酶解法制备鲟鱼皮活性肽条件优化及抗氧化能力

鱼皮中生物活性肽的制备及性质研究的开题报告一、研究背景和意义鱼皮是渔业加工过程中的固废资源，当中含有大量蛋白质。

目前，鱼皮的处理主要是通过热水浸泡或酸碱处理，但这种方法存在一些问题，如热水浸泡不易控制浸泡时间和温度，处理后鱼皮中蛋白质的活性降低等。

因此，研究利用鱼皮制备生物活性肽，可以为鱼皮资源的开发和利用提供新思路和方法。

目前已有研究报道鱼皮中存在多种有生理活性的肽，如抗氧化肽、降压肽、抗菌肽等。

但是，鱼皮中生物活性肽的提取、纯化和鉴定方面的研究还比较有限。

因此，本研究旨在探讨鱼皮生物活性肽的制备、性质和应用方面的研究，为鱼皮资源的开发和利用提供科学依据和技术支持。

二、研究内容和方法研究内容：1. 鱼皮蛋白质的提取和水解工艺优化。

2. 生物活性肽的分离、纯化和鉴定。

3. 生物活性肽的功能性研究。

研究方法：1. 鱼皮蛋白质的提取采用离子交换和凝胶过滤等技术。

2. 蛋白质水解采用酶法或发酵法进行。

3. 生物活性肽的分离、纯化和鉴定采用高效液相色谱、电泳等技术。

4. 生物活性肽的功能性研究采用体外实验和动物实验等方法。

三、研究预期结果和意义预期结果：1. 完成鱼皮蛋白质的提取和水解工艺优化。

2. 分离纯化多种生物活性肽。

3. 研究不同生物活性肽的生物学功能，如降压、抗氧化和抗菌等。

4. 研究生物活性肽的作用机理和途径。

研究意义：1. 支持鱼皮资源的开发和利用。

2. 为生物活性肽的开发和利用提供重要依据和技术支持。

3. 提供新的基础理论和方法，为相关产业链的发展和提高提供技术支撑。

4. 增强我国渔业加工业的环保意识和产业竞争力。

鲟鱼鳔胶原蛋白肽延缓衰老作用研究及应用一、概述随着科学技术的不断发展和人类对健康生活的追求，抗衰老已经成为了当今社会关注的热点问题。

在众多的抗衰老方法中，营养补充剂因其安全、有效的特点受到了广泛的关注。

鲟鱼鳔胶原蛋白肽作为一种具有较高生物活性的天然蛋白质，近年来在抗衰老领域的研究取得了显著的成果。

本文将对鲟鱼鳔胶原蛋白肽的延缓衰老作用进行深入研究，并探讨其在实际应用中的潜在价值。

鲟鱼鳔胶原蛋白肽是一种富含氨基酸、多肽和胶原蛋白的生物活性物质。

研究表明胶原蛋白是构成皮肤、骨骼、关节等组织的重要成分，而胶原蛋白肽则是胶原蛋白的水解产物，具有更高的生物利用度和吸收率。

因此鲟鱼鳔胶原蛋白肽具有良好的抗衰老作用，能够通过多种途径改善皮肤弹性、减少皱纹、提高皮肤保湿能力等。

此外鲟鱼鳔胶原蛋白肽还具有一定的免疫调节作用，可以增强机体免疫力，降低炎症反应，对于预防和治疗一些慢性疾病具有积极意义。

同时鲟鱼鳔胶原蛋白肽还具有一定的抗氧化作用，能够清除体内自由基，延缓细胞衰老过程。

鲟鱼鳔胶原蛋白肽作为一种具有广泛应用前景的天然抗衰老物质，值得进一步研究和开发。

本文将从多个角度对其延缓衰老作用进行探讨，以期为抗衰老领域的研究提供有益的理论依据和实践指导。

1. 鲟鱼鳔胶原蛋白肽的来源和特点鲟鱼鳔胶原蛋白肽是一种来源于鲟鱼鳔的天然蛋白质，具有丰富的氨基酸组成和生物活性肽。

鲟鱼鳔胶原蛋白肽的主要成分为胶原蛋白，占总蛋白质的80以上，其余为弹性蛋白、糖胺聚糖等其他成分。

鲟鱼鳔胶原蛋白肽具有高纯度、低分子量、易被人体吸收等特点，是一种理想的抗衰老保健品原料。

鲟鱼鳔胶原蛋白肽的来源主要依靠人工养殖和捕捞，随着科技的发展，人工养殖技术逐渐成熟，使得鲟鱼鳔胶原蛋白肽的生产成本降低，产量提高为市场上的消费者提供了更多的选择。

同时为了保护野生资源，许多国家和地区对鲟鱼捕捞实行严格的管制政策，这也促使了鲟鱼鳔胶原蛋白肽产业的可持续发展。

鲟鱼鳔胶原蛋白肽具有多种生物活性肽，如促胰岛素样生长因子1(IGF、表皮生长因子(EGF)等，这些活性肽在调节人体免疫功能、促进细胞再生、延缓衰老等方面具有重要作用。

