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乳清蛋白的提取及其在食品中的应用研究乳清蛋白是一种具有丰富营养的蛋白质，被广泛应用于食品工业中。
本文将探讨乳清蛋白的提取方法以及在食品中的应用研究。
乳清蛋白是从乳制品中提取得到的一种蛋白质。
乳清蛋白含有优质氨基酸，如赖氨酸、色氨酸等，对人体健康有益。
因此，在食品工业中广泛应用乳清蛋白，用于增加食品的营养价值和改善食品口感。
提取乳清蛋白的方法主要有酸、酶和离子交换等。
其中，酸法提取是最常见的方法。
该方法通过向乳制品中加入酸性物质，使乳清蛋白从乳制品中析出。
随后，乳清蛋白通过过滤和离心等步骤进行分离和纯化。
该方法简单易行，提取得到的乳清蛋白质纯度较高。
除了酸法提取，也有人采用酶法提取乳清蛋白。
酶法提取乳清蛋白的过程更加温和，对乳清蛋白的活性和功能性更有保护作用。
酶法提取需要在适当的温度和pH条件下加入合适的酶，使乳清蛋白在溶液中释放出来。
然后，通过过滤和纯化等步骤得到纯度较高的乳清蛋白提取物。
在食品工业中，乳清蛋白有着广泛的应用。
首先，乳清蛋白可以用作食品的营养增强剂。
研究表明，乳清蛋白中的氨基酸能够提供身体所需的能量，增强人体的免疫功能，并促进肌肉的生长与修复。
因此，将乳清蛋白加入到各类食品中，如婴儿奶粉、运动营养品等，能够提高食品的营养价值。
其次，乳清蛋白还可以用于改善食品的口感和质地。
乳清蛋白具有良好的乳化性和稳定性，能够增加食品的黏稠度和口感。
在食品加工中，可以将乳清蛋白用作乳化剂、稳定剂和增稠剂等，使得食品更加细腻、均匀和口感丰富。
例如，乳清蛋白可以被添加到冰淇淋中，使冰淇淋更加柔滑细腻。
此外，乳清蛋白还可以用于食品的保鲜和防腐。
乳清蛋白中含有一些具有抗菌活性的肽，如乳清肽和乳铁螯合肽等，可以抑制食品中的细菌生长和腐败。
因此，在肉类制品、面包糕点等食品中添加乳清蛋白可以延长其保质期，保持食品的新鲜和口感。
总结起来，乳清蛋白的提取方法包括酸法和酶法，其在食品中有着广泛的应用。
乳清蛋白可以增加食品的营养价值，改善食品的口感和质地，并起到保鲜防腐的作用。
乳清蛋白抗菌肽的分离纯化及活性
井雪莲;张建强;张丽萍
【期刊名称】《乳业科学与技术》
【年(卷),期】2014(037)004
【摘要】以乳清蛋白为原料,酶解制各具有抗菌能力的生物活性肽.采用超滤、葡聚糖凝胶层析色谱、反相高效液相色谱法对酶解液进行分离纯化,并对分离产物的氨基酸组成进行分析.结果表明:葡聚糖凝胶色谱纯化最佳流速2 mL/min,最佳样品质量浓度15 mg/mL;再由反相高效液相色谱分离的高活性抗菌肽,抑菌圈直径达到31.33 mm.氨基酸分析结果显示,高活性抗菌肽碱性氨基酸和疏水性氨基酸含量最多,分别为42.69％和37.39％.
【总页数】4页(P1-4)
【作者】井雪莲;张建强;张丽萍
【作者单位】黑龙江八一农垦大学食品学院,黑龙江大庆 163319;国家杂粮工程技术研究中心,黑龙江大庆 163319;黑龙江八一农垦大学食品学院,黑龙江大庆163319;国家杂粮工程技术研究中心,黑龙江大庆 163319
【正文语种】中文
【中图分类】TS252.9
【相关文献】
1.乳清浓缩蛋白中的α-乳白蛋白的分离纯化 [J], 张楠楠;李丹丹;曹阳阳;刘宁
2.鲜马奶乳清蛋白抗氧化肽分离纯化及其活性研究 [J], 古丽巴哈尔·卡吾力;高晓黎;
侯艳霞;常占瑛;王玲
3.牛乳清蛋白中β-乳球蛋白的分离纯化 [J], 吴凤;王志耕;王子龙;董娟娟
4.乳清蛋白肽的酶法制备、分离纯化及活性评价 [J], 任娇艳;赖婷;江燕清;卢韵君;刘鹏;廖文镇
5.驼乳和牛乳乳清蛋白抑菌肽的分离纯化及抑菌活性的比较 [J], 王瑞雪; 方舒; 伊丽; 明亮; 吉日木图
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林彦君，刘杨静，曲肖凤，等. 酶解大豆乳清蛋白制备抗氧化肽及其体外抗氧化活性评价[J]. 食品工业科技，2023，44（20）：230−238. doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2022120012LIN Yanjun, LIU Yangjing, QU Xiaofeng, et al. Antioxidant Peptides Prepared by Enzymatic Hydrolysis of Whey Soy Proteins and Their Antioxidative Activities in Vitro [J]. Science and Technology of Food Industry, 2023, 44(20): 230−238. (in Chinese with English abstract). doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2022120012· 工艺技术 ·酶解大豆乳清蛋白制备抗氧化肽及其体外抗氧化活性评价林彦君，刘杨静，曲肖凤，杜媛媛，房文硕，尹艺童，李 瑞*（济宁医学院生物科学学院，山东日照 276826）摘 要：为了提高大豆乳清废水中大豆乳清蛋白的应用价值，以大豆乳清蛋白为原料采用酶解法在自制的超声-恒温反应体系中制备抗氧化肽。
