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蛋白纯化硫酸铵沉淀盐析法The manuscript was revised on the evening of 2021蛋白纯化硫酸铵沉淀盐析还能想起那些在荧屏中曾经震撼过我们，具有超能力的英雄么？蜘蛛侠，敏捷，灵活迅速飞流直下，忽闪直冲高楼；绿巨人浩克，力量，速度，耐力，在我们的想象力中膨胀；还有，我们随身携带星形盾牌，品格高尚的美国队长……幻想里中的人物形象存在我们的记忆力，然而生物背景出身的我们，总归要锻炼出属于自己的实验技能，即便是相同的实验步骤，每个人做出来的结果也不尽相同，差别在哪？反复练习，用心总结出属于自己的心得，转化为自己的实验“超能力”吧。
本文总结了蛋白纯化硫酸铵沉淀详细的实验原理、步骤，供大家参考。
-------锻炼属于我们自己的实验“超能力”之一我是超级蜘蛛精看我有劲儿不？冲啊，我是美国队而我是一只冷静的科研小蜗牛这次，我们所要分享的便是一种很常见，但是也很重要的蛋白质纯化方法：硫酸铵沉淀蛋白法，一起走进实验室吧。
硫酸铵沉淀法是粗分离蛋白时常用的纯化和浓缩蛋白的技术。
蛋白质的溶解度和盐浓度密切相关，在低浓度的条件下，随着盐浓度的增加，蛋白质的溶解度增加；但在高浓度的盐溶液里，盐离子竞争性的结合蛋白表面的水分子，破坏蛋白表面的水化膜，溶解度降低，蛋白质在疏水作用下聚集形成沉淀。
每种蛋白质的溶解度不同，因此可以用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。
硫酸铵的溶解度大，解离形成大量的NH4+、SO42-离子，会结合大量的水分子，使蛋白质的溶解度下降，另外，其温度系数小，不易使蛋白质变性，因此，蛋白质粗分离时硫酸铵沉淀法是很重要的一种技术，后续可采用层析技术进一步纯化蛋白，效率更高。
硫酸铵沉淀法是常用的分离免疫球蛋白的方法。
各种不同蛋白质盐析需要不同浓度的硫酸铵溶液。
在实验中建议配置不同梯度浓度的硫酸铵溶液来确定蛋白质沉淀所需的最佳浓度。
（1）参照如下表格配置不同浓度的硫酸铵溶液；例如，在25 ℃条件下，配置饱和度为100 %的硫酸铵溶液，称取767 g的硫酸铵固体，边搅拌边加入到1 L的蒸馏水中，完全溶解后，用氨水或者硫酸调节pH到。
硫酸铵沉淀时间
硫酸铵沉淀时间是指在一定条件下，硫酸铵在溶液中形成的沉淀所需的时间。
硫酸铵是一种常用的化学试剂，广泛应用于化学分析、冶金、医药等领域。
硫酸铵沉淀时间的测定对于分析数据的准确性和可靠性至关重要。
硫酸铵沉淀时间的影响因素有很多，主要包括温度、浓度、
pH值、搅拌速度等。
其中，温度是影响硫酸铵沉淀时间最为
显著的因素之一。
一般来说，温度越高，硫酸铵沉淀时间越短；反之，温度越低，硫酸铵沉淀时间越长。
此外，硫酸铵浓度、pH值等因素也会对硫酸铵沉淀时间产生一定的影响。
硫酸铵沉淀时间的测定方法有很多种，常用的包括比色法、电导法、滴定法等。
其中，比色法是一种简单易行、准确可靠的测定方法。
具体步骤如下：
1.将待测溶液加入试管中，加入适量的硫酸铵和硫酸钡溶液。
2.用玻璃棒搅拌均匀，然后静置一段时间。
3.观察溶液中是否有白色沉淀生成，如果有，则说明硫酸铵已
经沉淀。
4.记录下静置时间t，即为硫酸铵沉淀时间。
需要注意的是，在测定硫酸铵沉淀时间时，应该尽量保持实验条件的一致性，以提高测定结果的准确性和可重复性。
此外，还应该选择合适的测定方法和仪器设备，以满足实验要求。
总之，硫酸铵沉淀时间是化学分析中一个非常重要的参数，对于保证分析数据的准确性和可靠性具有重要意义。
在实际应用中，需要根据具体情况选择合适的测定方法和条件，以获得更为准确和可靠的结果。
硫酸铵沉淀蛋白的原理
硫酸铵沉淀蛋白是一种常用的蛋白质纯化方法。
其原理主要基于蛋白质在高浓度的硫酸铵溶液中会发生相互作用而沉淀出来，达到分离和富集蛋白质的目的。
硫酸铵具有许多对蛋白质有影响的性质，如可增加溶液的离子强度、改变蛋白质的整体电荷等。
在高浓度的硫酸铵溶液中，由于离子强度的增加，水分子围绕蛋白质的结构发生解淋的变化，导致蛋白质之间发生疏水性相互作用而沉淀。
硫酸铵沉淀蛋白的方法通常涉及以下几个步骤：
1. 溶液制备：将待纯化的蛋白质样品溶解在适当的缓冲液中，并调节pH至适宜范围。