酶解法制备胶原蛋白肽及其抗氧化活性的研究朱静静;潘道东;孙杨赢;吴振;曹锦轩;曾小群【摘要】In this study, on the basis of enzymolysis with papain and flavourzyme of collagen from the skin of Zhedong white goose, four common hydrolasis solutions were used for two-step enzymolysis. Subsequently the conditions of two-step enzymolysis were optimized and the suitable hydrolyase was selected by antioxidant ability. By employing a single-factor test, pH, reaction temperature and reaction time were selected according to reducing power, then the response surface method was used to determine the optimum enzymatic process. The results showed that alkaline protease had a better antioxidant activity in the two-step enzymolysis, the optimum enzymolysis conditions were as follows: pH of 8.96, temperature of 49.3℃, time of 5.7h. Under these conditions, the reducing power of peptides reached to 13.48×10-2, which increased 3.51% than before.%以浙东白鹅为研究对象,在木瓜蛋白酶和风味蛋白酶复合一次酶解鹅皮胶原蛋白基础上,选取4种常见蛋白酶对胶原蛋白酶解产物进行二次酶解,并优化二次酶解条件以提高其产物的抗氧化活性,以抗氧化能力为指标确定二次酶解中的最佳水解酶.在单因素试验基础上,以还原力为指标,选取pH、酶解温度和酶解时间为考察因素,利用响应曲面法确定最佳酶解条件.结果表明,在胶原蛋白的二次酶解中,以碱性蛋白酶酶解所得产物抗氧化活性较好,响应曲面法确定碱性蛋白酶最优酶解条件为pH 8.96、酶解温度49.3℃、酶解时间5.7 h,此时所得多肽还原力达到13.48×10-2,较优化前提高了3.51%.【期刊名称】《宁波大学学报（理工版）》【年(卷),期】2016(029)004【总页数】7页(P26-32)【关键词】胶原蛋白;胶原蛋白肽;氧化活力;碱性蛋白酶;还原力【作者】朱静静;潘道东;孙杨赢;吴振;曹锦轩;曾小群【作者单位】宁波大学浙江省动物蛋白食品精深加工技术重点实验室，浙江宁波315211;宁波大学浙江省动物蛋白食品精深加工技术重点实验室，浙江宁波315211; 南京师范大学食品科学与营养系，江苏南京 210097;宁波大学浙江省动物蛋白食品精深加工技术重点实验室，浙江宁波 315211;宁波大学浙江省动物蛋白食品精深加工技术重点实验室，浙江宁波 315211;宁波大学浙江省动物蛋白食品精深加工技术重点实验室，浙江宁波 315211;宁波大学浙江省动物蛋白食品精深加工技术重点实验室，浙江宁波 315211【正文语种】中文【中图分类】TS251.92胶原蛋白是生物体内常见的细胞外蛋白，多分布在动物的皮、骨、软骨、牙齿、肌腱、韧带等部位［1］. 胶原蛋白肽是胶原蛋白经降解后所得的小肽混合物，研究表明，胶原蛋白肽具有抗氧化、降血压、提高机体对矿物元素的吸收能力、增强免疫力、抗菌等诸多生理活性［2］. 抗氧化性胶原蛋白肽因具有抑制生物大分子过氧化、清除体内自由基的功效以及较高的安全性而被广泛关注. 因此，如何获得抗氧化活性较强的天然胶原蛋白肽成为近年来国内外研究的热点.蛋白质多肽链内部普遍存在着许多生物活性功能区，采用合理的降解工艺使胶原蛋白长链断裂，暴露功能基团，随之表现出不同的生物活性［3］.目前制备抗氧化性肽最常见的方法是酶解法，其工艺主要包括单酶水解法和多酶水解法两种. 研究发现，单一酶作用范围小，只能使少量蛋白溶解，不能达到酶解效果；选用多种酶对底物进行水解时，可有效增大底物的水解程度，从而使得更多的活性氨基酸残基暴露出来［4］. Zhao等［5］采用波萝蛋白酶和碱性蛋白酶分步酶解海参蛋白，其产物生物活性更强. Byun等［6］用碱性蛋白酶、链霉蛋白酶、胶原酶对狭鳕鱼皮分步酶解，所得酶解物活性较强. 贾韶千等［7］以还原力为指标，采用碱性蛋白酶和胃蛋白酶双酶分步水解银杏种仁蛋白，得到具有较高活性的抗氧化肽. 这些研究表明，内肽酶是制备抗氧化活性肽的重要酶类，然而这些酶对鹅皮胶原蛋白的降解作用以及所得小分子产物的生物活性强弱缺乏相应的研究，因此，探究内肽酶酶解鹅皮胶原蛋白、确立最优的胶原蛋白肽制备条件具有重要意义.本文以浙东白鹅鹅皮为提取胶原蛋白肽的原料，采用分步酶解法，对鹅皮胶原蛋白酶解产物的DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基清除能力，以及还原力进行测定，并以还原力为指标对酶解条件进行优化，旨在获得抗氧化活性较高的胶原蛋白肽.1.1 材料与试剂浙东白鹅由象山曙海大白鹅食品有限公司提供；碱性蛋白酶［EC3.4.21.14］、胰蛋白酶［EC3.4.21. 4］、中性蛋白酶［EC3.4.24.4］、胰凝乳蛋白酶［EC3. 421.1］购自北京索莱宝科技有限公司； 1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）购自美国Sigma公司.1.2 仪器与设备H-2050R型台式高速冷冻离心机（湘仪离心机有限公司）；电泳仪（北京君意东方电泳设备有限公司）； GelX1850凝胶成像分析系统（上海欧翔科学仪器有限公司）； Alpha1-4LD plus冷冻干燥机（德国Marin Christ）； Infinite200pro 酶标仪（TECAN公司）.1.3 鹅皮胶原蛋白肽的提取胶原蛋白提取参考Woo等方法［8］，并稍作修改. 将浙东白鹅宰杀后，取其鹅皮、除去可见脂肪，然后剪碎鹅皮，处理后的鹅皮采用乙醚进一步除去鹅皮脂肪，然后利用0.1mol·L-1NaOH除去杂蛋白，将所得上清液于4℃、2%胃蛋白酶（pH 2.0）酶解72h. 酶解完成后收集酶解产物并冷冻干燥，得胶原蛋白.胶原蛋白一次酶解参考丁琳等方法［9］，向所提取的胶原蛋白（底物浓度20mg·mL-1）中加入4000 U·g-1木瓜蛋白酶和风味蛋白酶混合酶液（1∶1， pH 6.0）于50℃酶解5h，酶解后即为胶原蛋白粗产物.