以总还原力、DPPH 自由基清除率和羟基自由基清除率为指标，结合单因素实验和响应面法优化大豆乳清蛋白的酶解工艺。
随后，利用超滤法（截留分子量30 kDa ）回收水解液中的抗氧化肽，并以抗坏血酸为参照，评价其体外抗氧化活性。
结果表明：中性蛋白酶和胃蛋白酶组合最适于大豆乳清蛋白的水解；在此基础上，确定的最佳工艺条件为酶-底物比5000 U/g 大豆乳清蛋白、酶解时间6 h 和大豆乳清蛋白浓度9.0 mg/mL ，所得大豆乳清蛋白水解液的DPPH 自由基清除率为62.3%±1.1%。
食品中活性肽的提取与生物活性鉴定近年来，食品中活性肽的提取与生物活性鉴定成为了食品科学领域的一个热门研究方向。
活性肽是由蛋白质分子中的特定序列组成的短链肽，具有多种生物活性，如抗氧化、抗炎、抗菌等功效。
本文将从提取技术和鉴定方法两个方面，探讨食品中活性肽的研究进展和未来发展趋势。
一、提取技术食品中的活性肽来源丰富，包括乳制品、豆制品、海鲜、畜禽肉类等。
提取活性肽的常用方法有酶解法、酸解法、发酵法和超声波法等。
其中，酶解法是目前最常用的提取方法之一。
通过加入适量的酶，如胃蛋白酶、胰蛋白酶等，对食物中的蛋白质进行水解，生成活性肽。
酸解法则是通过加入适量的酸，如盐酸、硫酸等，使蛋白质的酸性溶液中发生水解反应，提取出活性肽。
发酵法则是指在一定的发酵条件下，微生物通过产生特定的酶来水解蛋白质，生成活性肽。
超声波法则是利用超声波的物理效应，对食物中的蛋白质进行分解，得到活性肽。
二、鉴定方法鉴定活性肽的生物活性是活性肽研究的重要方面。
常用的鉴定方法主要包括抗氧化活性、抗炎活性和抗菌活性等。
抗氧化活性是指活性肽对抗自由基的能力。
自由基是导致细胞氧化损伤的主要原因，而抗氧化活性可以有效抑制自由基的产生和损伤。
常用的抗氧化活性鉴定方法有DPPH自由基清除法、ABTS自由基清除法和还原力测定法等。
其中，DPPH自由基清除法是最常用的方法之一。
该方法通过测定活性肽溶液对DPPH自由基的清除能力，来评估其抗氧化活性。
抗炎活性是指活性肽对炎症过程中的细胞损伤和炎症因子的抑制作用。
炎症是人体免疫系统对于组织损伤或感染的一种自我保护反应，但过度的炎症反应却会导致疾病的发生和发展。
常用的抗炎活性鉴定方法有淋巴细胞增殖试验、酶联免疫吸附实验和RT-PCR等。
其中，淋巴细胞增殖试验是一种直接测定活性肽对免疫细胞增殖能力的方法。
通过观察活性肽对T细胞和B细胞的增殖活性，来评估其抗炎活性。
抗菌活性是指活性肽对细菌的抑制作用。
细菌感染是导致多种疾病的重要原因，而抗菌活性可以有效地抑制细菌的生长和繁殖。
牛奶中乳清蛋白质分离与酶水解工艺的优化研究牛奶中乳清蛋白质的分离和酶水解工艺一直是乳制品工业中的研究热点。
乳清蛋白质是一种优质的蛋白质资源，具有多种生物活性和功能特性。
本文将探讨牛奶中乳清蛋白质分离和酶水解工艺的优化研究。
首先，牛奶中乳清蛋白质的分离是提取乳清蛋白质的第一步。
目前常用的方法包括离心法、超滤法、离子交换法等。
离心法适用于分离大分子蛋白质和沉淀，但是对乳清蛋白质的分离效果不佳。
超滤法通过膜分离技术，可以有效地将乳清蛋白质与其他组分分离开来。
离子交换法利用离子交换树脂，通过选择性吸附和洗脱的原理，分离出乳清蛋白质。
这些方法各有优缺点，需要根据具体情况进行选择和改进。
其次，酶水解是将乳清蛋白质水解成更小的肽段或氨基酸的过程。
酶水解可以提高乳清蛋白质的生物利用率和功能特性。
常用的水解酶包括胃蛋白酶、胰蛋白酶、粘酶等。
水解酶的选择和使用条件对水解效果和产物特性有着直接影响。
此外，酶水解过程还受到反应温度、pH值、酶底物比、酶水解时间等因素的影响。
通过适当调整这些条件，可以达到最佳的水解效果和产物特性。
优化研究主要包括工艺参数优化和酶水解产物性质优化两个方面。
工艺参数优化是指通过对离心法、超滤法、离子交换法等分离方法进行改进和调整，以提高乳清蛋白质的分离效率和纯度。
例如，可以改进超滤膜的材料和孔径，提高分离效果。
也可以通过改变离子交换树脂的种类和浓度，优化纯化过程。
酶水解产物性质优化则是指通过对酶水解条件、酶种类和底物比等进行优化，以获得理想的水解产物。
在确定最佳水解条件时，需要考虑到产物的氨基酸组成、分子量分布和生物活性等。
此外，还可以采用工程技术手段，如超声波处理、高压处理等，提高水解效果和产物的功能性。