2. 添加硫酸铵：将硫酸铵以适当的比例逐渐加入溶液中，使溶液中的硫酸铵浓度逐步增加。
在每次添加硫酸铵后，需充分混合溶液，以促使蛋白质发生沉淀反应。
3. 沉淀：随着硫酸铵的加入，蛋白质逐渐发生相互作用，形成可见的白色沉淀。
通常，硫酸铵的饱和度约为80%时，蛋白
质沉淀效果较好。
4. 收集沉淀：将沉淀通过离心或过滤等方法进行分离和收集。
收集到的沉淀即为富含目标蛋白质的沉淀物。
需要注意的是，在硫酸铵沉淀蛋白的过程中，溶液pH的控制
十分重要。
过高或过低的pH值都可能导致蛋白结构的改变或失活。
因此，在实验中需要根据具体蛋白质的特性和需求进行合理的 pH 范围选择。
此外，硫酸铵沉淀可能会与一些溶解蛋白质的缓冲液成分相互干涉，因此在实验中要避免这类干扰，选择合适的缓冲体系。
质粒硫酸铵沉淀是一种常用的质粒纯化方法，其基本原理是利用硫酸铵在高浓度下能够使DNA分子溶解度降低而蛋白质分子的溶解度相对较高，从而实现质粒与蛋白质的分离。
具体操作步骤如下：
1. 将含有质粒的大肠杆菌菌落接种到LB培养基中，在37℃下培养至菌落生长到适当密度（一般为OD600为0.5-1.0）。
2. 加入适量的SDS（十二烷基硫酸钠），使细胞破裂，释放出DNA分子。
3. 离心收集上清液，去除细胞碎片和其他杂质。
4. 将上清液加入高浓度的硫酸铵（一般为2.5 M），直到硫酸铵溶液的终浓度达到50%（v/v）。
此时，DNA分子已经沉淀下来，而大部分蛋白质分子仍保持在溶液中。
5. 缓慢加入等体积的乙醇，使溶液中的硫酸铵沉淀完全，并防止乙醇对DNA的损伤。
6. 离心沉淀，去除乙醇和其他杂质。
7. 将沉淀物溶解在TE缓冲液中，用酚/氯仿提取DNA，用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和质量。
需要注意的是，硫酸铵沉淀法只能用于质粒DNA的纯化，不能用于基因组DNA的纯化。
另外，由于硫酸铵沉淀法的操作比较繁琐，需要注意操作规范和安全，避免硫酸铵和乙醇对操作人员造成伤害。
IgG的分离与提纯-硫酸铵沉淀法以抗原免疫动物来制备的抗血清是一个非常复杂的混合物，包括血清的全部成分。
但是同抗原特异性结合的抗体则主要是血清中的免疫球蛋白组分。
通常用于制备酶标抗体或荧光抗体的免疫球蛋白必须高度纯化并具有特异性，不应含有非抗体的血清蛋白。
因此，为了浓缩和提高抗体的效价，或为制备免疫球蛋白特异性抗体时，通常也需要分离和纯化免疫球蛋白。
γ球蛋白（IgG）是血清免疫球蛋白的主要成分，约占全部免疫球蛋白的75％，因此，抗体的分离纯化主要是分离纯化IgG。
纯化IgG小量几十ml的话，用protein A或protein G就可以，疏水柱等也可以纯化；大量的话，上百ml，可以使用streamline protein A。
之前根据载量估计一下需要的柱子体积。
实验室中常用硫酸铵沉淀后过DEAE 纤维素柱，比较简便可获较纯的抗体。
下面以此方法为例介绍IgG的分离与提纯。
材料与试剂配制1. 动物血清2. 硫酸铵饱和溶液硫酸铵800g~850gH2O 1 000ml加热至绝大部分溶质溶解为止，趁热过滤，置室温过夜，然后以28％NH4OH调pH至7.0（不调pH值也可以）。
注：硫酸铵以质量优者为佳，因次品中含有少量重金属对蛋白质巯基有影响。
如次品必须除去重金属，可在溶液中通入H2S，静置过夜后滤过，加热蒸发H2S即可。
3. 0.01Mol/L pH7.4PB液A液：0.10Mol/L NaH2PO4液NaH2PO4·2H2O 15.60g加H2O至1 000.mlB液：0.10Mol/L Na2HPO4液Na2HPO4·12H2O 35.80g加H2O至1 000ml取A液19ml，B液81ml加水至1 000ml即可。
4. 1％BaCl2溶液5. 纳氏液HgI 115.00gKI 80.00g加H2O至500.00ml溶化后过滤，然后再加20％NaOH500.00ml，混合即可。
硫酸铵沉淀蛋白质原理蛋白质是生命体内最基本的分子之一，它们在细胞的结构和功能方面发挥着重要作用。
蛋白质的分离和纯化是生物学和生物化学研究的基础，而硫酸铵沉淀法是一种常用的蛋白质分离和纯化方法。