二次酶解：向所得的第一次酶解后的产物分别添加4000U·g-1碱性蛋白酶（温度50℃， pH 9.0）、胰蛋白酶（温度37℃， pH 8.0）、中性蛋白酶（温度50℃，pH 8.0）、胰凝乳蛋白酶（温度37℃， pH 8.0）对一次酶解所得胶原蛋白产物进一步酶解5h，以获得抗氧化能力更好的胶原蛋白肽.1.4 抗氧化活性的测定1.4.1 DPPH自由基清除能力的测定鹅皮胶原蛋白酶解产物DPPH·清除能力的测定参考Li等方法［10］，并稍作修改. 向1.5mL PE管中加入0.5mL一次酶解产物和二次酶解产物溶液，分别加入0.125mL 0.2%（w/v） DPPH溶液（99.5%乙醇溶解，现用现配）、0.5mL 99.5%乙醇，混匀，混合液常温避光反应60min后，测定517nm处吸光值. 空白组用0.5mL蒸馏水代替样品溶液. 对照组用0.125mL 99.5%乙醇代替DPPH溶液.式中， A0为空白组吸光度； A1为对照组吸光度； A2为样品组吸光度.1.4.2 羟基自由基（·OH）清除能力的测定羟基自由基（·OH）清除能力测定参考涂勇刚等方法［11］，略作修改. 试验设空白组、样品组和对照组，样品组试管中依次加入0.4mol·L-1PBS缓冲液（pH 7.4）、2.5mmol·L-1邻菲罗啉溶液、样品溶液、2.5mmol·L-1FeSO4溶液各0.2mL，0.1mL 20 mmol·L-1H2O2溶液，混匀，37℃避光反应1h后，测定536nm处吸光值. 空白组中用0.2mL蒸馏水代替样品溶液；对照组中用0.3mL 蒸馏水代替样品溶液和H2O2溶液.式中， A0为对照组吸光度； A1为空白组吸光度； A2为样品组吸光度.1.4.3 超氧阴离子自由基（O2·-）清除能力的测定采用邻苯三酚自氧化法测定鹅皮胶原蛋白酶解液O2·-清除能力［12］. 将250μL 一次酶解产物和二次酶解产物样品与450μL 50mmol·L-1Tris-HCl缓冲液（pH 8.2）混匀，室温放置10min后加入25μL 10mmol·L-1邻苯三酚溶液，每隔5min测定320nm处吸光值. 空白组用同体积蒸馏水代替样品溶液.式中，ΔA0为空白组吸光度变化值；ΔA1为样品组吸光度变化值.1.4.4 还原力的测定鹅皮胶原蛋白酶解液还原能力测定采用Wu等方法［13］，略作修改. 依次加入0.2mol·L-1PBS缓冲液（pH 6.6）、1%铁氰化钾、一次酶解产物和二次酶解产物样品溶液各200μL，混匀，于50℃恒温水浴20min，然后加入200μL 10%三氯乙酸，再次混匀. 混合液5000r·min-1离心15min，取上清液0.5 mL，依次加入0.5mL蒸馏水、0.1mL 0.1% FeCl3，混匀，常温反应10min，于700nm 处测定吸光值.1.5 水解度(DH%)的测定胶原蛋白肽水解度测定参考赵新准等方法［14］.1.6 Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳将胶原蛋白酶解产物进行Tricine-SDS-PAGE以确定其分子量范围［15］. 取20μL 5×蛋白上样缓冲液与80μL胶原蛋白酶解液（5mg·mL-1）混匀，沸水浴10min，室温冷却后备用. 配制SP-Tricine SDSPAGE凝胶（18%的分离胶、5%的浓缩胶），各泳道上样量为10μL，浓缩胶120V， 30min，分离胶150V，2h. 考马斯亮蓝R250染色液染色30min，脱色，凝胶成像系统观察并拍照.1.7 胶原蛋白酶解条件的确立以水解度（DH%）和还原力（A700）为指标对碱性蛋白酶酶解工艺进行优化. 设定底物质量浓度为10mg·mL-1，分别对pH（A）为6、7、8、9、10、11、12、13，酶的用量（B）为2000， 3000， 4000， 5000，6000U·g-1，酶解时间（C）为3， 4， 5， 6， 7h和酶解温度（D）为30， 40， 50， 60，70℃进行单因素试验. 在单因素试验基础上，采用响应面分析试验， Design-Expert 8.0.b软件分析，确定最佳酶解条件.1.8 数据统计与分析数据结果采用SAS 8.0软件进行统计学处理，所有数据均采用x±std表示，不同处理间的差异采用one-way ANOVA进行比较分析，以P＜0.05为差异显著，最终处理结果用Origin 9.0作图.2.1 一次酶解所得鹅皮胶原蛋白产物的Tricine-SDS-PAGE一次酶解后所得鹅皮胶原蛋白产物Tricine-SDS-PAGE结果如图1所示，经木瓜蛋白酶+风味蛋白酶复合酶解后的胶原蛋白产物分子量主要集中在26ku以上，2500u以下仅有微弱的肽片段产生. Kitts［16］和Jiang［17］等研究报道，多肽的生物活性功能取决于其氨基酸组成和氨基酸的序列，每个生物活性肽主要包含3～20个氨基酸残基，分子量在2500u以下，而在本文中，一次酶解后的胶原蛋白产物大多集中于26ku以上，此时酶解产物含有大量蛋白片段，这意味着胶原蛋白酶解不充分，有必要选择合适的酶来进一步酶解这些大分子量的胶原蛋白片段，使之降解为胶原蛋白肽，释放出更高活性. 一次酶解后胶原蛋白产物对DPPH·、·OH和O2·-清除率见表1，一次酶解后胶原蛋白产物对DPPH·、·OH和O2·-清除率分别为31.18%、18.02%和13.24%， Fe3+的还原能力为8.31×10-2，这些数据也表明，一次酶解后的胶原蛋白产物抗氧化活力仍然低下. 因此，该产物需进一步酶解.2.2 二次酶解产物抗氧化能力的比较本文选用碱性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶4种酶对一次酶解后的胶原蛋白产物进一步酶解，对酶解后的胶原蛋白肽再次进行抗氧化能力测定. 根据1.4节所述方法测定相同质量浓度（5mg·mL-1）下不同种类蛋白酶二次酶解产物的抗氧化能力（表2）.表2数据显示，胶原蛋白经2次酶解后， 4种酶二次酶解产物清除DPPH·效率与一次酶解产物相比，清除自由基的能力均显著提高；还显示碱性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶的产物在清除DPPH·的效率上存在着显著性差异，碱性蛋白酶酶解后的产物对DPPH·清除能力达到了83.03%，明显优于0.1mg·mL-1Vc、20 mmol·mL-1BHT和其余3种蛋白酶酶解后的产物；在清除·OH和O2·-的效率上，碱性蛋白酶的酶解产物对·OH和O2·-清除率分别为37.92%和68.05%，均优于其他几种酶酶解物的清除效果，也相应强于一次酶解后的产物对它们的清除能力. 另外碱性蛋白酶酶解产物还原力为13.10×10-2（吸光值越大，表明样品的还原力越强），高于其他几种酶解产物对Fe3+的还原能力，且不同酶解产物间存在显著差异（P＜0.05）.