总之，牛奶中乳清蛋白质的分离与酶水解工艺的优化研究具有重要的理论和应用价值。
通过寻找最佳的分离和水解工艺条件，可以提高乳清蛋白质的产量和产物质量，开发出更多具有生物活性和功能特性的乳制品。
乳清蛋白抗氧化肽的分离纯化及序列分析吴慧;卢蓉蓉;沈浥;凌玉芳;周蕊【摘要】采用不同蛋白酶酶解乳清浓缩蛋白,以DPPH自由基清除率评价抗氧化活性,确定胰蛋白酶为最佳酶源.依次采用大孔吸附树脂、凝胶层析、制备型和分析型反相高效液相色谱分离纯化酶解物.最后得到A3a和A3b两个纯化多肽,经Q-TOF MS分析得到氨基酸序列为LDGNAKPTPEGDLEL和LYEDLKPTPEGPMEL.A3a和A3b的DPPH自由基清除IC50分别为2.51和4.95μg/mL.结果表明,乳清蛋白抗氧化肽具有较小分子量和特定氨基酸序列,能够有效清除自由基,可作为食源性抗氧化剂.【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2010(036)010【总页数】5页(P6-10)【关键词】乳清蛋白;抗氧化肽;分离纯化;DPPH自由基;氨基酸序列【作者】吴慧;卢蓉蓉;沈浥;凌玉芳;周蕊【作者单位】江南大学食品学院,江苏,无锡,214122;江南大学食品学院,江苏,无锡,214122;江南大学食品学院,江苏,无锡,214122;江南大学食品学院,江苏,无锡,214122;江南大学食品学院,江苏,无锡,214122【正文语种】中文现代自由基学说指出，活性氧自由基会导致脂质、蛋白质和DNA氧化性退化，激活致癌原，抑制细胞内抗氧化系统等氧化损伤，会引发糖尿病，心血管疾病，神经组织退化紊乱和癌症等多种慢性病的发生［1］。
抗氧化剂由于能清除机体内自由基而具有抗衰老，预防癌症等作用，因此可以作为功能因子用于食品、药品和保健品的开发。
在众多的抗氧化剂种类中，人工合成的抗氧化剂如叔丁基对羟基茴香醚(BHA)、叔丁基对二苯酚(TBHQ)等具有毒副作用，所以安全、高效、无毒的天然抗氧化剂的开发应用成为国内外研究热点。
已有一些研究表明了动植物源蛋白的抗氧化性，例如牛奶蛋白［2］、玉米醇溶蛋白［3］和小麦醇溶蛋白［4］等。
乳清蛋白是干酪的副产物，过去常作为废料未加以利用，关于乳清蛋白的高营养、高功能和高生物价值的报道［5］使得它在各种食品、药物和化妆品中广泛应用。
《驴乳清蛋白酶解肽的抗氧化活性及应用研究》篇一一、引言随着现代生活节奏的加快，人体面临的氧化压力逐渐增大，抗氧化成为了维持身体健康的重要手段。
近年来，驴乳清蛋白作为一种天然的营养来源，其生物活性的研究逐渐受到关注。
本文将着重探讨驴乳清蛋白酶解肽的抗氧化活性及其应用研究，以期为相关领域的研究和应用提供参考。
二、驴乳清蛋白酶解肽的制备驴乳清蛋白酶解肽的制备主要采用酶解法。
首先，收集驴乳清蛋白，然后通过酶的作用将其水解成小分子肽。
在这个过程中，酶的选择、反应条件以及水解程度等因素都会影响最终产物的性质和活性。
三、驴乳清蛋白酶解肽的抗氧化活性研究1. 实验材料与方法采用DPPH自由基清除法、ABTS自由基清除法以及FRAP 法等常用的抗氧化活性检测方法，对驴乳清蛋白酶解肽进行抗氧化活性的评估。
同时，设置对照组，如其他来源的蛋白酶解肽以及合成抗氧化剂等。
2. 实验结果与分析实验结果显示，驴乳清蛋白酶解肽具有较强的抗氧化活性。
在DPPH自由基清除法中，驴乳清蛋白酶解肽的清除率显著高于对照组；在ABTS自由基清除法中，其清除能力也表现出较高的水平。
此外，驴乳清蛋白酶解肽在FRAP法中的还原能力也较强。
这表明驴乳清蛋白酶解肽在抗氧化方面具有较高的生物活性。
四、驴乳清蛋白酶解肽的应用研究1. 食品工业应用由于驴乳清蛋白酶解肽具有较强的抗氧化活性，可以广泛应用于食品工业中。
例如，可以将其添加到乳制品、肉类制品、果汁等食品中，以提高食品的抗氧化性能，延长食品的保质期。
2. 医药领域应用驴乳清蛋白酶解肽的抗氧化活性在医药领域也具有广泛的应用前景。
例如，可以将其用于制备抗衰老药物、抗疲劳药物等，以改善人体的抗氧化能力，提高人体的健康水平。
五、结论本文通过实验研究了驴乳清蛋白酶解肽的抗氧化活性及其应用。
实验结果表明，驴乳清蛋白酶解肽具有较强的抗氧化能力，且在食品工业和医药领域具有广泛的应用前景。
然而，关于驴乳清蛋白酶解肽的具体作用机制以及与其他抗氧化剂的协同作用等方面仍需进一步研究。
《驴乳清蛋白酶解肽的抗氧化活性及应用研究》篇一一、引言抗氧化剂是当前科学研究领域的热门话题之一，随着人们健康意识的提升，寻找安全有效的天然抗氧化物质逐渐受到重视。
而作为自然界生物大分子中最重要的组分之一，蛋白质的酶解产物——肽类，因其具有独特的生物活性和营养价值，在抗氧化领域具有巨大的应用潜力。
本文着重对驴乳清蛋白酶解肽的抗氧化活性及应用进行研究。
