｎｄｑｕａｌｉｔｙｃｏｎｔｒｏｌｏｆｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｄｒｕｇｓ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙꎻＮ￣ｇｌｙｃａｎꎻｐｅｐｔｉｄｅＮｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅＦ(ＰＮＧａｓｅＦ)㊀㊀Ｎ糖基化修饰是单克隆抗体药物普遍存在的翻译后修饰现象ꎮ目前研究表明ꎬ糖基化修饰与单克隆抗体药物的功能㊁药物代谢㊁免疫原性等关系密切[１￣３]ꎬ如核心岩藻糖缺失能显著增强ＡＤＣＣ效应[４]ꎬ半乳糖能够增强ＣＤＣ活性[５]ꎻ末端Ｎ￣乙酰葡萄糖影响抗体药物半衰期[６￣７]ꎻ唾液酸化糖型具有抗炎症功能[８]ꎻα(１￣３)半乳糖和ＮＧＮＡ型唾液酸易引起免疫原性[９]等ꎮＮ糖对抗体结构也具有重要作用ꎬ能稳定ＣＨ２结构域ꎬ去糖抗体稳定性会变差ꎬ更易发生去折叠和聚集[１０]ꎮＮ糖类型和含量受细胞株㊁培养条件㊁纯化和储存[１１￣１３]等过程的影响ꎬ因此在单抗药物细胞筛选㊁工艺优化㊁纯化㊁产品放行和稳定性考察中控制和监测Ｎ糖含量ꎬ保证单抗药物安全性㊁有效性等尤为重要ꎮ目前检测Ｎ糖的方法主要有亲水色谱－荧光法[１４]㊁ＣＥ￣ＬＩＦ法[１５￣１６]和质谱法[１７￣１８]. All Rights Reserved.等ꎮ其中亲水色谱－荧光法是目前应用最为广泛的方法ꎬ该方法通常需要用糖苷酶水解糖蛋白上的Ｎ糖链ꎬ再用标记试剂进行衍生化ꎬ采用亲水色谱柱分离ꎬ荧光检测器检测ꎮ由于ＰＮＧａｓｅＦ几乎能水解所有哺乳动物细胞产生的Ｎ糖ꎬ因此得到广泛应用[１９]ꎮ传统的Ｎ糖谱检测方法一般耗时较长ꎬ目前快速Ｎ糖样品制备的试剂盒已经商品化ꎬ大幅提高了Ｎ糖的检测效率ꎬ但是通常价格昂贵ꎮ而应用快速ＰＮＧａｓｅＦ酶与传统制备过程相组合成为提高检测效率和降低检测成本的一种选择ꎮ本研究基于亲水色谱－荧光法ꎬ针对ＰＮＧａｓｅＦ水解条件进行了优化ꎬ发现和解决了酶解过程中易对结果产生影响的一些因素ꎬ建立了高效准确的Ｎ糖检测方法ꎬ以期为Ｎ糖的检测研究提供参考ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀实验材料１.１.１㊀供试品㊀本研究所用ｍＡｂ１㊁ｍＡｂ２和ｍＡｂ２￣Ｆ均为宝船生物医药科技(上海)有限公司生产的ＩｇＧ１型单克隆抗体ꎮ１.１.２㊀试剂和耗材㊀Ｎ糖苷酶Ｆ(ＰＮＧａｓｅＦ)㊁快速ＰＮＧａｓｅＦ酶(ｒａｐｉｄＰＮＧａｓｅＦ)及变性缓冲液(５ˑ)均购自ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ公司ꎻ无水乙醇㊁甲酸铵㊁乙酸㊁二甲基亚砜(ＤＭＳＯ)㊁２￣氨基苯甲酰胺(２￣ＡＢ)㊁氰基硼氢化钠㊁β￣巯基乙醇等均购自Ｓｉｇｍａ公司ꎻ甲酸和乙腈购自Ｆｉｓｈｅｒ公司ꎻＰＢＳＢｕｆｆｅｒ(１ˑ)购自上海生工ꎻ１０ｋＤ超滤离心管购自Ｍｅｒｃｋ公司ꎻ１００ｍｍｏｌ Ｌ－１Ｔｒｉｓ￣ＨＣｌ(含１％ＳＤＳꎬｐＨ９.０)溶液和非涂层－熔融石英毛细管购自Ｂｅｃｋｍａｎ公司ꎻ纯化柱(ＧｌｙｃｏＣｌｅａｎＴＭＳＣａｒｔｒｉｄｇｅｓ)购自Ｐｒｏｚｙｍｅ公司ꎻ色谱柱ＡＣＱＵＩＴＹＵＰＬＣＧｌｙｃａｎＢＥＨＡｍｉｄｅＣｏｌｕｍｎ(１.７μｍꎬ２.１ｍｍˑ１５０ｍｍ)购自Ｗａｔｅｒｓ公司ꎻ色谱柱ＡｄｖａｎｃｅＢｉｏＧｌｙｃａｎＭａｐｐｉｎｇＣｏｌｕｍｎ(２.７μｍꎬ４.６ｍｍˑ１５０ｍｍ)购自Ａｇｉｌｅｎｔ公司ꎮ１.１.３㊀主要仪器设备㊀高效液相系统(ＨＰＬＣꎬ１２６０)购自Ａｇｉｌｅｎｔ公司ꎻ超高效液相系统(ＵＰＬＣꎬＨ￣ＣｌａｓｓＰｌｕｓ)购自美国Ｗａｔｅｒｓ公司ꎻ液质联用系统(ＬＣ￣ＭＳꎬＱＥｘａｃｔｉｖｅ)和数据处理软件(ＢｉｏｐｈａｒｍａＦｉｎｄｅｒ)均购自美国Ｔｈｅｒｍｏ公司ꎻ毛细管电泳仪(ＣＥꎬＰＡ８００Ｐｌｕｓ)购自Ｂｅｃｋｍａｎ公司ꎻ真空离心浓缩干燥仪(ＲＶＣ２￣２５)购自德国Ｃｈｒｉｓｔ公司ꎮ１.２㊀实验方法１.２.１㊀蛋白沉淀和Ｎ糖衍生化㊀向酶解后的样品中加入３倍体积的冰乙醇ꎬ－１５~－２５ħ放置约１ｈꎬ高速离心１０ｍｉｎꎬ取上清干燥ꎮ加入１０μＬ２￣ＡＢ衍生化试剂ꎬ６５ħ避光孵育３ｈꎮ用纯化柱纯化后干燥ꎬ５０％乙腈复溶ꎬ准备上机分析ꎮ１.２.２㊀ＨＰＬＣ色谱条件㊀仪器采用高效液相系统(Ａｇｉｌｅｎｔꎬ１２６０)ꎻ色谱柱采用ＡｄｖａｎｃｅＢｉｏＧｌｙｃａｎＭａｐｐｉｎｇＣｏｌｕｍｎꎻ流动相Ａ为１００ｍｍｏｌ Ｌ－１甲酸铵(ｐＨ４.５)ꎬ流动相Ｂ为１００％乙腈ꎻ进样量２μＬꎻ流速０.５ｍＬ ｍｉｎ－１ꎻ荧光检测器激发波长２６０ｎｍꎬ发射波长４３０ｎｍꎻ色谱柱温度５５ħꎻ梯度洗脱ꎮ１.２.３㊀ＵＰＬＣ色谱条件㊀仪器采用超高效液相系统(ＷａｔｅｒｓꎬＨ￣ｃｌａｓｓｐｌｕｓ)ꎬ色谱柱采用ＡＣＱＵＩＴＹＵＰＬＣＧｌｙｃａｎＢＥＨＡｍｉｄｅＣｏｌｕｍｎꎮ流动相Ａ为１００ｍｍｏｌ Ｌ－１甲酸铵(ｐＨ４.５)ꎬ流动相Ｂ为１００％乙腈ꎬ进样量２μＬꎬ流速０.５ｍＬ ｍｉｎ－１ꎬ荧光检测器激发波长３３０ｎｍꎬ发射波长４２０ｎｍꎬ色谱柱温度６０ħꎬ梯度洗脱ꎮ１.２.４㊀质谱参数㊀应用液质联用系统(ＬＣ￣ＭＳꎬＱＥｘａｃｔｉｖｅ)的ＨＥＳＩ正离子模式(ＨＥＳＩ＋)ꎬ离子源的温度和电压分别为３２０ħ和３.８ｋＶꎬ离子传输管温度为２００ħꎬ其他仪器参数设置均经过优化以获得最佳信号响应ꎻ母离子扫描范围７００~３０００ｍ ｚ－１ꎬ分离度１５０００ꎬ分析时长６０ｍｉｎꎻ数据处理软件采用ＢｉｏｐｈａｒｍａＦｉｎｄｅｒꎮ１.２.５㊀还原毛细管凝胶电泳(ＲＣＥ￣ＳＤＳ)㊀将蛋白沉淀用１００ｍｍｏｌ Ｌ－１Ｔｒｉｓ￣ＨＣｌ(含１％ＳＤＳꎬｐＨ９.０)溶液复溶ꎬ加入β￣巯基乙醇还原ꎮ仪器采用毛细管电泳仪(ＢｅｃｋｍａｎꎬＰＡ８００ｐｌｕｓ)ꎬ毛细管采用非涂层－熔融石英毛细管ꎬＰＤＡ检测器ꎬ波长２２０ｎｍꎬ电动进样(－５ｋＶ)２０ｓꎬ电压分离(－１５ｋＶ)４０ｍｉｎꎮ２㊀结果与分析２.１㊀缓冲液ｐＨ对结果的影响分别将ｍＡｂ１和ｍＡｂ２样品调ｐＨ至４㊁５㊁６和７ꎬ取２００μｇ进行ＰＮＧａｓｅＦ酶解２４ｈꎬ检测Ｎ糖含量ꎮ实验结果如表１和图１所示ꎬｍＡｂ２在不５１２张博慧ꎬ等:利用Ｎ糖苷酶Ｆ对单克隆抗体Ｎ糖酶解条件的优化. All Rights Reserved.同ｐＨ缓冲液酶解的Ｎ糖含量高度一致ꎬ说明ｐＨ对该样品Ｎ糖水解无影响ꎻ而ｍＡｂ１中Ｎ糖含量随ｐＨ的变化出现明显差异ꎬ其中缓冲液ｐＨ为４时ꎬ峰２(ｐ２)含量出现大幅度升高ꎬ相应的峰３(ｐ３)含量明显下降ꎬｐＨ６和７条件下Ｎ糖含量基本一致ꎮ表１㊀ｍＡｂ１和ｍＡｂ２在不同ｐＨ缓冲液中酶解的Ｎ糖含量Ｔａｂｌｅ１㊀Ｎ￣ｇｌｙｃａｎｃｏｎｔｅｎｔｏｆｍＡｂ１ａｎｄｍＡｂ２ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐＨｂｕｆｆｅｒ样品名称ｐＨＮ糖含量/％ｐ１ｐ２ｐ３ｐ４ｐ５ｐ６ｐ７ｍＡｂ１４２.０２３.４５７.６６.２３.４１.６０.４５３.７４.２７６.６５.１４.２２.２０.４６３.９１.３７９.８４.８４.３２.２０.４７３.９１.０８０.２４.７４.４２.３０.４ｍＡｂ２４/７.４４６.