综上所述，二次酶解后，胶原蛋白肽抗氧化能力得到提高；对所选的4种酶进行比较，发现碱性蛋白酶酶解产物对DPPH·、·OH和O2·-的清除率、对Fe3+还原力均高于其他酶解产物；用碱性蛋白酶酶解鹅皮胶原蛋白可以获得抗氧化活性更高的胶原蛋白肽.2.3 碱性蛋白酶酶解胶原蛋白最佳条件的确定每种酶均有其最适的反应条件，在最适的反应条件下酶的活性最高. 由于每种酶对于特定底物都会有不同的酶解条件，在不同的酶解条件下所得到的抗氧化能力也不尽相同，所以有必要对碱性蛋白酶最佳酶解条件进行确定. 碱性蛋白酶酶解胶原蛋白的最佳条件主要通过单因素试验和响应面曲线来确定.2.3.1 单因素试验结果碱性蛋白酶二次酶解胶原蛋白的单因素试验结果如图2所示. 从图2（a）可见，二次酶解产物的还原力先增加后减少，水解度与其保持相似的变化趋势. 当pH=11时，水解度达到最大，为67.16%，还原力在pH=9时达到最大值，为13.21×10-2. 由图2（b）和（c）可知，随着酶添加量的不断增加和酶解时间的不断延长，胶原蛋白肽的水解度及还原力不断增强. 当酶添加量高于4000U·g-1或酶解时间大于5h时，水解度和还原力上升趋缓. 由图2（d）可知，随着酶解温度的升高，水解度和还原力先增大后减小，这可能是由于温度过高抑制酶的活性，导致酶解不彻底，进而影响酶解液的还原能力.在单因素试验的基础上，结合水解度、还原力（A700）双指标，筛选出pH、温度、时间3个因素为显著因素，以还原力为指标，利用Design-Expert 8.0.b软件进行Box-Behnken 3因素3水平响应面试验设计，以确定最优酶解条件（表3）.2.3.2 响应面设计在单因素实验的基础上，根据表3响应曲面试验设计方案，采用Box-Behnken 设计方法，对碱性蛋白酶酶解条件进行确立，结果见表4.2.3.3 响应曲面试验的方差分析经Design-Expert 8.0.b软件对碱性蛋白酶的酶解试验结果进行多元回归分析，建立了碱性蛋白酶酶解条件（pH A、温度B和时间C）与酶解产物还原力Y的数学模型：对模型的方差分析结果见表5，该模型显著性P＜0.000 1，极显著，说明该模型具有意义；模型失拟项P＞0.05，不显著，说明模型拟合度好. 分析各模型系数的P值，得出A的影响不显著，而其他模型的影响均显著.2.3.4 响应面交互作用分析通过表5的试验结果及其回归模型绘制响应曲面，分析酶解条件对多肽还原力的影响，结果如图3所示. 通过Design-Expert 8.0.b软件求解方程，以鹅皮中胶原蛋白肽的还原力为指标，根据响应曲面对3个因素的优化结果分析得出碱性蛋白酶最佳酶解条件为： pH 8.96、酶解温度49.27℃、酶解时间5.68h，此时多肽的还原力达到13.56×10-2.参照响应面分析得到的最优条件，结合实际操作的可行性，修正酶解条件为pH 8.96、酶解温度49.3℃、酶解时间5.7h，实际测得还原力为13.48×10-2，与理论值的相对偏差为0.59%，不显著（P＞0.05）.因此采用响应面分析方法得到的优化条件准确可靠，具有实际应用价值.胶原蛋白抗氧化肽是一种生物活性肽，它的抗氧化活性强弱与肽的氨基酸组成、排列顺序有关，研究发现分子量较小的多肽抗氧化活性较强［16］.本研究发现，胶原蛋白在木瓜蛋白酶+风味蛋白酶一次酶解后蛋白分子量基本在26ku以上，所得产物为大分子蛋白片段，其抗氧化活性低下，二次酶解后，胶原蛋白水解度增加，水解产物的抗氧化活性显著增强. 内肽酶是酶解鹅皮胶原蛋白的重要酶类，不同种类的内肽酶对胶原蛋白的降解程度不相同，其抗氧化活力也存在显著差. 不同酶的专一性和酶切位点不同，故其酶解产物的抗氧化能力存在差异性. Chen等［18］研究发现，芳香族氨基酸对于多肽清除自由基所表现出来的抗氧化能力具有重要的意义，其原因可能在于芳香族氨基酸上的咪唑环具有捕捉自由基和提供质子的能力. 在本研究结果中，同样酶解条件下，碱性蛋白酶酶解产物具有更强的抗氧化活力，可能是由于碱性蛋白酶酶解胶原蛋白后释放出更多的Tyr、Phe和His等芳香族氨基酸残基.酶解时间、溶液pH、酶解温度和加酶量等酶解条件是影响多肽得率和活性的重要因素. 因此在酶解过程中需控制酶解条件，以期获得目的肽.本研究结果表明，在一次酶解的基础上，选用碱性蛋白酶酶解胶原蛋白所得酶解产物抗氧化活性更强. 陈晶等［19］研究发现利用复合蛋白酶与风味蛋白酶进行分步酶解鱼骨蛋白比使用单一酶酶解时，水解度分别提高了9.81%和11.07%. 杨铭铎等［20］比较了单酶水解、双酶同步水解和双酶分步水解对麦胚蛋白的酶解效果，结果表明，双酶分步水解、双酶同步水解、单酶水解的酶解效果依次降低. 这与本研究结果相似. 首先用木瓜蛋白酶+风味蛋白酶对提取的鹅皮胶原蛋白进行酶解，经测定发现其抗氧化能力较弱，通过Tricine-SDS-PAGE分析，酶解液的分子量基本在26ku 以上，意味着胶原蛋白仍以蛋白片段形式存在. 采用二次酶解后其产物抗氧化活性显著提高，碱性蛋白酶酶解后的产物DPPH·、·OH与O2·-清除率分别达到83.03%， 37.92%和68.05%，还原力（A700）为13.10×10-2，效果均优于其他酶解产物，表现出更强的抗氧化能力. 通过单因素试验和响应曲面试验确定碱性蛋白酶最佳酶解条件为pH 8.96、酶解温度49.3℃、酶解时间5.7h，在此条件下多肽还原力达到13.48×10-2. 本文的研究结果为鹅皮的高附加值产品的开发提供了理论基础，有利于提高鹅皮下脚料的再利用率.【相关文献】［1］GÓMEZ G M C，GIMÉNEZ B，LÓPEZ C M E， et al. Functional and bioactive properties of collagen and gelatin from alternative sources： A review［J］. Food Hydrocolloids， 2011， 25（8）：1813-1827.［2］ QIAN Z J， JUNG W K， KIM S K. 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生物技术进展 2023 年 第 13 卷 第 6 期 934 ~ 939Current Biotechnology ISSN 2095‑2341研究论文ArticlespH 渐变条件下多酶分步连续酶解工艺制备鲟鱼硫酸软骨素与胶原蛋白肽王珍瑜1 ， 陆文超1 ， 钟康荣2 ， 关永健2 ， 汪真2 ， 陈超1 *1.清华大学化学系，北京 100084；2.贵州千鲟生物科技有限公司，贵州 黔东南苗族侗族自治州 556300摘要：pH 渐变条件下采用碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶分步连续酶解鲟鱼软骨，同时制备鲟鱼硫酸软骨素和胶原蛋白肽。