二、驴乳清蛋白酶解肽的制备本实验首先对驴乳清蛋白进行酶解处理，得到酶解肽。
采用合适的蛋白酶，在适宜的条件下进行酶解，控制反应时间和温度，使驴乳清蛋白完全分解为肽类物质。
然后通过一系列的分离纯化手段，获得具有特定序列和分子量的肽。
三、驴乳清蛋白酶解肽的抗氧化活性研究1. 抗氧化活性的评价方法本实验采用多种方法评价驴乳清蛋白酶解肽的抗氧化活性，包括DPPH自由基清除实验、ABTS自由基清除实验、超氧阴离子清除实验以及细胞实验等。
这些方法可以从多个角度评价样品的抗氧化性能。
2. 实验结果经过多种实验方法的检测，发现驴乳清蛋白酶解肽具有显著的抗氧化活性。
在DPPH自由基清除实验中，随着浓度的增加，清除率逐渐提高；在细胞实验中，样品的抗氧化性能能有效提高细胞的活性。
此外，经过详细的成分分析，我们得知这些具有抗氧化的多肽的氨基酸序列及结构特点。
四、驴乳清蛋白酶解肽的应用研究1. 在食品领域的应用驴乳清蛋白酶解肽可以作为天然的抗氧化剂添加到食品中，如饮料、乳制品等。
其不仅可以提高食品的营养价值，还能有效延长食品的保质期。
2. 在医药领域的应用由于驴乳清蛋白酶解肽具有显著的抗氧化活性，可以用于制备抗衰老药物、抗疲劳药物等。
此外，其在治疗某些慢性疾病如心血管疾病等方面也具有潜在的应用价值。
五、结论本文研究了驴乳清蛋白酶解肽的制备方法及抗氧化活性，并通过多种方法对其抗氧化性能进行了评价。
结果表明，驴乳清蛋白酶解肽具有显著的抗氧化活性，其在食品和医药领域具有广泛的应用前景。
乳清蛋白降解与活性肽的生成及功能评价乳清蛋白是一种优质的蛋白质来源，它是乳制品中的主要蛋白质组分之一。
乳清蛋白具有高生物利用度和丰富的氨基酸组成，对人体健康具有重要的作用。
然而，乳清蛋白不能直接被人体充分吸收利用，而需要经过降解才能释放出生物活性肽。
本文将探讨乳清蛋白的降解过程、活性肽的生成以及这些活性肽的功能评价。
一、乳清蛋白的降解过程乳清蛋白的降解是指其在消化过程中被酶分解为较小分子量的肽段或氨基酸的过程。
消化酶主要包括胃蛋白酶、胰蛋白酶和肠蛋白酶等。
胃蛋白酶主要作用于乳清蛋白中的酸性蛋白和胰蛋白酶抑制物，将其降解为小肽和氨基酸。
胰蛋白酶则将乳清蛋白完全降解为小肽和氨基酸。
最后，在小肽酶的作用下，小肽进一步降解为自由氨基酸，从而实现乳清蛋白的完全消化。
二、活性肽的生成在乳清蛋白的降解过程中，会生成一系列具有特定生物活性的肽段，称为活性肽。
活性肽的生成主要依赖于乳清蛋白中的特定氨基酸序列以及降解酶的作用。
乳清蛋白中含有丰富的精氨酸、苯丙氨酸和亮氨酸等特殊氨基酸，在酶的作用下可以形成具有草莓酸酶抑制、抗氧化、镇静等功能的活性肽。
三、活性肽的功能评价活性肽的功能评价是对其生物活性进行定量和定性分析的过程。
常用的方法包括对活性肽的抗氧化能力、抗菌活性、免疫调节作用、降血压作用等进行评估。
例如，乳清蛋白中的活性肽具有良好的抗氧化作用，能够清除体内自由基并保护细胞免受氧化应激的伤害。
此外，乳清蛋白中的活性肽还能调节免疫功能，增强人体的免疫力。
四、活性肽的应用前景随着对乳清蛋白活性肽研究的深入，越来越多的研究表明，活性肽具有广泛的应用前景。
首先，活性肽可以用于功能性食品的开发。
功能性食品是指具有特定功效或对人体有益的食品，如保健食品和营养补充剂。
添加乳清蛋白活性肽能够增加产品的附加值，并满足人们对健康食品的日益增长的需求。
其次，活性肽还可以用于药物研发。
研究发现，乳清蛋白活性肽具有抗菌、抗炎、抗氧化等多种生物活性，可以作为新型药物的候选分子。
乳清蛋白肽的酶法制备、分离纯化及活性评价任娇艳;赖婷;江燕清;卢韵君;刘鹏;廖文镇【摘要】以抗氧化活性及蛋白质回收率为筛选指标对乳清蛋白肽酶解工艺进行优化，用层析柱对酶解液进行逐级分离纯化，并对其分子质量进行检测．研究结果表明：利用胰酶、复合风味蛋白酶、木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶酶解制备乳清蛋白肽，最佳用酶为碱性蛋白酶、最适底物含量为4.0％、最适加酶量为8000 U／g、最佳酶解时间为4 h；酶解液经DEAE-52纤维素层析后得到的A组分抗氧化活性最好，其还原力为0.3200±0.0041，DPPH自由基清除率为6.58％±0.36％；A组分再经Sephadex G-15葡聚糖凝胶层析柱分离纯化后得到组分G，其DPPH自由基清除率为6.73％±0.083％；组分G的主要成分为分子质量378 u的肽段，其一级氨基酸组成为赖氨酸（ Lys）、亮氨酸（ Leu）及丝氨酸（ Ser）．