０５.３２４.１８.２４.８５/７.６４５.８５.４２３.９８.２４.８６/７.６４５.７５.４２４.０８.２４.９７/７.４４５.７５.４２４.０８.２４.９图１㊀ｍＡｂ１和ｍＡｂ２在不同ｐＨ缓冲液中酶解的Ｎ糖色谱图Ｆｉｇ.１㊀Ｎ￣ｇｌｙｃａｎｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｏｆｍＡｂ１ａｎｄｍＡｂ２ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐＨｂｕｆｆｅｒ６１２生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.㊀㊀将ｍＡｂ１不同ｐＨ酶解后的蛋白进行还原ＣＥ￣ＳＤＳ检测ꎬ结果(图２)显示含Ｎ糖重链(ＨＣ)基本已被酶解成非糖基化重链(ＮＧＨＣ)ꎬ说明不同ｐＨ缓冲液下ＰＮＧａｓｅＦ酶解Ｎ糖２４ｈ后均酶解完全ꎬＮ糖含量的变化并非不完全酶解造成ꎮ利用液质联用鉴定各Ｎ糖的种类ꎬｐ２和ｐ３分别为Ｇ０Ｆ￣ＧＮ(Ａ１Ｆ)和Ｇ０Ｆ(Ａ２Ｆ)ꎮ通过比较不同时间(１㊁８和２４ｈ)酶解结果(表２)ꎬ发现缓冲液ｐＨ为４和５时ꎬｐ２和ｐ３含量的变化随着酶解时间的增加而呈梯度变化ꎬｐＨ４时尤为明显ꎻｐＨ为６和７时ꎬ变化不明显ꎮ因此推测在某些单抗分子上ꎬＧ０Ｆ上的Ｎ￣乙酰氨基葡萄糖在低ｐＨ条件下易从Ｎ糖链上脱落ꎬ使Ｇ０Ｆ形成Ｇ０Ｆ￣ＧＮꎬ从而引起Ｇ０Ｆ￣ＧＮ和Ｇ０Ｆ含量的变化ꎮ因此在进行ＰＮＧａｓｅＦ酶解时ꎬ应避免酶解体系中ｐＨ过低ꎮ图２㊀ｍＡｂ１不同ｐＨ酶解蛋白ＲＣＥ￣ＳＤＳ电泳图Ｆｉｇ.２㊀ＲｅｄｕｃｅｄＣＥ￣ＳＤＳｏｆｄｅｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｆｒｏｍｍＡｂ１ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐＨｂｕｆｆｅｒ表２㊀ｍＡｂ１在不同ｐＨ缓冲液中酶解不同时间的Ｎ糖含量Ｔａｂｌｅ２㊀Ｎ￣ｇｌｙｃａｎｃｏｎｔｅｎｔｏｆｍＡｂ１ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐＨｂｕｆｆｅｒａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｉｍｅｓｐＨ时间/ｈＮ糖含量/％ｐ１ｐ２ｐ３ｐ４ｐ５ｐ６ｐ７Ｍａｎ４Ｇ０Ｆ￣ＧＮＧ０ＦＭａｎ５Ｇ１ＦａＧ１ＦｂＧ２Ｆ４１９.３１.０７０.７８.０４.５１.９０.８８３.４７.３７３.０５.８４.３２.００.４２４２.０２３.４５７.６６.２３.４１.６０.４５１４.５０.８７８.６６.０４.６２.２０.４８３.８２.３７８.５５.２４.４２.３０.４２４３.７４.２７６.６５.１４.２２.２０.４６１４.５０.７７９.１５.７４.５２.２０.４８３.９１.０８０.４４.９４.４２.４０.３２４３.９１.３７９.８４.８４.３２.２０.４７１４.４０.７７９.７５.４４.５２.２０.４８３.９０.８８０.４４.８４.４２.４０.３２４３.９１.０８０.２４.７４.４２.３０.４７１２张博慧ꎬ等:利用Ｎ糖苷酶Ｆ对单克隆抗体Ｎ糖酶解条件的优化. All Rights Reserved.２.２㊀置换缓冲液的选择为避免样品缓冲液ｐＨ及成分对ＰＮＧａｓｅＦ酶解的影响ꎬ用超滤离心管将样品换液至合适的溶液中再进行ＰＮＧａｓｅＦ酶解ꎮ本研究选择了１ˑＰＢＳ溶液(ｐＨ７.４)和超纯水分别置换ｍＡｂ１和ｍＡｂ２的样品缓冲液ꎬ以未置换缓冲液(ｐＨ７)为对照ꎬＰＮＧａｓｅＦ酶解２４ｈꎬ进行Ｎ糖谱检测ꎮＮ糖色谱图和含量分别见表３和图３ꎬ结果表明１ˑＰＢＳ溶液㊁超纯水和样品缓冲液(ｐＨ７)的Ｎ糖谱结果一致ꎮ因为蛋白在超纯水中稳定性较差ꎬ所以本研究选用１ˑＰＢＳ溶液(ｐＨ７.４)置换样品的缓冲液ꎮ表３㊀ｍＡｂ１和ｍＡｂ２在样品缓冲液㊁１ˑＰＢＳ和超纯水中的Ｎ糖含量Ｔａｂｌｅ３㊀Ｎ￣ｇｌｙｃａｎｃｏｎｔｅｎｔｏｆｍＡｂ１ａｎｄｍＡｂ２ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄｉｎｓａｍｐｌｅｂｕｆｆｅｒꎬ１ˑＰＢＳａｎｄｗａｔｅｒ样品名称缓冲液Ｎ糖含量/％ｐ１ｐ２ｐ３ｐ４ｐ５ｐ６ｐ７ｍＡｂ１样品缓冲液(ｐＨ７)３.９１.０８０.２４.７４.４２.３０.４１ˑＰＢＳ３.９０.８８０.４４.８４.４２.４０.３超纯水３.９１.０８０.４４.９４.４２.４０.３ｍＡｂ２样品缓冲液(ｐＨ７)/７.４４５.７５.４２４.０８.２４.９１ˑＰＢＳ/７.６４５.９５.４２４.０８.２４.８超纯水/７.７４５.８５.４２４.０８.２４.８图３㊀ｍＡｂ１和ｍＡｂ２在样品缓冲液㊁１ˑＰＢＳ和超纯水中的Ｎ糖色谱图Ｆｉｇ.３㊀Ｎ￣ｇｌｙｃａｎｐｒｏｆｉｌｅｓｏｆｍＡｂ１ａｎｄｍＡｂ２ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄｉｎｓａｍｐｌｅｂｕｆｆｅｒꎬ１ˑＰＢＳａｎｄｗａｔｅｒ２.３㊀不同ＰＮＧａｓｅＦ酶对Ｎ糖结果的影响直接取２００μｇ样品ꎬ分别加入快速ＰＮＧａｓｅＦ酶(ｒａｐｉｄＰＮＧａｓｅＦ)和ＰＮＧａｓｅＦ进行酶解ꎬＮ糖谱如图４所示ꎮ结果显示用ｒａｐｉｄＰＮＧａｓｅＦ进行酶解时ꎬ若选择用ＵＰＬＣ和１.７μｍ粒径的ＡＣＱＵＩＴＹＵＰＬＣＧｌｙｃａｎＢＥＨＡｍｉｄｅＣｏｌｕｍｎ色谱柱ꎬ则由于分离度的提高ꎬｍＡｂ２的Ｎ糖色谱图(图４Ｂ)中Ｇ０Ｆ和Ｇ１Ｆａ出现肩峰ꎬ而ＨＰＬＣ结果８１２生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.Ａ:ｍＡｂ２未置换缓冲液ＨＰＬＣ检测ꎻＢ:ｍＡｂ２未置换缓冲液ＵＰＬＣ检测ꎻＣ:ｍＡｂ２置换缓冲液ＵＰＬＣ检测ꎮ图４㊀不同ＰＮＧａｓｅＦ的Ｎ糖谱结果Ｆｉｇ.４㊀Ｎ￣ｇｌｙｃａｎｐｒｏｆｉｌｅｓｏｆｍＡｂ２ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄｂｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔＰＮＧａｓｅＦ(图４Ａ)由于分离度较差ꎬ此峰未得到有效分离ꎮ当将ｍＡｂ２样品缓冲液置换至１ˑＰＢＳ中时(图４Ｃ)ꎬ该肩峰消失ꎮ综合２.１~２.３部分的研究结果可知ꎬ将样品置换缓冲液至合适的溶液中再进行ＰＮＧａｓｅＦ酶解ꎬ对改善Ｎ糖谱峰形和结果准确度至关重要ꎬ本研究采用了１ˑＰＢＳ溶液ꎬ效果良好ꎮ另外ꎬ在置换缓冲液的基础上使用快速ＰＮＧａｓｅＦ能将酶解时间缩短为数十分钟ꎬ有效提高了检测效率ꎮ选择ＵＰＬＣ能有效提高分辨率ꎮ２.４㊀蛋白变性对酶解效率的影响本研究发现ꎬ在非变性条件下利用快速ＰＮＧａｓｅＦ酶解不同单抗所需酶解时间差异明显ꎬ从数分钟至数小时不等ꎮ为了有效提高酶解效率ꎬ选择所需酶解时间最长的ｍＡｂ２￣Ｆ置换缓冲液至１ˑＰＢＳ中ꎬ加入变性缓冲液(５ˑ)和１μＬｒａｐｉｄＰＮＧａｓｅＦ酶ꎬ５０ħ孵育１０ｍｉｎ后进行Ｎ糖谱检测处理ꎬ将沉淀的蛋白进行还原ＣＥ￣ＳＤＳ检测ꎬ以未加变性缓冲液(５ˑ)样品为对照ꎮ由图５还原ＣＥ￣ＳＤＳ结果可知ꎬ相同的酶解时间条件下ꎬ蛋白变性后由于高级结构被破坏ꎬＮ糖充分暴露与酶接触ꎬ所以其酶解效果更好ꎮ２.