分别通过温度、酶解时间、酶用量3个单因素实验，研究其对连续酶解效果的影响。

综合分析得出最佳条件：碱性蛋白酶酶解温度为45 ℃，酶解时间为2 h ，酶用量为100 U ·g -1底物；木瓜蛋白酶的酶解温度为50 ℃，酶解时间为2 h ，酶用量为50 U ·g -1底物；菠萝蛋白酶的酶解温度为50 ℃，酶解时间为2 h ，酶用量为30 U ·g -1底物。

该工艺条件下制备的鲟鱼硫酸软骨素提取率为85%，纯度93%，胶原蛋白肽的提取率为82%，纯度为90%。

研究建立的pH 渐变条件下多酶分步连续酶解工艺，产率与纯度较国内现有生产方法均有提高，且碱液使用量减少，避免了有机溶剂的引入，从而可以降低生产成本，减轻环境污染负担。

关键词：酶解工艺；硫酸软骨素；胶原蛋白肽DOI ：10.19586/j.2095­2341.2023.0119中图分类号：Q556， TQ925+.2 文献标志码：APreparation of Chondroitin Sulfate and Collagen Peptide of Sturgeon by Multi -enzyme Step -by -step Enzymatic Hydrolysis Under the Condition of pH GradientWANG Zhenyu 1 ， LU Wenchao 1 ， ZHONG Kangrong 2 ， GUAN Yongjian 2 ， WANG Zhen 2 ， CHEN Chao 1 *1.Department of Chemistry ， Tsinghua University ， Beijing 100084， China ；2.Guizhou Qiansturgeon Biotechnology Co.， Ltd ， Guizhou Qiandongnan Miao and Dong Autonomous Prefecture 556300， ChinaAbstract ：Alkaline protease ， papain and bromelain were used to hydrolyze cartilage of sturgeon step by step under pH gradient conditions to prepare sturgeon chondroitin sulfate and collagen peptide simultaneous. The effects of enzymatic hydrolysis tempera­ture ， enzymatic hydrolysis time ， and enzyme dosage on the efficiency of enzymatic hydrolysis were investigated. Based on com­prehensive analysis ， the optimal temperature for alkaline protease hydrolysis was 45 ℃， hydrolysis time was 2 hours ， and enzyme dosage was 100 U ·g -1 cartilage ； the optimal temperature for papain hydrolysis was 50 ℃， hydrolysis time was 2 hours ， and en­zyme dosage was 50 U ·g -1 cartilage ； the optimal temperature for bromelain hydrolysis was 50 ℃， hydrolysis time was 2 hours ， and enzyme dosage was 30 U ·g -1 cartilage. Sturgeon chondroitin sulfate was extracted at a rate of 85% with a purity of 93%， while collagen peptide was extracted at a rate of 82% with a purity of 90%. In comparison to the currently used domestic production techniques ， the multi -enzyme step -by -step enzymatic hydrolysis process established in this study under pH gradient conditions could improve yield and purity ， reduce the amount of alkali ， and avoid the introduction of organic solvents ， thereby lowering the production cost and lessening the burden of environmental pollution.Key words ：enzymatic hydrolysis process ； chondroitin sulfate ； collagen peptide收稿日期：2023­09­25； 接受日期：2023­10­24基金项目：清华大学国强研究院项目。