硫酸铵沉淀法是一种基于蛋白质在不同浓度的硫酸铵溶液中溶解度变化的原理。
蛋白质在水中的溶解度受到其氨基酸成分和结构的影响，不同的蛋白质在不同的条件下溶解度也不同。
硫酸铵是一种常用的盐类，可以在一定浓度下沉淀蛋白质。
硫酸铵沉淀法的原理是，通过逐渐增加硫酸铵的浓度，使得蛋白质在不同浓度的硫酸铵溶液中的溶解度发生变化，从而实现蛋白质的分离和纯化。
硫酸铵沉淀法的步骤如下：1. 将待分离的混合物加入到一定浓度的硫酸铵溶液中，并在室温下搅拌一段时间，使得蛋白质逐渐沉淀。
2. 将悬浮液离心，将上清液倒掉。
3. 用一定浓度的硫酸铵溶液洗涤沉淀，去除杂质。
4. 用一定浓度的硫酸铵溶液重悬沉淀，使其重新溶解。
5. 将重悬液进行透析或柱层析等纯化方法，得到纯化的蛋白质。
硫酸铵沉淀法的优点是简单易行，操作方便，不需要昂贵的设备和试剂，适用于大规模蛋白质分离和纯化。
同时，硫酸铵沉淀法可以同时分离多种蛋白质，因此也常用于蛋白质组学等领域的研究。
然而，硫酸铵沉淀法也存在一些缺点。
首先，硫酸铵沉淀法不能有效地分离水溶性和不溶性蛋白质。
其次，在硫酸铵沉淀的过程中，蛋白质可能会发生部分失活或降解，影响其纯度和活性。
此外，硫酸铵沉淀法也不能有效地分离具有相似分子量或等电点的蛋白质。
总之，硫酸铵沉淀法是一种常用的蛋白质分离和纯化方法，其原理基于蛋白质在不同浓度的硫酸铵溶液中溶解度的变化。
虽然硫酸铵沉淀法存在一些缺点，但其简单易行的特点使得它在大规模蛋白质分离和纯化方面具有广泛的应用前景。
硫酸铵沉淀原理
硫酸铵沉淀法的基本原理:这是一种从大量粗制品中提取并部分提纯蛋白质的方法。
主要是通过将免疫球蛋白从试样中分离，通常采用的方法是：高浓度的盐离子蛋白溶液和蛋白质的水分子发生竞争，导致其水和蛋白质分子减弱，通过溶解度从溶液沉淀出来。
因不同的蛋白质溶解度相同，所以用相同的盐溶液进行沉淀，称为盐析。
盐的含量一般用饱和度来表示，而硫酸铵由于具有较高的溶解度，较低的温度系数，容易引起蛋白的变性，因此得到广泛的应用。
透析袋在使用前如何处理透析已成为生物化学实验室最简便最常用的分离纯化技术之一。
在生物大分子的制备过程中，除盐、除少量有机溶剂、除去生物小分子杂质和浓缩样品等都要用到透析的技术。
透析只需要使用专用的半透膜即可完成。
通常是将半透膜制成袋状，将生物大分子样品溶液置入袋内，将此透析袋浸入水或缓冲液中，样品溶液中的大分子量的生物大分子被截留在袋内，而盐和小分子物质不断扩散透析到袋外，直到袋内外两边的浓度达到平衡为止。
保留在透析袋内未透析出的样品溶液称为“保留液”，袋（膜）外的溶液称为“渗出液”或“透析液”。
透析的动力是扩散压，扩散压是由横跨膜两边的浓度梯度形成的。
透析的速度反比于膜的厚度，正比于欲透析的小分子溶质在膜内外两边的浓度梯度，还正比于膜的面积和温度，通常是4℃透析，升高温度可加快透析速度。
透析膜可用动物膜和玻璃纸等，但用的最多的还是用纤维素（再生纤维素RC、纤维素酯CE、PVDF等）制成的透析膜，目前常用的是美国美国光谱医学公司（spectrum，上海欧韦达仪器科技有限公司是中华区特约总经销）和美国Union Carbide （联合碳化物公司，上海欧韦达仪器科技有限公司是华东区特约经销商）生产的各种尺寸的透析管，截留分子量MwCO（即留在透析袋内的生物大分子的最小分子量，缩写为MwCO）大概有100、500、1000、2000、3500、8000、10000、15000、20000、25000、50000、100000、250000、500000、1000000等种类，单位为道尔顿（D）。
商品透析袋制成管状，其扁平宽度为8 mm～77 mm不等。
为防干裂，出厂时都用10％的甘油处理过，并含有极微量的硫化物、重金属和一些具有紫外吸收的杂质，它们对蛋白质和其它生物活性物质有害，用前必须除去。
透析膜可用动物膜和玻璃纸等，但用的最多的还是用纤维素制成的透析膜，目前常用的是美国Union Carbide （联合碳化物公司）和美国光谱医学公司生产的各种尺寸的透析管，截留分子量MwCO（即留在透析袋内的生物大分子的最小分子量）通常为1万左右。
硫酸铵盐沉淀法和乙酸沉淀法沉淀乳清蛋白结果的影
响因素
1、蛋白自身性质
如膜蛋白及一些疏水性高的蛋白就很容易发生疏水聚合而沉淀，做过膜蛋白提取以及包涵体溶解时都有切身体会。