５㊀酶解程度对Ｎ糖结果的影响在非变性条件下加入不同体积的ｒａｐｉｄＰＮＧａｓｅＦ酶对ｍＡｂ２￣Ｆ进行Ｎ糖谱检测处理ꎬ将沉淀的蛋白进行还原ＣＥ￣ＳＤＳ检测ꎬ以加入变性缓冲液(５ˑ)和１μＬｒａｐｉｄＰＮＧａｓｅＦ酶的样品为对照ꎬ酶解条件均选择５０ħ㊁１０ｍｉｎꎮ由图６(左)９１２张博慧ꎬ等:利用Ｎ糖苷酶Ｆ对单克隆抗体Ｎ糖酶解条件的优化. All Rights Reserved.可知ꎬ在非变性条件下酶解相同时间ꎬ酶量的增加使非糖基化组分增多ꎬ但酶量增加至２μＬ时酶解效果仍较差ꎬ而变性条件下用１μＬｒａｐｉｄＰＮＧａｓｅＦ酶解ꎬ糖基化组分基本被转换成非糖基化组分ꎮＮ糖水解的程度不同ꎬＮ糖含量(表４)明显成梯度变化ꎬ说明ＰＮＧａｓｅＦ对不同类型的Ｎ糖水解效率不同ꎬ因此为了获得样品中真实的Ｎ糖含量水平ꎬ应将Ｎ糖尽量酶解完全ꎮ图５㊀ｍＡｂ２￣Ｆ在变性和非变性条件下切糖后还原ＣＥ￣ＳＤＳ图谱Ｆｉｇ.５㊀ＲＣＥ￣ＳＤＳｐｒｏｆｉｌｅｓｏｆｍＡｂ２￣Ｆｄｅｇｌｙｃａｔｅｄｉｎｎａｔｕｒｅａｎｄｄｅｎａｔｕｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ表４㊀不同体积ｒａｐｉｄＰＮＧａｓｅＦ酶解ｍＡｂ２￣Ｆ的Ｎ糖含量Ｔａｂｌｅ４㊀Ｎ￣ｇｌｙｃａｎｃｏｎｔｅｎｔｏｆｍＡｂ２￣ＦｄｅｇｌｙｃａｔｅｄｂｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｒａｐｉｄＰＮＧａｓｅＦａｍｏｕｎｔＲａｐｉｄＰＮＧａｓｅＦ/μＬＮ糖含量/％Ｇ０Ｍａｎ５Ｇ１ａＧ１ｂＧ２０.５４３.４１８.４１８.４５.５２.６１.０４８.０１２.９２０.１６.４２.９２.０５４.５７.９２１.２７.３３.１１＋变性５５.２７.５２０.０８.０３.１３㊀讨论Ｎ糖检测结果的准确性受多种因素的影响ꎮ在缓冲液ｐＨ对ＰＮＧａｓｅＦ酶解的影响研究中发现ꎬ低ｐＨ能使某些单抗在酶解过程中Ｇ０Ｆ逐渐转化为Ｇ０Ｆ￣ＧＮꎬ造成检测结果的严重偏差ꎬ这种情况通常出现在ＰｒｏｔｅｉｎＡ亲和纯化后的样本ꎬ在低ｐＨ洗脱后直接进行酶解ꎬ若先将样品缓冲液ｐＨ调至中性或进行换液处理ꎬ能够避免ｐＨ的影响ꎮ对照ｍＡｂ２置换和未置换样品缓冲液酶解结果ꎬ置换缓冲液能有效消除Ｇ０Ｆ和Ｇ１Ｆａ的肩峰ꎬ消除样品缓冲液成分对检测结果的影响ꎮ另外ꎬ本研究对多种单抗的研究发现ꎬ酶解程度不同的Ｎ糖检测结果存在明显差异ꎬ说明Ｎ糖苷酶Ｆ对不同类型的Ｎ糖水解效率不同ꎬ这与已有文献报道[２０]一致ꎮ因此为了获得样品中真实的Ｎ糖含量水平ꎬ应将Ｎ糖尽量酶解完全ꎮ酶解程度可采用将蛋白沉淀进行还原ＣＥ￣ＳＤＳ检测ꎬ观察非糖基化组分含量的变化情况ꎮ在细胞株筛选和工艺优化阶段ꎬ快速㊁准确的Ｎ糖检测结果能够有效推进开发进度ꎬ而该阶段０２２生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.图６㊀不同体积ｒａｐｉｄＰＮＧａｓｅＦ酶解ｍＡｂ２￣Ｆ的ＲＣＥ￣ＳＤＳ和Ｎ糖谱图Ｆｉｇ.６㊀Ｎ￣ｇｌｙｃａｎａｎｄＲＣＥ￣ＳＤＳｐｒｏｆｉｌｅｓｏｆｍＡｂ２￣ＦｄｅｇｌｙｃａｔｅｄｂｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｒａｐｉｄＰＮＧａｓｅＦａｍｏｕｎｔ巨大的样本量又对成本控制提出更高的要求ꎬ因此建立一种高效㊁准确且低成本的Ｎ糖检测方法尤为重要ꎮ本研究确定了较为通用的ＰＮＧａｓｅＦ酶对单克隆抗体的酶解条件ꎬ即为将样品置换缓冲液至１ˑＰＢＳꎬ取适量样品加入变性缓冲液(５ˑ)和１μＬＲａｐｉｄＰＮＧａｓｅＦ酶ꎬ５０ħ孵育１０ｍｉｎꎬ进行后续除蛋白㊁干燥等处理ꎬ快速ＰＮＧａｓｅＦ酶和变性处理的应用ꎬ将酶解时间大幅缩短ꎬ提高了检测效率ꎻ同时采用传统的ＵＰＬＣ和ＡＣＱＵＩＴＹＵＰＬＣＧｌｙｃａｎＢＥＨＡｍｉｄｅＣｏｌｕｍｎ色谱柱ꎬ有效提高了分离度ꎬ并控制了检测成本ꎮ参㊀考㊀文㊀献[１]㊀ＦＲＩＥＳＳＷꎬＳＥＩＤＬＡꎬＳＯＥＲＧＥＬＦꎬｅｔａｌ..Ｎ￣ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙａｎｄｔｈｅｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅꎬｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄｐｈａｒ￣ｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓｏｆｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｎｄＦｃｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｓ[Ｊ].Ｅｕｒ.Ｊ.Ｐｈａｒｍ.Ｂｉｏｐｈａｒｍ.ꎬ２０１６ꎬ１００:９４－１００. [２]㊀刘晓宇.单克隆抗体糖基化修饰的研究现状和进展[Ｊ].中国生物制品学杂志ꎬ２０２０ꎬ３３(２):２１６－２２１. [３]㊀ＬＩＵＬ.Ａｎｔｉｂｏｄｙｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎａｎｄｉｔｓｉｍｐａｃｔｏｎｔｈｅｐｈａｒｍａｃｏ￣ｋｉｎｅｔｉｃｓａｎｄｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓｏｆｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｎｄＦｃ￣ｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｓ[Ｊ].Ｊ.Ｐｈａｒｍ.Ｓｃｉ.ꎬ２０１５ꎬ１０４(６):１８６６－１８８４.[４]㊀ＳＨＩＥＬＤＳＲＬꎬＬＡＩＪꎬＫＥＣＫＲꎬｅｔａｌ..Ｌａｃｋｏｆｆｕｃｏｓｅｏｎｈｕ￣ｍａｎＩｇＧ１Ｎ￣ｌｉｎｋｅｄｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｉｍｐｒｏｖｅｓｂｉｎｄｉｎｇｔｏｈｕｍａｎＦｃｇａｍｍａＲＩＩＩａｎｄａｎｔｉｂｏｄｙ￣ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｃｅｌｌｕｌａｒｔｏｘｉｃｉｔｙ[Ｊ].Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.ꎬ２００２ꎬ２７７:２６７３３－２６７４０.[５]㊀ＢＯＹＤＰＮꎬＬＩＮＥＳＡＣꎬＰＡＴＥＬＡＫ.Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｔｈｅｒｅ￣ｍｏｖａｌｏｆｓｉａｌｉｃａｃｉｄꎬｇａｌａｃｔｏｓｅａｎｄｔｏｔａｌｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｏｎｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｌａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＣａｍｐａｔｈ￣１Ｈ[Ｊ].