可控酶解从海洋鱼蛋白中制备生物活性肽的研究一、本文概述本研究工作聚焦于海洋资源的深度开发利用，特别是针对海洋鱼类蛋白这一丰富且未充分利用的生物资源，采用先进的可控酶解技术来制备具有生物活性的肽类物质。

论文首先阐述了海洋鱼蛋白作为生物活性肽潜在来源的重要性，以及酶解技术在蛋白质改性和功能成分释放方面的优势。

通过对沙丁鱼蛋白进行系统研究，我们探索了酶种类选择、酶解条件（包括pH值、温度、水解时间、酶底物比等）的优化，并结合超滤和离子交换层析等分离纯化手段，旨在高效地从鱼蛋白中获得具有特定生物活性的小分子肽。

研究的核心目标是探究如何通过精准调控酶解过程，实现对生物活性肽产量和结构的控制，进而鉴定其结构特征和生物活性。

实验不仅涵盖了活性肽的制备流程优化，还包括对其抗疲劳活性的深入研究，以验证所得到的生物活性肽在改善机体机能方面可能的应用价值。

最终，本研究期望为海洋鱼蛋白资源的高值化利用提供理论依据和技术支撑，推动生物活性肽在医药、食品、化妆品等领域的发展与应用。

二、海洋鱼蛋白原料及预处理方法海洋鱼蛋白作为生物活性肽的理想来源，因其丰富的氨基酸组成和潜在的生物活性而备受关注。

本研究选取了新鲜且富含高质量蛋白质的海洋鱼类，如沙丁鱼、鲐鲅鱼等，确保原料的新鲜度和无污染状态是保证最终产品品质的关键。

在预处理阶段，首先对捕捞或收购的鱼类进行了严格筛选，剔除了病害、死亡以及不新鲜的个体。

原料鱼经清洗去除内脏和杂质后，采用低温冷冻技术迅速锁住蛋白质结构和营养成分，防止腐败变质。

随后进行解冻，并对鱼肉进行机械破碎，通过物理方式去除脂肪和其他非蛋白成分，这一过程通常包括离心分离、压榨脱脂等步骤，力求将鱼蛋白的脱脂残留量控制在较低水平，以利于后续酶解反应的高效进行。

接着，对脱脂后的鱼肉进行温和热处理，以破坏肌肉组织结构并灭活可能影响酶解效果的天然酶类。

将处理过的鱼肉进一步研磨成细粉，以增大鱼蛋白与酶接触的表面积，提高酶解效率。

鱼皮抗氧化肽提取工艺流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。

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酶解法制备鲟鱼皮活性肽条件优化及抗氧化能力鲟鱼是一种珍贵的鱼类，其鱼皮含有丰富的胶原蛋白和活性肽，具有很高的营养价值和药用价值。

鲟鱼皮活性肽具有抗氧化、抗菌、抗衰老等多种生物活性，因而备受关注。

酶解法制备鲟鱼皮活性肽是一种常用的方法，但其条件优化及抗氧化能力还有待进一步研究。

本文将针对酶解法制备鲟鱼皮活性肽的条件优化及抗氧化能力展开研究，并探讨其潜在的应用价值。

酶解法是目前制备活性肽的主要方法之一，通过酶解能够有效降解蛋白质，提取出活性肽。

鲟鱼皮中的胶原蛋白含量较高，因而采用酶解法制备活性肽具有很大的潜力。

鲟鱼皮活性肽的酶解条件对其产率和抗氧化能力影响很大，因而需要进行条件优化。

1. 酶种选择酶种选择是影响酶解效果的关键因素之一。

常用的酶种有胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、凝血酶等。

不同的酶种具有不同的酶解特性，选择合适的酶种对于提高鲟鱼皮活性肽的产率和抗氧化能力至关重要。

2. 酶解温度酶解温度是影响酶解速率和酶解效果的重要因素。

过高或过低的酶解温度都会影响酶解反应的进行，因而需要进行合理的温度优化。

4. 酶解pH酶解pH是影响酶解反应进行的重要因素，不同的酶种对pH的适应范围不同，因而需要进行pH的优化以提高鲟鱼皮活性肽的产率和抗氧化能力。

通过对酶解温度、酶解时间、酶解pH等条件的优化，能够有效提高鲟鱼皮活性肽的产率和抗氧化能力，为其后续的应用研究提供了重要的基础。

二、鲟鱼皮活性肽的抗氧化能力研究鲟鱼皮活性肽具有很高的营养价值和药用价值，其中的抗氧化能力尤为突出。

抗氧化能力是指抑制活性氧自由基的生成和清除已产生的自由基，保护细胞和组织免受氧化损伤的能力。

因而，研究鲟鱼皮活性肽的抗氧化能力对于其进一步的应用具有重要的意义。

1. 抗氧化活性评价方法常用的抗氧化活性评价方法包括DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率、还原能力等。