%Whey protein peptides were prepared via enzymolysis , and the corresponding conditions were optimized by taking antioxidant activity and protein recovery as two indicators .Then, the enzymatic hydrolysate was separated and purified by means of column chromatography , and the molecular mass of the product was measured .The results indicate that (1) alkaline protease is more suitable for the enzymolysis than trypsogen , flavorzyme and papain, with an optimal substrate dosage of 4.0%, an optimal enzyme dosage of 8000U/g and an optimal enzymolysis time of 4h;(2) fraction A obtained by DEAE-52 cellulose column chromatography exhibits the highest antioxidant activi-ty, with a reducing power value of 0.3200±0.0041 and a DPPH radical scavenging activity of 6.58%±0.36%;(3) further separation of fraction A via Sephadex G-15 gel column chromatographyhelps to obtain fraction G with a DPPH radical scavenging activity of6.73%±0.083%; and (4) the main component identified from fraction G , which contains three amino acids (namely Lys, Leu and Ser), is of a molecular mass of 378u.【期刊名称】《华南理工大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2015(000)002【总页数】7页(P1-7)【关键词】乳清蛋白;酶解;分离;纯化;活性评价;DEAE-52离子交换柱层析;Sephadex G-15葡聚糖凝胶柱层析【作者】任娇艳;赖婷;江燕清;卢韵君;刘鹏;廖文镇【作者单位】华南理工大学轻工与食品学院，广东广州510640;华南理工大学轻工与食品学院，广东广州510640;华南理工大学轻工与食品学院，广东广州510640;华南理工大学轻工与食品学院，广东广州510640;华南理工大学轻工与食品学院，广东广州510640;华南理工大学轻工与食品学院，广东广州510640【正文语种】中文【中图分类】TS252.9乳清蛋白是将牛乳的pH值降低至4.6，沉淀去除酪蛋白后保留在上清液中的多种蛋白质组分的总称，占牛乳总蛋白的20%(质量分数)左右，包括β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、牛乳血清白蛋白、免疫球蛋白、乳铁蛋白及乳过氧化物酶等[1-2] ，且富含必需氨基酸，是一类营养价值较高的优质蛋白.乳清蛋白具有蛋白含量高，脂肪、胆固醇和乳糖含量低的特点，且易消化吸收，具有较高的营养价值[3-4].生物活性肽源于蛋白质，是对生物体的生命活动有重要调节作用的肽类化合物，具有吸收快、效率高等特点.酶解法是目前制备生物活性肽最常见、有效的方法，该方法具有生产条件温和、水解条件易控制且水解产物安全性较高等特点.随着目前乳源活性肽的研究与相关产品的开发，大量研究证明乳清蛋白中含具有免疫调节、降血压、降血糖、降胆固醇、抗菌、抗氧化及抗病毒等生物活性的肽段[5-9].Castro等[10]研究了不同浓度的乳清分离蛋白对B16F10黑色素瘤细胞增殖的影响，发现较低浓度的乳清分离蛋白有利于抑制癌细胞增殖;Pea-Ramos等[11]将乳清分离蛋白的水解物加到熟猪肉饼中，由Protamex酶解的乳清蛋白的抗氧化性显著提高，抑制了共轭二烯和TBARS等脂类氧化中间产物的形成；Ferreira等[12]用胰蛋白酶酶解乳清蛋白制备了ACE抑制肽，并利用PR-HPLC分离得到了肽段ALPMHIR，具有较好的降血压活性.目前关于乳清蛋白的研究多集中在乳清蛋白成分分析[13]、乳清多肽的制备[14-15]、酶解工艺及抗氧化活性 [15-16]等方面，对其分离纯化及分子质量测定的研究相对较少.