Ｍｏｌ.Ｉｍｍｕｎｏｌ.ꎬ１９９５ꎬ３２:１３１１－１３１８.[６]㊀ＪＯＮＥＳＡＪꎬＰＡＰＡＣＤＩꎬＣＨＩＮＥＨꎬｅｔａｌ..Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｃｌｅａｒ￣１２２张博慧ꎬ等:利用Ｎ糖苷酶Ｆ对单克隆抗体Ｎ糖酶解条件的优化. All Rights Reserved.ａｎｃｅｏｆｇｌｙｃｏｆｏｒｍｓｏｆａｃｏｍｐｌｅｘｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｃａｕｓｅｄｂｙｔｅｒｍｉｎａｌＮ￣ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅｉｓｓｉｍｉｌａｒｉｎｈｕｍａｎｓａｎｄｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓｍｏｎｋｅｙｓ[Ｊ].Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ２００７ꎬ１７:５２９－５４０.[７]㊀ＫＥＣＫＲꎬＮＡＹＡＫＮꎬＬＥＲＮＥＲＬꎬｅｔａｌ..ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｃｏｍｐｌｅｘｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｗｈｏｓｅｖａｒｉａｂｌｅｍｅｔａｂｏｌｉｃｃｌｅａｒａｎｃｅｉｎｈｕｍａｎｉｓｄｅｐｅｎｄｅｎｔｏｎｔｅｒｍｉｎａｌＮ￣ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅｃｏｎｔｅｎｔ[Ｊ].Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓꎬ２００８ꎬ３６:４９－６０.[８]㊀ＮＩＭＭＥＲＪＡＨＮＦꎬＲＡＶＥＴＣＨＪＶ.Ｔｈｅａｎｔｉ￣ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙａｃ￣ｔｉｖｉｔｙｏｆＩｇＧ:ｔｈｅｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓＩｇＧｐａｒａｄｏｘ[Ｊ].Ｊ.Ｅｘｐ.Ｍｅｄ.ꎬ２００７ꎬ２０４:１１－１５.[９]㊀王冲ꎬ郭怀祖.不同细胞系表达的抗ＥＧＦＲ单抗糖基化结构对比分析[Ｊ].生物工程学报ꎬ２０１７ꎬ３３(６):１０１８－１０２７. [１０]㊀ＺＨＥＮＧＫꎬＢＡＮＴＯＧＣꎬＢＡＹＥＲＲ.Ｔｈｅｉｍｐａｃｔｏｆｇｌｙｃｏｓｙｌａ￣ｔｉｏｎｏｎｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｎｄｓｔａｂｉｌｉｔｙ[Ｊ].ＭＡｂｓꎬ２０１１ꎬ３:５６８－５７６.[１１]㊀ＫＩＬＤＥＧＡＡＲＤＨＦꎬＦＡＮＹＺꎬＳＥＮＪＷꎬｅｔａｌ..Ｇｌｙｃｏｐｒｏｆｉｌ￣ｉｎｇｅｆｆｅｃｔｓｏｆｍｅｄｉａａｄｄｉｔｉｖｅｓｏｎＩｇＧｐｒｏｄｕｃｅｄｂｙＣＨＯｃｅｌｌｓｉｎｆｅｄ￣ｂａｔｃｈｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ[Ｊ].Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.Ｂｉｏｅｎｇｉｎ.ꎬ２０１６ꎬ１１３(２):３５９－３６６.[１２]㊀ＢＥＮＪＡＭＩＮＤꎬＮＥＨＡＭꎬＭＩＣＨＡＥＬＢ.Ａｌｏｗｒｅｄｏｘｐｏｔｅｎｔｉａｌａｆｆｅｃｔｓｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙａｓｓｅｍｂｌｙａｎｄｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｉｎｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅ[Ｊ].Ｊ.Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.ꎬ２０１７ꎬ２４６:７１－８０.[１３]㊀ＳＴＥＦＡＮＦꎬＪＯＥＲＧＨꎬＨＡＮＮＳ￣ＣＨＲＩＳＴＩＡＮＭ.Ｇｌｙｃａｔｉｏｎｄｕｒｉｎｇｓｔｏｒａｇｅａｎｄａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎｏｆｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｆｏｒｍｕ￣ｌａｔｉｏｎｓ[Ｊ].Ｅｕｒ.Ｊ.Ｐｈａｒｍ.Ｂｉｏｐｈａｒｍ.ꎬ２００８ꎬ７０:４２－５０. [１４]㊀丛宇婷ꎬ胡良海.单克隆抗体药物糖基化修饰分析研究进展[Ｊ].色谱ꎬ２０１６ꎬ３４(１２):１１８６－１１９１.[１５]㊀ＭＥＬＩＳＳＡＨꎬＹＡＮＧＷꎬＲＩＣＨＡＲＤＲ.ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＮ￣ｌｉｎｋｅｄｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｉｎａｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｐｒｏｄｕｃｅｄｉｎＮＳ０ｃｅｌｌｓｕｓｉｎｇｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｗｉｔｈｌａｓｅｒ￣ｉｎｄｕｃｅｄｆｌｕｏｒｅｓ￣ｃｅｎｃｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎ[Ｊ].Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓꎬ２０１３ꎬ６:３９３－４０６. [１６]㊀ＧＥＮＮＡＲＯＬＡꎬＳＡＬＡＳ￣ＳＯＬＡＮＯＯ.Ｏｎ￣ｌｉｎｅＣＥ￣ＬＩＦ￣ＭＳｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｆｏｒｔｈｅｄｉｒｅｃｔｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＮ￣ｌｉｎｋｅｄｇｌｙｃａｎｓｆｒｏｍｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ[Ｊ].Ａｎａｌｙｔ.Ｃｈｅｍ.ꎬ２００８ꎬ８０:３８３８－３８４５.[１７]㊀李媛ꎬ邱建华ꎬ陈家琪ꎬ等.液相色谱－质谱技术对利妥昔单抗及其类似药结构表征和相似性的研究[Ｊ].国际生物制品学杂志ꎬ２０１６ꎬ３９(３):１１６－１２１.[１８]㊀ＣＨＥＮＸꎬＦＬＹＮＮＧＣ.ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＮ￣ｇｌｙｃａｎｓｆｒｏｍｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎＧｂｙｏｎ￣ｌｉｎｅｒｅｖｅｒｓｅｄ￣ｐｈａｓｅｈｉｇｈ￣ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ/ｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ[Ｊ].