通过这些方法能够全面评价鲟鱼皮活性肽的抗氧化能力，并为其后续的应用研究提供重要的参考。

专利名称：一种从鱼下脚料中制备活性多肽的方法专利类型：发明专利
发明人：张丽琍,祁斌,吴雷,张超
申请号：CN201110395254.4
申请日：20111202
公开号：CN102492761A
公开日：
20120613
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及一种从鱼下脚料中制备活性多肽的方法，以鱼下脚料为原料，经洗净，沥干，粉碎，加水灭菌，酶解反应，活性碳吸附脱色，三级过滤后真空冷冻干燥，获得了鱼活性多肽。

利用本发明的方法获得了风味较好的活性多肽，实现了对废料的综合利用，进一步提高鱼下脚料的附加值，同时生产工艺简单，反应条件温和，对生产设备的要求低，适合工业化大生产。

申请人：安徽燕之坊食品有限公司
地址：230051 安徽省合肥市包河区包河工业区天津路8号安徽燕之坊食品有限公司
国籍：CN
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酶法提取鲟鱼油工艺的研究郝淑贤;石红;李来好;杨贤庆;岑剑伟;周婉君【期刊名称】《食品科学》【年(卷),期】2009(030)002【摘要】本实验以鲟鱼加工下脚料为原料,研究酶法提取鲟鱼鱼油的工艺条件,比较不同提取方法对鱼油提取质量的影响,对3种抗氧化剂在鱼油提取过程中的抗氧化性能进行了研究.结果表明,鱼油提取的最佳工艺条件为:酶量0.6%,水解时间2b,水解温度40℃,pH7,该工艺条件对鲟鱼内脏鱼油的提取效果明显好于氨法、钾法和蒸煮法,提取鱼油的过氧化值略高于氨法和钾法,但低于蒸煮法.TBHQ、VC、茶多酚三种抗氧化剂对鱼油抗氧化作用以TBHQ效果最好.应用本法从鲟鱼肚及鲟鱼内脏提取的鱼油含有大量的不饱和脂肪酸,脂肪酸的不饱和程度与咸海卡拉白鱼接近,明显高于淡水养殖鱼类,是加工鱼油的良好来源.【总页数】4页(P38-41)【作者】郝淑贤;石红;李来好;杨贤庆;岑剑伟;周婉君【作者单位】中国水产科学研究院南海水产研究所,广东,广州,510300;中国水产科学研究院南海水产研究所,广东,广州,510300;中国水产科学研究院南海水产研究所,广东,广州,510300;中国水产科学研究院南海水产研究所,广东,广州,510300;中国水产科学研究院南海水产研究所,广东,广州,510300;中国水产科学研究院南海水产研究所,广东,广州,510300【正文语种】中文【中图分类】O547【相关文献】1.酶法提取人工养殖鲟鱼皮中胶原蛋白的工艺研究 [J], 马俪珍2.水酶法提取胡麻籽油的工艺及性质研究 [J], 李琼;游新勇;许美娟;郭耀东3.响应面法优化斑点叉尾鮰鱼内脏油的水酶法提取工艺研究 [J], 相朝清4.水酶法提取南瓜籽油过程中乳状液酶法\r联合化学法破乳工艺研究 [J], 张根生;杨慧铎;岳晓霞;刘志鑫;许春明5.超声波辅助水酶法提取木棉籽油的工艺优化及性质研究 [J], 叶茂;邓毛程;李静因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

鲟鱼鱼皮胶原蛋白的提取及其理化性能分析杨玲;赵燕;鲁亮;王忠稳;宋保垒;王占方;汪海波【期刊名称】《食品科学》【年(卷),期】2013(034)023【摘要】从鲟鱼鱼皮中分别提取、纯化酸溶性胶原蛋白(ASC)和酶溶性胶原蛋白(PSC),并对鲟鱼鱼皮胶原蛋白分子结构组成及理化性能进行测定和分析,并与哺乳动物来源的牛跟腱胶原进行比较研究.结果表明:提取所得的鲟鱼鱼皮胶原和牛跟腱胶原均为典型的Ⅰ型胶原;鲟鱼鱼皮胶原ASC和PSC的氨基酸组成和蛋白二级结构基本一致,但与牛跟腱胶原有较明显的差异性;胶原蛋白的理化性能分析结果表明:鲟鱼鱼皮胶原蛋白ASC和PSC的热变性温度(28.04、28.13℃)明显低于牛跟腱胶原蛋白的变性温度(42.81℃);在溶液状态下,牛跟腱胶原蛋白更容易形成分子间的聚集体且展现出比鲟鱼鱼皮胶原蛋白更好的耐酶降解能力.【总页数】6页(P41-46)【作者】杨玲;赵燕;鲁亮;王忠稳;宋保垒;王占方;汪海波【作者单位】武汉轻工大学化学与环境工程学院,湖北武汉 430023;武汉轻工大学食品科学与工程学院,湖北武汉 430023;武汉轻工大学食品科学与工程学院,湖北武汉 430023;武汉轻工大学食品科学与工程学院,湖北武汉 430023;河北省粮食产业集团有限公司,河北石家庄 050800;河北省粮食产业集团有限公司,河北石家庄050800;武汉轻工大学化学与环境工程学院,湖北武汉 430023【正文语种】中文【中图分类】TQ93【相关文献】1.人工养殖中华鲟鱼皮中胶原蛋白提取工艺研究 [J], 冯伟伟;邹艳敏;茆广华;赵婷;邹烨;郑大恒;仰榴青;吴向阳2.酶法提取人工养殖鲟鱼皮中胶原蛋白的工艺研究 [J], 马俪珍3.尖吻鲈鱼鳞和鱼皮胶原蛋白的提取及其理化特性分析 [J], 廖伟;夏光华;李川;仇昶旭;李永成;申铉日4.基于不同提取方法的鮰鱼皮胶原蛋白理化性质的比较研究 [J], 温慧芳;陈丽丽;白春清;赵利;袁美兰;杜雨芊5.乌鳢和草鱼鱼皮胶原蛋白的提取与理化性能分析 [J], 王忠稳;汪海波;梁艳萍;李云雁;王敏;汪海婴因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