本研究以WPC80浓缩乳清蛋白粉为原料，酶解制备乳清蛋白肽，并利用控制变量法对乳清蛋白酶解工艺进行优化，以提高乳清蛋白的蛋白质回收率及利用率；之后，将乳清蛋白酶解物过DEAE-52纤维素离子交换柱和Sephadex G-15葡聚糖凝胶层析柱，对乳清蛋白酶解物进行逐级分离纯化，并对分离纯化后组分进行分子质量分析，初步确定乳清蛋白肽一级氨基酸序列组成.1.1 材料与试剂WPC80浓缩乳清蛋白粉，产地为美国哥伦比亚，购自广州市比灵天然配料有限公司；复合风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰酶和碱性蛋白酶，购自南宁庞博生物工程有限公司；DEAE-52纤维素层析柱填料、Sephadex G-15葡聚糖凝胶柱填料，购自广州市齐云生物技术有限公司；α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)基质，购自上海迈瑞尔化学技术有限公司；乙腈，购自瑞典Pharmacia公司；标准混合多肽，购自德国Bruker公司;2,2-Diphenyl-1-picrylhdrazyl(DPPH)，购自美国Sigma公司；牛血清白蛋白，购自上海伯奥生物科技有限公司；其他化学试剂均为分析纯；去离子水为实验室自制.1.2 仪器与设备KDN-1型自动凯氏定氮仪，上海科晓科学仪器有限公司生产；HYP-1020 消化炉，上海书培实验设备有限公司生产；PHS-3C 型pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司生产；HL-2B 数显恒流泵、BS-100A自动部分收集器，上海泸西分析仪器厂有限公司生产；752N 紫外-可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司生产；SHZ-D(III)循环水式真空泵，巩义市予华仪器有限责任公司生产；RE-52A旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂生产；4800 Plus MALDI TOF/TOF Mass质谱仪，(ABI)美国应用生物系统公司生产.1.3 实验方法1.3.1 酶解工艺条件筛选称取适量乳清蛋白，按一定比例加入去离子水，混合均匀后置于50℃水浴锅中预热30min，按不同加酶量(U/g,以每克乳清蛋白为基准计)分别加入各种蛋白酶，酶解温度为50℃，在各酶最适pH值条件下(胰酶：2×105U/g，pH=8.0;复合风味蛋白酶：2×105U/g ，pH=7.0；木瓜蛋白酶：2×105U/g ，pH= 7.0；碱性蛋白酶：2×105U/g ，pH =9.0)进行酶解，酶解结束后于100℃煮沸10min灭酶，然后于4℃、8000r/min下离心20min，过滤，收集上清液，于4℃冰箱中保存.1.3.1.1 最适水解酶的筛选按上述酶解工艺，在乳清蛋白质量分数为6.0%、加酶量为8000U/g的条件下，分别加入胰酶、复合风味蛋白酶、木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶，在其最适pH值条件下，酶解4h，离心后收集上清液待测，选择最适水解酶.1.3.1.2 最适乳清蛋白质量分数的筛选按上述酶解工艺，以碱性蛋白酶进行酶解，设计乳清蛋白质量分数分别为2.0%、4.0%、6.0%、8.0%和10.0%，加酶量为8000U/g，酶解4h，离心后收集上清液待测，选择最适乳清蛋白质量分数.1.3.1.3 最适加酶量的筛选按上述酶解工艺，设计加酶量分别为4000、6000、8000、10000和12000U/g，以碱性蛋白酶进行酶解，乳清蛋白质量分数为4.0%，酶解4h，离心后收集上清液待测，选择最优加酶量.1.3.1.4 最适酶解时间的筛选按上述酶解工艺，以碱性蛋白酶进行酶解，乳清蛋白质量分数为4.0%，加酶量为8000U/g，设计酶解时间分别为4、8、12h，离心后收集上清液待测，探究最优酶解时间.1.3.2 蛋白质回收率测定采用凯氏定氮法，参照GB 5009.5—85，分别测定原料蛋白质质量、酶解液的蛋白质质量分数及酶解后上清液质量，按下式计算蛋白质回收率(H)：×100%.式中：C为酶解液蛋白质质量分数，%；M为酶解离心过滤后上清液的质量，g；m为原料蛋白质的质量，g.1.3.3 DPPH自由基清除率DPPH自由基清除率的测定参照文献[17]的方法.用2mL去离子水与2mL 95%乙醇溶液混合后进行调零；取2mL DPPH溶液(0.2mmol/L)置于试管中，加入2mL 样品液，混匀后在室温下避光反应30min，在波长517nm处测定吸光值，记为Ai；将2mL样品液与2mL 95%乙醇的混合液作为对照样，在波长517nm处测定吸光值，记为Aj；用2mL DPPH溶液与2mL 95%乙醇的混合液作为空白样，在波长517nm处测定吸光值，记为Ac.DPPH自由基清除率按下式计算：DPPH自由基清除率%.1.3.4 还原力测定还原力测定参照文献[18]的方法并有所改良.