Ａｎ￣ａｌｙｔ.Ｂｉｏｃｈｅｍ.ꎬ２００７ꎬ３７０:１４７－１６１.[１９]㊀ＴＡＲＥＮＴＩＮＯＡＬꎬＧÓＭＥＺＣＭꎬＰＬＵＭＭＥＲＴＨＪ.Ｄｅｇｌｙｃｏ￣ｓｙｌａｔｉｏｎｏｆａｓｐａｒａｇｉｎｅ￣ｌｉｎｋｅｄｇｌｙｃａｎｓｂｙｐｅｐｔｉｄｅ:Ｎ￣ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅＦ[Ｊ].Ｂｉｏ￣ｃｈｅｍｉｓｔｒｙꎬ１９８５ꎬ２４:４６６５－４６７１.[２０]㊀ＨＵＡＮＧＹＮꎬＲＯＮＯ.ＫｉｎｅｔｉｃｓｏｆＮ￣ｇｌｙｃａｎｒｅｌｅａｓｅｆｒｏｍｈｕｍａｎｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎＧ(ＩｇＧ)ｂｙＰＮＧａｓｅＦ:ａｌｌｇｌｙｃａｎｓａｒｅｎｏｔｃｒｅａｔｅｄｅｑｕａｌ[Ｊ].Ｊ.Ｂｉｏｍｏｌ.Ｔｅｃｈｎ.ꎬ２０１７ꎬ２８:１５０－１５７.２２２生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.。
浅谈人体外周血淋巴细胞染色体的制备2008年第2期6月出版食品工程F00DENGINEERINC浅谈人体外周血淋巴细胞染色体的制备Onthepreparationofchromosomeofperipheralbloodlymphocyteofhumanbody董烁谢振兴(河南大学医学院,开封475004)DONGShuo'XIEZhen—xing(MedicalSchool,HenanUniversity,Kaifeng475004,China)摘要染色体制备技术是医学遗传学中最常见而重要的一种技术,由于各个实验室实验条件和个人操作手法的差异,细胞培养和染色体标本的制作方法也不尽相同.笔者就人体外周血淋巴细胞染色体的制片过程中容易出现的问题及近几年制作染色体标本总结的经验和实验方法改进进行探讨,并提出了有效的避免方法.关键词染色体;染色体制备技术;外周血;细胞培养AbstractThepreparationofchromosomeisafrequent andanimportanttechniqueinmedicalgenetics.Some problemsexistedinexperimentwereanalysed.Improvingoftheexperiments,experiencesandprecautionsduring thepreparationofchromosomeofperipheralbloodlym—phocyteofhumanbodytheseyearswerethoroughlydis-cussed.Someeffectivemethodshavebeengiveninthispaper?keywordschromosome;preparationofchromo—some;peripheralblood;cellculture染色体是组成细胞核的基本物质,是基因的载体,他由DNA和蛋白质构成,具有储存和传递遗传信息的作用.人类细胞遗传学研究的主要对象是染色体.生物体细胞染色体数目和结构是重要的遗传标志之一,特别是在真核细胞中.因此深入认识染色体的结构和功能,对生物的遗传,变异和进化以及细胞的增殖,个体的发生和生殖过程的平衡控制都具有十分重要的意义.每个物种的细胞都具有一定的数目,形态,大小的染色体特征,称为染色体董烁,女,1976年出生,1999年毕业于河南师范大学,生物教育专业,助教.收稿日期:2008—03—19组型,各种染色体技术已广泛应用于核型,鉴别变异,体细胞杂交分析和绘制基因图等方面,因此在染色体的分析研究中,制备染色体标本无疑是细胞遗传学最基本而重要的技术,而优良的染色体制片是其他技术的先决条件.正常情况下,人外周血中是没有分裂相细胞的,只有在异常隋况下才能发现.外周血淋巴细胞一般隋况下处于增殖期中的GO(GD期,未经培养的外周血中很难找到正在分裂的淋巴细胞.植物血细胞凝集素(PHA)是人类淋巴细胞有丝分裂的刺激剂,在PHA作用下,能使处于GO期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞,进而进行有丝分裂.利用PHA这一特性,淋巴细胞经过含有PHA培养液培养,在体外便可获得丰富的含有丝分裂的生长活跃的细胞群体,再用秋水仙素处理,即可获得终止于分裂中期的淋巴细胞, 进而得到所需的人体染色体图片.加之,淋巴细胞遍及全身,并在所有器官组织中不断循环,能反映个体整体水平情况而不象体细胞那样具有局部性.1细胞培养1.1无污染环境培养环境无毒和无菌是保证细胞生存的首要条件,也是实验成功与否的先决条件.收获细胞前的所有步骤都要保持高度的无菌,严防细菌和病毒的污染.当细胞放置于体外培养时,与体内相比细胞丢失了对生物和有毒物的防御能力,一旦被污染或自身代谢物质积累等,可导致细胞死亡.1.2恒定的温度维持培养细胞旺盛生长,必须有恒定适宜的温度.人体细胞培养的标准温度为36.5±0.5oC,偏离这一温度范围,细胞的正常代谢会受到影响,甚至食品工程2008年第2期6月出版死亡.如果温度高于37℃,细胞的生长速度减慢;如果温度高于40℃,细胞受损,超过43℃,则导致细胞死亡.培养箱的温度应严格控制在37土0.5℃, 为了能精确有效的控温,在普通的隔水式恒温培养箱上可加装一个电子控温仪.若温度过高或过低,则会延缓分裂周期,造成收获时细胞分裂相减少.1.3气体环境气体是人体细胞培养生存必需条件之一,所需气体主要有0和CO.CO既是细胞代谢产物,也是细胞生长繁殖所需成分,他在细胞培养中的主要作用在于维持培养基的pH值.大多数细胞的适宜pH为7.2～7.4,培养基的pH值也应调整到7.2～7.4 之间,偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响. 偏酸时细胞发育不良,偏碱时细胞会出现轻度固缩. 细胞培养液pH的调节最常用的为加NaHCO的方法,因为NaHCO,可供CO,但CO易于逸出,故最适用于封闭培养.1.4培养液植物凝集素(PHA)是体外淋巴细胞培养成败的关键,只有在PHA的作用下才能进入有丝分裂, 因此要考虑他的质量和尝试,质量有问题药效会降低,浓度过高可能会导致红细胞凝集,都会造成实验效果差.2操作步骤2.1细胞接种接种就是将注射器中的血液注入到培养瓶中.将注射器针头刺人培养瓶的胶塞向培养液中加入0.4mL～0.5mL血液.细胞接种通常是在无菌室超净工作台内的酒精灯火焰区进行.接种时无菌操作是否规范,直接影响到细胞培养的成败.如接种时如不慎将手接触到培养瓶的瓶塞,或接触了注射器的针头,可能会造成细菌中霉菌的污染.接种时,加入血液量的多少也会对培养结果有影响,血液太少, 细胞稀薄,细胞生长速度减慢;血液太多,会造成培养时细胞生长时营养成分不够,影响细胞生存.接种操作是在酒精灯附近进行,接种时还应注意避免血液遇高温被破坏.