酶解法制备鲟鱼皮活性肽条件优化及抗氧化能力【摘要】本研究通过酶解法制备了鲟鱼皮活性肽，并对制备条件进行了优化。

实验结果表明，鲟鱼皮活性肽具有很强的抗氧化能力，具有广泛的生物活性和应用前景。

研究还发现，抗氧化能力受多种因素影响。

结论部分总结了酶解法制备鲟鱼皮活性肽的最佳条件，并强调了其优越的抗氧化能力。

未来研究将进一步探索鲟鱼皮活性肽的其他生物活性及其应用前景。

这项研究为开发鲟鱼皮活性肽的新用途提供了重要的参考价值。

【关键词】酶解法、鲟鱼皮、活性肽、条件优化、抗氧化能力、生物活性、应用前景、影响因素、研究背景、研究目的、研究意义、未来研究展望。

1. 引言1.1 研究背景目前，虽然已有关于鲟鱼皮活性肽的研究，但酶解法制备鲟鱼皮活性肽的条件优化及其抗氧化能力的系统研究还相对缺乏。

本研究旨在通过对鲟鱼皮活性肽制备过程中的关键条件进行优化，探究其抗氧化能力及生物活性，为进一步开发鲟鱼皮活性肽的应用提供理论依据和实验数据。

鲟鱼皮活性肽的抗氧化能力尤为重要，其抗氧化性可以帮助预防和延缓氧化反应引发的疾病，对健康有着积极的影响。

深入研究鲟鱼皮活性肽的抗氧化机制及影响因素，不仅有利于开发新型抗氧化剂，还对保健食品和药物研发具有一定的指导意义。

1.2 研究目的本研究的目的是通过酶解法制备鲟鱼皮活性肽并对其条件进行优化，探究鲟鱼皮活性肽的抗氧化能力及生物活性，进一步探讨其应用前景。

通过对抗氧化能力的影响因素进行研究，探讨鲟鱼皮活性肽的抗氧化机制，为开发具有抗氧化功能的新型功能性食品提供理论依据。

本研究旨在为鲟鱼皮资源的高效利用提供科学依据，为食品工业的发展提供新的原料与技术支持。

通过深入探讨鲟鱼皮活性肽的生物活性及其潜在应用价值，旨在挖掘鲟鱼皮中的活性成分，为开发具有保健功能的产品打下基础。

通过本研究，我们希望为鲟鱼皮活性肽的进一步研究与开发提供新的思路与方法，为鲟鱼皮资源的价值开发和利用提供科学依据和理论支持。

1.3 研究意义鲟鱼是一种珍贵的淡水鱼类，其皮具有较高的蛋白质含量和天然抗氧化物质。

酶法制备鲟鱼皮胶原蛋白多肽及其抗氧化活性研究李露园; 王升帆; 朱有贵; 章银军; 汪钊; 郑建永【期刊名称】《《食品与发酵工业》》【年(卷),期】2019(045)020【总页数】6页(P138-143)【关键词】鲟鱼皮; 胶原蛋白肽; 碱性蛋白酶; 酶解; 抗氧化活性【作者】李露园; 王升帆; 朱有贵; 章银军; 汪钊; 郑建永【作者单位】浙江工业大学生物工程学院浙江杭州 310032; 浙江医药股份有限公司新昌制药厂浙江绍兴 312500【正文语种】中文胶原蛋白是一种重要的功能性多糖蛋白质，与细胞再生分化等有密切关系[1]。

胶原蛋白肽是胶原蛋白的降解产物，由3～20个氨基酸组成[2]，具有抗菌、抗氧化、降血压血脂、调节免疫等作用[3-5]。

与胶原蛋白相比，胶原蛋白肽分子质量小、水溶性强、易消化吸收。

因其显著的生理活性，广泛应用于食品，医药，化妆品等领域。

与哺乳动物相比，鱼类胶原蛋白在来源的广泛性、生物安全性和产品成本等方面均具有更大的优势。

目前国内外研究者已成功从鱼皮[6]、鱼骨[7]、鱼鳞[8]等副产物中制备胶原蛋白肽。

中国是世界上鲟鱼种类较多的国家，产量占世界总产量的80%以上[9]。

鲟鱼目前主要用于鱼子酱的生产，在生产加工过程中鱼皮、鱼鳞和内脏等副产物利用率低，造成了严重的资源浪费和环境污染问题[10]。

因此利用酶法将鲟鱼皮胶原蛋白转化为生物活性肽具有重要的经济价值和社会意义。

本文采用碱性蛋白酶水解鲟鱼皮，通过单因素及正交试验优化鲟鱼皮制备胶原蛋白肽的制备工艺，并对其抗氧化活性进行了研究，旨在为鲟鱼皮的高值化加工利用提供理论依据。

1 材料与方法1.1 材料与试剂西伯利亚鲟鱼皮，由浙江新昌来益生态农业发展有限公司提供，除去鱼肉及非胶原组织后剪成约2 cm×2 cm的块状，于-20℃冰箱保存备用；碱性蛋白酶(1.69×105U/g)，丹麦诺维信公司；乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯，上海生工生物工程有限公司。