取溶解在磷酸盐缓冲液(0.2mmol/L，pH=6.6)中的多肽样品2mL，与2mL磷酸盐缓冲液(0.2mmol/L，pH=6.6)混合振匀，加入2mL铁氰化钾溶液(1%，质量分数)，混匀后于50℃保温20 min；之后加入2mL 三氯乙酸(10%，质量分数)，于3000r/min离心10min；离心后取上清液2mL，加入2mL去离子水和0.4mL 氯化铁溶液(0.1%，质量分数)并混匀，10min后测定其在700nm处的吸光值，记为A1.空白对照为以缓冲液代替样品溶液，700nm处的吸光值记为A0.还原力按下式进行计算：还原力=A1-A0.1.3.5 DEAE-52纤维素层析柱分离纯化DEAE-52纤维素填料经0.5mol/L的盐酸浸泡、去离子水冲洗、0.5mol/L的氢氧化钠溶液浸泡、去离子水冲洗等步骤进行预处理后装柱.称取4~5g乳清蛋白酶解液(约合160~200mg多肽)上样，依次用3种流动相进行梯度洗脱：去离子水、0.1mol/L的NaCl溶液及0.3mol/L的NaCl溶液，设定分离流速为0.5mL/min，自动部分收集器收集洗脱液.将收集的分离液经旋转蒸发仪浓缩后，用双缩脲法[19]测定各组分的蛋白质含量.1.3.6 Sephadex G-15葡聚糖凝胶层析柱分离纯化将经DEAE-52分离后的组分进一步用Sephadex G-15分离纯化.称取6~8mL样品沿柱内壁缓慢加入后，以0.5mL/min的流速加入去离子水进行洗脱；使用自动部分收集器进行收集，收集液经旋转蒸发器浓缩后，测定分离组分的抗氧化活性. 1.3.7 MALDI-TOF-MS分析[20]配制乙腈-超纯水混合液(其中乙腈与超纯水的体积比为1：1，TFA的体积分数为0.1%)作为溶剂备用，将CHCA溶于上述溶剂中，制成饱和溶液，离心，取上清液得到基质溶液.将标准混合多肽和样品分别与基质溶液按体积比1：1混合均匀，取1μL滴在MALDI靶板上，于室温自然干燥后，将样品板放进离子源中进行测定，累计10次单次扫描信号为最终质谱图.1.3.8 统计分析文中数据均为3次平行测定值的平均值.利用软件Excel 2007及Origin 8.5对数据进行方差分析(ANOVA)及绘图，在显著性水平P=0.05下，进行数据统计与分析，结果表示为“均值±标准差”的形式.2.1 最佳酶解工艺条件的筛选结果2.1.1 最佳水解酶的筛选结果经不同酶酶解得到的酶解液的还原力、DPPH自由基清除率和蛋白质回收率如表1所示.由表1 可知:以不同的酶酶解得到的乳清蛋白酶解液在质量浓度为10g/L时，复合风味蛋白酶和碱性蛋白酶酶解液的还原力(还原力活性以吸光值进行表征)最高，吸光值均达到0.35，显著高于其他酶解液(P< 0.05)；当各酶解液质量浓度为5g/L 时，碱性蛋白酶酶解液的DPPH自由基清除率最高，亦显著高于其他酶解液(P< 0.05)；就蛋白质回收率而言，木瓜蛋白酶及碱性蛋白酶酶解液相对较高.综合还原力和DPPH自由基清除率来看，经碱性蛋白酶酶解后的乳清蛋白酶解液具有最高的活性，再以蛋白质回收率作为辅助筛选指标，最终选择碱性蛋白酶为乳清蛋白的最适水解用酶.2.1.2 最适乳清蛋白质量分数、加酶量及酶解时间的筛选结果不同酶解条件对酶解液蛋白质回收率的影响如图1所示.由图1(a)可知:当乳清蛋白质量分数为2.0%及4.0%时，乳清蛋白酶酶解液的蛋白质回收率较高，为84%左右，两者无显著性差异(P > 0.05)；当乳清蛋白质量分数大于4.0 %时，乳清蛋白酶酶解液的蛋白质回收率随着乳清蛋白质量分数的增加而不断降低，当乳清蛋白质量分数为12.0%时，酶解液的蛋白质回收率降到40%左右.由于随着乳清蛋白质量分数增加，酶反应速率不断增加，当乳清蛋白质量分数为2.0%和4.0%时，蛋白质回收率无显著性差异，故选择乳清蛋白质量分数为4.0%，以获得更高的酶反应速率.由图1(b)可知:当加酶量为4000和6000U/g时，酶解液的蛋白质回收率无显著性差异(P> 0.05)，随加酶量的增加，酶解液的蛋白质回收率持续增加，当加酶量为8000U/g时，蛋白质回收率达到最大，为82%左右，显著高于其他样品(P < 0.05).加酶量继续增加时，酶解液的蛋白质回收率呈下降再上升趋势，但均未超过加酶量为8000U/g时的蛋白质回收率.因此，选择8000U/g为最适加酶量.由图1(c)可知，随酶解时间的延长，乳清蛋白酶酶解液的蛋白质回收率呈先增加再降低的趋势，当酶解时间为4h时，酶解液的蛋白质回收率达到最大，为82%左右，显著高于其他酶解液(P < 0.05)，这是因为当酶解时间小于4h时，底物未酶解完全，而超过4h后，底物彻底酶解，故继续增加酶解时间对蛋白质回收率无显著影响.故选择4h为最适酶解时间.