操作时手与酒精灯的距离以火焰不烫手为宜,离火焰太近,血细胞可能被破坏,甚至被烧焦成块,肉眼可见呈团块;同时也会造成针头堵塞.出现这种情况,应及时更换针头.如已接种,应更换一瓶培养液.2.2秋水仙素适量的秋水仙素,适当的处理时机和时间,是获得足够数量的,良好细胞分裂相的条件.分裂相的多少和染色体形态及带型处理是否良好均受其影响. 秋水仙素是一种生物碱,干扰细胞中微管组装,抵制细胞纺缍体的形成,能使细胞分裂停止于分裂中期,以积累大量的中期细胞.其浓度范围较宽,可相差几十倍之多,常用质量浓度为8g/mL~0.5g/mL.一般秋水仙素溶液的浓度与处理时间有一定的关系, 如果在培养中,浓度过低或处理的时间过短,则标本中的分裂细胞就少,染色体瘦长;用量过多,浓度过高,虽能获得中期分裂相,但染色体缩短变粗,不利于核型分析和显带.只有浓度适量,才能确保获得中期分裂相,但染色体缩短变粗,不利于核型分析和显带.只有浓度适量,才能确保获得足够多的分裂相和长度收缩适度的染色体.另外,处理时间延长,染色体发生分离,同样使染色体变粗短,也不利于计数和分析.加秋水仙素的时间是收集细胞制备染色体前2h～3h,加入秋水仙素后,使秋水仙素的终质量浓度为0.04g/mL~0.08g/mL培养液.实验前应根据培养液的用量和秋水仙素的浓度计算出加入的剂量.通常采用的加秋水仙素的器具是容量为1mL的注射器,使用时也应注意控制好注射器活塞,避免推动时用力过猛,导致秋水仙素加入量过多.2.3收获细胞和制片收获细胞和制片包括收集细胞,低渗,固定,滴片染色等几个步骤,每一步操作失误都可能造成最后实验的失败,使玻片上观察不到染色体.2.3.1收集细胞此步骤操作不当,容易造成细胞丢失.培养瓶从恒温箱中取出时,大部分细胞都沉淀在瓶子的底部,在将培养瓶中液体吸入到离心管之前,应用吸管将细胞充分吹打均匀,再移人离心管中.离心之后,吸弃上清,也应小心操作,有时由于吸得过猛,将与上清液相接处的淋巴细胞层吸掉了,造成大量的分裂中期相细胞丢失.2.3.2低渗低渗处理是染色体制备中很重要的环节,是获得分散良好的分裂相的关键步骤,低渗时间和低渗温度都关系到制片的成功.低渗过度或不足都会造成染色体形态不良.在低渗处理时期细胞十分娇嫩,并且表面发黏,低渗细胞混匀时,吹打要适宜,避2008年第2期董烁,等:浅谈人体外周血淋巴细胞染色体的制备6月出版27免细胞破碎及粘团,另外不要将细胞吸到吸管上部及离心管上部,避免细胞丢失.通过对比实验认为采用0.075mol,LKC137cI=处理20min一25min较合适,效果较好.用0.075mol,LKC1溶液于处理中期细胞,使细胞核膨胀破裂,染色体分散良好,便于观察计数.当低渗处理时间过长时,细胞膜过早破裂,导致分裂细胞丢失,或染色体丢失;如果低渗处理时间不足时细胞膨胀不够,则染色体分散不好,染色体仍然成团或相互重叠,不利于进行观察,计数,分析.经过低渗处理的细胞因已膨胀,容易过早破裂,造成分裂细胞丢失,所以低渗后操作应特别注意不要用力冲吸.另外低渗还可使红细胞膜破裂,经离心后,血影浮于上清液中被去除.在观察制片结果时,如发现玻片上染色体有的张不开,有的呈现团状,有的数目不够,这是由于低渗时操作不当引起的.低渗不充分,染色体聚在一起;低渗过头,染色体丢失.低渗是否能达到目的,操作时要注意两个方面:一是要使细胞充分与低渗液接触.这就需要在加入低渗液后,要充分将细胞吹打均匀;二是要注意低渗时的温度和时间.2.3.3固定固定技术也是制备良好分散的染色体的重要步骤.低渗处理完后,需加入固定液,固定的目的是对染色体形态进行固定.若染色体分散不良,可适当加大冰乙酸含量,其同时有改善由于低渗处理不够或固定不充分所造成的缺陷,但过量会造成染色体形态变化和影响分带结果.染色体形态不良与加固定液速度有关,加第一次固定液快或过快,可造成飘带样染色体.固定液每次使用必须新鲜配制,否则将会形成酯类,从而影响固定效果.如果固定液不新鲜或甲醇,冰醋酸的质量不佳时,染色体形象模糊,染色体周围有胞浆背景,固定液为分析纯的甲醇和冰醋酸按3:1的体积比配制.预固定和固定时间:加固定液时,应沿管壁慢慢加入并轻轻吹打均匀,预固定和以后的二,三次固定时,固定液加入太快,混匀太快,会使固定作用过强,染色体扭转;固定作用若不足,染色体出现毛刷状.固定液纯度要高,临时配制,固定后再彻底打匀.吹打细胞时,用力要适度,如吹打过重, 会导致核型中染色体的丢失或变形.采用甲醇和冰醋酸按3:1体积比的固定液进行固定,将常用的第一次固定时间5min,30min改为25min,20min,适当延长时间,固定效果较理想.2.3.4滴片滴片是染色体制备中影响染色体形态的关键一步.首先是载玻片要非常干净,否则会影响染色体的分散和分带效果.滴片用的玻片应干净,无脂,无酸才行.其次是滴片的距离,滴加量多少,制片的方式都会影响染色体分散效果.如果冰片冷冻不够,细胞难以贴附而造成丢失.载玻片经过一系列处理擦干后,放置冰箱内,冰冻4h以上,即为冰片.滴片时现用现拿出,否则会融化,操作时采用0℃预冷的冰片滴片.滴片时导致实验失败的原因有以下几方面:①由于细胞悬液太稀,导致滴片时细胞稀少;②载玻片上水太多,导致细胞悬液顺着水流失;③载玻片不洁净,染色体分散不佳;④滴片后,应立即放入7OcI=的烤箱中,以利于细胞的进一步胀开. Giemsa染色液与pH的影响:染色液浓度高,染色时间应缩短,如果染色液浓度增高,染色时间又延长,染色体着色加深,形态结构不清,对裂隙, 染色体断裂的检出可能减少.pH偏碱,染色体着色发蓝,色泽不艳,pH稍酸,染色体呈玫瑰色,色调鲜艳,形态结构清晰,利于统计分析和畸变的检出.烤片是染色体制备中最后一步技术.烤片的温度,时间与染色体形态和分带有关.不宜温度过高和烤片时间过长.细胞培养和染色体制备实验从接种到制片长达76h,在整个实验过程中必须严谨,不能有任何差错.而且细胞培养实验不同于其他实验,步骤多,整体性强,操作要求严格认真,最终实验才会取得成功.总之,随着医学的发展及人们对遗传疾病的逐步认识,染色体制备技术现已是医学遗传学中最常见而重要的一种技术.作为一名技术人员,做出一张高质量的人体外周血淋巴细胞染色体标本是十分重要的,这样才能更好地为临床诊断及优生与遗传咨询工作服务.参考文献[1]左假.医学遗传学[M],北京:人民卫生出版社.2004:110-127.[2]周焕庚.人类染色体[M].北京:科学出版社.1987:85—86.[3]蔡绍京.细胞生物学与医学遗传实验指南[M].上海:第二军医大出版社,2002:47_48.。
t淋巴细胞的发育规律t淋巴细胞，这个名字听起来有点吓人，但其实它们在我们身体里扮演着超级英雄的角色，绝对不能小觑。
说到t淋巴细胞的发育，那可是个复杂又有趣的故事呢。
想象一下，小小的t细胞在我们身体里像小宝宝一样成长，从无到有，逐步成为能打击病菌的勇士。
它们的发源地是在胸腺，没错，就是那个你可能只在教科书上见过的地方。
胸腺就像是t细胞的幼儿园，孩子们在这里学习各种本领，经过严格的“训练”才能顺利毕业。
刚开始的时候，t细胞就像是一个个小萌娃，啥都不懂，只有一颗充满好奇的心。
在胸腺里，它们接受训练，学习如何识别敌人。
在这个过程中，t细胞经历了许多考验，有时候被“淘汰”，有时候则得到了“晋升”。
真的是“没有经历风雨，怎能见彩虹”啊！它们的每一次筛选都是为了确保，最终能留下的都是可以为身体保驾护航的强者。
想想看，这些小家伙们为了保护我们，可是拼尽了全力。
说到这里，可能有人会问，t细胞究竟是怎么长成“英雄”的呢？t细胞的发育主要分为几个阶段。
起初，它们在骨髓里“出生”，然后悄悄地游到胸腺。
在这里，t细胞们可真是“拼命三郎”，经历一系列复杂的训练课程。
在这些课程里，t细胞们学习如何识别身体的“朋友”和“敌人”，避免误伤。
毕竟，谁也不想成为“误伤”的那位啊，想想就有点心酸。
这个过程就像是参加一场大型选秀，t细胞们需要展示自己的能力。
它们要能够识别外来的入侵者，比如病毒和细菌。
训练的过程中，t细胞们会遇到“导师”——那些已经成熟的t细胞。
它们会给新手们提供指导，传授一些“生存技巧”。
在这个过程中，t细胞们不断尝试、不断进步，直至成为最终的“英雄战士”。
等到这些小家伙们终于完成了训练，胸腺会将它们送往身体的各个角落。
它们会分散到淋巴结、脾脏等地方，随时准备迎战。
当身体受到攻击时，t细胞们就会像是特种部队一样，立刻反应过来，冲上前去，发起猛烈的攻击。
就好像是一支无畏的军队，誓言保卫家园。
不过，有些t细胞并不是每一次都能如愿以偿。
第 50 卷第 2 期2024年 3 月吉林大学学报（医学版）Journal of Jilin University（Medicine Edition）Vol.50 No.2Mar.2024DOI：10.13481/j.1671‐587X.20240211基于剪接因子SRSF9在头颈部鳞状细胞癌中的表达及临床意义的生物信息学分析刘玉婷1, 喻莹1, 黎桂珍1, 史沁雪2, 李彬彬1（1. 广东医科大学基础医学院病理生理学教研室，广东东莞523808；2. 广东医科大学第二临床医学院，广东东莞523808）［摘要］目的目的：基于生物信息学方法分析富含丝氨酸/精氨酸的剪接因子9（SRSF9）在头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）中的表达情况、临床意义以及与肿瘤免疫浸润的关系，并探讨其作用机制。
方法：利用癌症基因图谱（TCGA）数据库、基因表达综合（GEO）数据库中GSE30784和GSE13601数据集、临床蛋白质组学肿瘤分析联盟（CPTAC）数据库、基因表达交互分析（GEPIA）数据库和Kaplan-Meier plotter数据库分析SRSF9在HNSCC中的表达及与患者临床病理特征和预后的关系；利用cBioPortal数据库分析SRSF9基因变异情况；应用ESTIMATE算法和肿瘤免疫估计资源（TIMER）数据库评估SRSF9表达与肿瘤微环境和肿瘤免疫细胞浸润的关系；利用LinkedOmics数据库分析SRSF9在HNSCC中的共表达基因及其调控通路；基于TCGA SpliceSeq数据库分析HNSCC 中SRSF9调控的可变剪接事件，并对靶基因进行基因本体（GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）信号通路富集分析。
结果：TCGA数据库、GEO数据库中GSE30784和GSE13601数据集分析，HNSCC组织中SRSF9 mRNA表达水平较癌旁正常组织明显升高（P<0.01）；CPTAC数据库分析，与正常组织比较，HNSCC组织中SRSF9蛋白表达水平明显升高（P<0.001）。
临床探索血清乳酸脱氢酶水平与多发性骨髓瘤患者预后的相关性分析董珂，胡桂芳，陆静峰，王云 （上海市普陀区中心医院血液科，上海 200062）摘要：目的：探究血清乳酸脱氢酶水平与多发性骨髓瘤患者预后的相关性。
方法：选取我院收治的80例多发性骨髓瘤患者为研究对象。
所有患者进行血清乳酸脱氢酶检测，并根据测定结果，将患者分为LED高值组（LDH＞245U/L）和LED低值组（LDH≤245U/L）组，分别为32例、48例。
分析多发性骨髓瘤患者与LDH水平的关系、相关独立不良风险因素及不同血清乳酸脱氢酶水平下患者的生存率情况。
结果：不同性别、年龄、免疫球蛋白分型患者的LDH水平比较无显著性统计学差异（P＞0.05）；不同分期、肿瘤体力评分（Eastern Cooperative Oncology Group, ECOG）和有无严重贫血患者的LDH 水平比较有显著性差异（P＜0.05）；多因素分析显示，ECOG评价（＞3分）、DS分期（III期）、严重贫血及LDH水平（＞245U/L）与多发性骨髓瘤患者预后相关，是预后不佳的危险因素（OR=1.276、0.024、0.022和0.012，P＜0.05）；在患者预后生存曲线图分析中，LDH＞245U/L（高值）患者的生存率明显低于LDH≤245U/L（低值）患者（P＜0.05）。
结论：血清LDH水平与多发性骨髓瘤进展及预后显著相关，是评估患者预后的重要指标。
关键词：乳酸脱氢酶；多发性骨髓瘤；预后；相关性多发性骨髓瘤是一种常见的恶性血液肿瘤疾病，对患者生命健康有巨大影响。
现有研究显示[1]，多发性骨髓瘤的发病机理是B细胞来源的浆细胞出现恶性增殖，导致单克隆免疫球蛋白大量形成，其发病率已占血液领域恶性肿瘤的10%以上。
在现有治疗技术之下，多发性骨髓瘤仍是一种难以治愈的恶性肿瘤，且有80%以上的患者预后不良。
有研究报道[2]，在多发性骨髓瘤的病情发展中，血清LDH起到重要作用，其表达水平与病情进展及预后有密切相关性，是预后评估的重要指标。
摘要：基于选择实验动物时的差异性原则，对豚鼠、大鼠和小鼠的脾脏、胸腺、淋巴组织的形态以及其石蜡切片进行比较研究，探讨免疫器官的差异，为免疫相关实验中实验动物的选择提供参考。
方法分别采集豚鼠、大鼠和小鼠的血液进行血常规及血液生理生化检测，采集脾脏、胸腺进行形态和切片观察比较。
观察血涂片可以看到豚鼠、大鼠和小鼠外周血液中免疫细胞有一定差别。
根据血常规和血液生理生化检测可见在部分指标差异极显著，部分指标差异显著。
器官外观以及石蜡切片分别有不同之处。
关键词：豚鼠；大鼠；小鼠；免疫器官；对比研究豚鼠、大鼠和小鼠免疫器官的对比研究宋春雷，俞磊，高文波，陈尚琛（江苏农林职业技术学院江苏镇江212400）收稿日期：2024-02-02基金项目：2020年江苏农林职业技术学院大学生创新创业训练计划项目：豚鼠与大鼠免疫器官的比较研究（202013103030Y ）。
作者简介：宋春雷（1979.11—），男，山东临沭人，博士，讲师，研究方向：免疫与畜禽疾病防治。
doi:10.3969/j.issn.1008-4754.2024.04.050现代生命科学领域的教学、生产、研究活动无法离开实验动物而展开，选择适当的实验动物对于实验来说至关重要。
而实验动物的选择一般都要遵守差异性原则，挑选合适的实验动物，必须遵守差异性原则[1]。
基于此原则，对豚鼠和小鼠的免疫器官进行比较研究，以期为免疫相关的研究选择实验动物时提供参考。
豚鼠血清中含有丰富的补体，免疫学实验中补体来源大多为豚鼠，且豚鼠致敏反应非常迅速，适合用于过敏反应的研究。
此外豚鼠相较于大鼠、小鼠最特殊的地方在于豚鼠和人类一样自身无法合成机体所需的维生素C ，必须通过食物获得。
大鼠的优点是便于获得也很容易获得杂交的亲代。