综上所述，筛选出碱性蛋白酶为最佳水解酶，最适乳清蛋白质量分数为4.0%，最适加酶量为8000U/g，最佳酶解时间为4h.2.2 乳清蛋白肽的分离纯化及活性鉴定2.2.1 DEAE-52纤维素层析柱分离纯化乳清蛋白肽及其活性鉴定利用DEAE-52层析柱对乳清蛋白进行初步分离，分离的洗脱图如图2所示，管号1-100的洗脱液为去离子水，管号101-200的洗脱液为0.1mol/L的NaCl溶液，管号201-300的洗脱液为0.3mol/L的NaCl溶液，洗脱速度均为0.5mL/min. 由图2可知，经去离子水、0.1mol/L的 NaCl溶液及0.3mol/L的NaCl溶液洗脱后得到3个峰，收集管号15-55的洗脱液合并，浓缩后得到乳清蛋白肽A组分；收集管号119-215的洗脱液合并，浓缩后得到乳清蛋白肽B组分；收集管号220-255的洗脱液合并，浓缩后得到乳清蛋白肽C组分.分离后的A、B、C组分的蛋白质量浓度分别为2.49、6.75和1.33g/L.当3个组分的蛋白质量浓度均为1g/L时，其抗氧化活性(还原力及DPPH自由基清除率)检测结果如图3所示.由图3可知，当3个组分的蛋白质量浓度均为1g/L时，A组分的还原力最高，即抗氧化活性最强，吸光值为0.3200±0.0041，与其他两个组分的吸光值有显著性差异(P < 0.05)；当3个组分的蛋白质量浓度均为1g/L时，组分A和组分B的DPPH自由基清除率无显著性差异(P >0.05)，均高于组分C.综上，组分A较组分B、C具有更好的抗氧化活性，故选择组分A进一步用Sephadex G-15葡聚糖凝胶层析柱进行分离纯化.2.2.2 Sephadex G-15 葡聚糖凝胶层析柱分离纯化乳清蛋白肽及其活性鉴定以去离子水为洗脱液对乳清蛋白肽组分A溶液进行洗脱，洗脱速度为0.5mL/min，经Sephadex G-15葡聚糖凝胶层析柱分离后，洗脱图如图4所示.由图4可知，用去离子水洗脱得到一个目标峰，即经Sephadex G-15葡聚糖凝胶层析柱分离后，得到相对较纯的乳清蛋白肽.收集管号18-80的洗脱液合并，浓缩后得到乳清蛋白肽组分G，测得其蛋白质质量浓度为1.79g/L.由于乳清蛋白肽组分A对DPPH自由基清除能力较为敏感，且DPPH自由基较稳定，故实验中测定物质的DPPH自由基清除率具有较好的稳定性和重现性，因此用DPPH自由基清除率评价经Sephadex G-15葡聚糖凝胶层析柱分离后的乳清蛋白肽组分G，并将其与乳清蛋白肽A组分做比较.DPPH自由基清除率如图5所示.由图5可知，经Sephadex G-15葡聚糖凝胶层析柱分离后的组分G的DPPH自由基清除率为6.730% ± 0.083%，与乳清蛋白肽组分A的DPPH自由基清除率无显著性差异(P > 0.05)，即乳清蛋白肽组分A和G均具有最好的抗氧化活性，进一步分离纯化并未降低乳清蛋白肽的抗氧化活性.2.3 乳清蛋白肽的结构鉴定乳清蛋白肽组分G及基质溶液的MALDI-TOF-MS一级质谱图如图6所示.由图6可知，图谱中有10个主要的质子峰，信号最强的质子峰对应的m/z 为378.801，其他3个较强信号的质子峰对应的m/z 分别为425.017、538.295和611.343，说明组分G中的多肽分子质量均小于700u，且组分G中的主要成分为分子质量 378u的肽段，结合氨基酸分析推测其一级氨基酸组成为赖氨酸(Lys)、亮氨酸(Leu)及丝氨酸(Ser).文中对乳清蛋白肽酶解工艺进行了优化，用层析柱对酶解液进行逐级分离纯化，并对其分子质量进行检测,得出以下主要结论：(1)制备乳清蛋白肽最佳用酶为碱性蛋白酶，最适乳清蛋白质量分数为4.0%，最适加酶量为8000U/g，最佳酶解时间为4h.(2)用DEAE-52纤维素离子交换柱对乳清蛋白酶解物进行分离纯化后，得到A、B、C3个组分，其中组分A抗氧化活性最高.(3)选取组分A进行Sephadex G-15葡聚糖凝胶柱分离纯化，分离所得组分G进行MALDI-TOF-MS质谱检测，得出乳清蛋白肽中抗氧化活性较高的肽段分子质量集中在300~700u，结合氨基酸分析推测其一级氨基酸组成为Lys、Leu及Ser.【相关文献】[1] 魏华,杨史良,徐锋,等.乳清蛋白质的生物学特性和保健功能 [J].天然产物研究与开发,2007,19(1):161-168.Wei Hua,Yang Shi-liang,Xu Feng,et al.Biological characteristics and health-maintaining functions of whey protein [J].Natural Production Researches Development,2007,19(1):161-168.[2] 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