而小鼠对外界环境变化及外来刺激敏感，被广泛用于各种实验。
为探究三者之间的差异性，本研究采集豚鼠、大鼠与小鼠的脾脏、胸腺、淋巴结从形态特征等组织学特点入手进行比较。
T淋巴细胞的发生及演变摘要】T细胞从发生到成熟是一个极其复杂的过程，不仅形态结构在发生变化，还伴随有许多表面标志的表达或消失。
T细胞在胸腺内的分化无疑是整个发育过程中至关重要的阶段，而胸腺细胞的成熟过程实质上是一个选择过程,不符合要求的细胞如自身反应性细胞随时被淘汰，而正常分化的细胞则被保留下来。
最终发育成熟的T细胞除具有MHC限制性和对自身抗原的耐受性外，还具有识别多种非己抗原的能力，而TCR、分化抗原等膜表面分子则是其识别抗原并产生免疫应答的物质基础。
【关键词】T细胞；胸腺细胞；分化；选择【中图分类号】R744【文献标识码】B【文章编号】1005-0515(2011)06-0286-01T淋巴细胞(T lymphocyte)简称T细胞，是数量最多、功能最复杂的淋巴细胞群，也是适应性细胞免疫应答的执行者，并在TD-Ag诱导的体液免疫应答中发挥重要的辅助作用。
T细胞及其亚群历来是组织胚胎学、医学免疫学等生物科学领域的研究重点，成果显著，理论也较为丰富，但不能否认的是，各学科在相关内容的描述上往往不够统一，或者缺乏足够的知识关联，难免会给读者带来一些理解上的困难。
本文就T细胞的分化发育过程及其形态与表面标志变化进行归纳。
1T细胞的来源T细胞和B细胞一样，都是由多能造血干细胞(MHSC)发育分化而来。
MHSC首先分化为髓样祖细胞和淋巴样祖细胞，胚胎第7周时，淋巴样祖细胞定向发育成原T(pro-T)细胞(表型为CD410、CD3-、CD8+、CD25-、C-kit+、Lin-、TCRαβ-)，在胸腺血管形成之前，胸腺原基分泌的趋化因子即吸引循环血液中的原T细胞进入其内。
原T细胞先后来自卵黄囊、胎肝和骨髓，但进入胸腺的具体途径和机制还不完全清楚。
有人认为是经皮-髓质交界处的毛细血管后微静脉进入胸腺实质，有人则认为是随组织液从胸腺被膜进入实质的，从发生上来说，两种观点都具有阶段性意义。
原T细胞进入胸腺被膜下而未到达胸腺皮质之前，称前T(pre-T)细胞，当其进入胸腺皮质后即称为胸腺细胞。
阿片类毒品对人脑神经递质的影响
石笑春;杨征;梅磊;黄增明;赵定胜;郭庆玲;徐志明
【期刊名称】《毒理学杂志》
【年(卷),期】2001()z1
【摘要】吸食毒品,上瘾后是一种反复发作的脑病,其主要表现是病人对毒品强烈的心理渴求,导致复吸.大量的研究结果表明,这种精神心理活动,人与动物有着本质的区别.二氢阿托啡就足以证明,人的成瘾性远比动物明显得多.但至今尚未见到对毒品依赖分析的有关报道. ……
【总页数】1页(P80-80)
【作者】石笑春;杨征;梅磊;黄增明;赵定胜;郭庆玲;徐志明
【作者单位】航天医学工程研究所北京 100094 军事医学科学院307医院航天医学工程研究所北京 100094 航天医学工程研究所北京 100094 航天医学工程研究所北京 100094 军事医学科学院307医院军事医学科学院307医院
【正文语种】中文
【中图分类】R
【相关文献】
1.中枢神经递质在阿片类毒品成瘾中的作用 [J], 杨黎华
2.甲基苯丙胺类与阿片类毒品对男性性功能影响的比较研究 [J], 杨旺秋;申吉泓;刘孝东;陈剑珩;陈骋;高运弘;杨幸云;李学君
3.吸食阿片类毒品对 T淋巴细胞亚群的影响及与中医肾虚相关关系的研究 [J], 郭瑞林;赵宁侠;任秦有;周建歧;史恒军;侯颖
4.广西使用阿片类毒品的HIV感染者耐药情况及其影响因素分析 [J], 张毓;黄颉刚;黄春湲;梁浩;叶力;梁冰玉;蒋俊俊;陈荣凤;宁传艺;廖艳研
5.阿片类毒品成瘾者利用美沙酮维持治疗服务的影响因素分析 [J], 邢彦;孙江平;曹卫华;李立明;段松
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肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)制剂制备质量管理专家共识陈萌;王涛;初明;王星星;董兆惠;王铁山;严冬;金华君;隋礼丽;张立娜;孙晓男;黎春盈;奚晓鹏;周足力;张秀军【期刊名称】《中国医药导刊》【年(卷),期】2024(26)4【摘要】近年来,采用肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)进行过继性T细胞疗法(ACT)的新型免疫治疗方式备受关注。
TIL是从肿瘤组织中分离出的一种新型的抗肿瘤效应淋巴细胞,具有高效、特异、不良反应小等优点,临床应用潜在治疗价值巨大。
国内外已有多家企业布局TIL疗法:2024年,美国FDA加速批准了LN-144,用于治疗PD-1耐药的晚期黑色素瘤患者;国内暂无TIL疗法的上市产品。
鉴于TIL细胞的来源、类型、生产工艺等方面异质性较大,以及肿瘤组织的获取与运输要求、纯化TIL细胞获取方法、产品放行检测项目等有关TIL制剂生产安全性和质量方面的国家标准和行业标准均无统一规范,因此,制订针对性的TIL制剂制备标准对于全面保证TIL 细胞制剂质量的安全性、有效性和可控性具有积极意义。
为加强TIL制剂的质量控制,规范和指导TIL细胞制剂制备的质量管理,我院集合领域内众专家学者,参考国家免疫细胞治疗产品有关文件,结合TIL细胞特点,针对TIL制剂关键工艺步骤对质量控制要素和质量控制技术方法进行规定,特别编撰了《肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)制剂制备质量管理专家共识》,以期为国家制定TIL制剂制备管理相关政策提供借鉴和参考。
该共识明确了编制背景、TIL制剂生产术语、生产条件、质量控制要求、检测方法,重点阐述了肿瘤组织的采集和运输、TIL细胞的分离和纯化、TIL细胞的激活与扩增、TIL细胞制剂的放行等TIL制剂生产质量管理内容,适用于TIL制剂生产的质量控制。
【总页数】5页(P323-327)【作者】陈萌;王涛;初明;王星星;董兆惠;王铁山;严冬;金华君;隋礼丽;张立娜;孙晓男;黎春盈;奚晓鹏;周足力;张秀军【作者单位】中国标准化研究院;解放军总医院第五医学中心;北京大学基础医学院;国家卫生健康委员会医学免疫学重点实验室;北京循生免疫医学转化研究院;北京中医药大学;北京首都医科大学附属北京潞河医院;上海君赛生物科技有限公司;毕诺济(上海)生物技术有限公司;吉林中科生物工程股份有限公司;青岛华赛伯曼医学细胞生物有限公司;北京伯诺生物科技有限公司;北京戴纳魔方生物科技有限公司;北京大学人民医院【正文语种】中文【中图分类】R730【相关文献】1.AKT抑制剂对结直肠癌肝转移患者肿瘤浸润T淋巴细胞生物学活性的影响2.《中国肿瘤临床》文章推荐:免疫检查点抑制剂相关心肌炎监测与管理中国专家共识(2020版)3.《中国肿瘤临床》文章推荐:免疫检查点抑制剂相关心肌炎监测与管理中国专家共识(2020版)4.抗血管生成小分子酪氨酸激酶抑制剂在复发转移或晚期妇科肿瘤临床应用的中国专家共识(2022版)5.淋巴细胞亚群检测在血液肿瘤中应用的专家共识因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