在表达还有二硫键键的蛋白时特别容易形成包涵体蛋白，所以蛋白的氨基酸序列中，含硫氨基酸较多时也容易形成沉淀。
2、pH值
蛋白质大多数都在高pH时溶解性高，低pH时易沉淀，这可能与氢键的形成有关。
但有时候更低pH时蛋白又溶解了，这一现象在我们用亲和层析纯化抗体时特别常见。
盐浓度就是盐析效应，高浓度的盐破坏蛋白的水化层，使得蛋白质聚集沉淀，常用的就是硫酸铵沉淀。
盐析沉淀通常对蛋白质的高级结构没有破坏，再溶时活性可以完全恢复。
常见的例子就是硫酸铵沉淀纯化IgG。
同样，硫酸铵沉淀也常碰到不可逆的情况，例如大肠杆菌(Escherichiacoli)表达的重组蛋白往往在硫酸铵沉淀后再溶困难。
3、有机溶剂
例如丙酮沉淀，但有机溶剂也不是全部对蛋白起沉淀作用，有时候也有助溶作用。
例如有些膜蛋白的有机溶剂抽提。
4、温度
高温或低温都有可能使得蛋白质沉淀。
煮沸沉淀常见了，低温沉淀的例子有血液制品的冷乙醇沉淀。
5、表面活性剂
对蛋白质有助溶作用。
例如做电泳的SDS就是很强的表面活性剂，还有TWEEN，Triton等等。
6、还原剂
还原剂往往对蛋白质有助溶作用。
有些蛋白当加入的还原剂在空气中慢慢氧化后，就会沉淀析出。
变性剂如尿素、盐酸胍，包涵体蛋白在用变性剂溶解后，再去除变性剂经常会沉淀析出。
2006 年2 月 Journal of Chemical Engineering of Chinese Universities Feb. 2006文章编号利用生产纳豆激酶的Bacillus subtilis进行深层发酵20Superdex 75凝胶过滤层析和SP Sepharose Fast Flow离子交换层析对活性组分进行分离提纯并用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)对分离纯化的效果进行了检验分子量27.7 kD关键词凝胶层析ASeparation and Purification of Nattokinase Produced by Bacillus Subtilis with Ammonium Sulfate Precipitation and ChromatographyGAO Da-hai1, MEI Le-he1, SHENG Qing2, XU Jing3, LIN Dong-qiang1, YAO Shan-jing1(1. Department of Chemical and Biochemical Engineering, Zhejiang University, Hangzhou 310027, China;2. College of Life Science, Zhejiang University of Science and Technology, Hangzhou 310018, China;3. Hangzhou East-China Pharmaceutical Company, Hangzhou 310011, China)Abstract:In order to obtain high purity nattokinase from the fermentation broth of Bacillus subtilis, some separation and purification techniques were explored. The optimized separation and purification process includes the following steps: removing cells by the centrifugation, 20%~60% saturation ammonium sulfate precipitation, gel filtration chromatography with Superdex 75 and ion-exchange chromatography with SP Sepharose Fast Flow. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) was used to examine the purification effect, and the results indicate that the final product obtained is homogeneous and has a molecular weight around 27.7 kD. The fibrinolytic activity of the nattokinase was measured by means of fibrin plate method. The purification factor and activity recovery of the nattokinase are 8.4 and 49%, respectively. The specific activities of purified nattokinase could reach 28530IU⋅mg−1. The results demonstrate that the combination of bioseparation process of ammonium sulfate precipitation with gel filtration and ion exchange chromatography is suitable for the separation and purification of nattokinase from culture broth of Bacillus subtilis. Especially for lab scale, the process mentioned above can be easily performed as an efficient way to prepare pure nattokinase with high yield.Key words:nattokinase; purification; gel filtration; ion-exchange chromatography1前言血栓性疾病严重威胁着人类的生命与健康2004-03-19基金项目３０５７０４１１）浙江省回国人员基金项目高大海(1980-)±±¾©ÈË通讯联系人meilh@选方法如尿激酶存在半衰期短难以成为适用的大众药品[1]ËüÓɴ󶹷¢½ÍÖƳÉÈÕ±¾µÄÐë¼ûÑóÐнÌÊÚ¿¼²ìÁË173种食品对血栓的溶解作用定名为纳豆激酶(nattokinase, NK)[2]NK是一种丝氨酸蛋白酶并能刺激静脉内皮细胞产生纤溶酶原激活剂(t-PA)传统的纳豆激酶的分离方法主要是以纳豆为原料Sephadex 凝胶过滤层析由于从纳豆中提取经过多步分离而采用深层发酵获得的含纳豆激酶发酵液活力高所以本文主要研究了从发酵液中分离提纯纳豆激酶的工艺条件2材料和方法2.1实验材料菌种纤维蛋白原(Fibrinogen)为Sigma公司产品凝胶层析介质Superdex 75µçÓ¾ÒÇMini-PROTEAN 3system为Bio-RAD公司产品木糖由开化木糖厂生产巴比妥钠为中国医药集团上海化学试剂公司生产LB固体培养基 5 g⋅L−1酵母提取物１５ ｇ⋅L−1琼脂采用LB液体培养基 5 g⋅L−1酵母提取物 ｐＨ７．０胰蛋白胨 22.7 g⋅L−1Na2HPO4 5.37 g⋅L−1CaCl20.2 g⋅L−1发酵条件以4酶活测定参照Astrup法制备纤维蛋白平板[7]2050·ÅÖÃ10 min培养箱计算各溶圈面积以标准酶活力为横坐标冷冻离心离心时间10 min将研细的(NH 4)2SO4按照20再在10000 r⋅min−1下离心30 min取上清液加硫酸铵至60%饱和度下保存过夜第20卷第1期 高大海等弃去上清液2.4.2 Superdex 75凝胶层析用上述酶液以1.0 mL ⋅min −1的流速进行Superdex 75凝胶层析2.4.3 Sepharose Fast Flow 离子交换层析将Superdex 75凝胶层析的洗脱液合并用磷酸缓冲液洗柱后分部收集洗脱液标准蛋白的分子量分别为取100mL 加入硫酸铵达到20%饱和度离心弃去上清结果如表1所示纯化倍数和回收率分别为1.8和80.6³ýÈ¥¹ÌÌå¿ÅÁ£ÖùÌå»ýΪ24mL上柱前预先用10mmol ⋅L −1ÉÏÖùºóÓÃÉÏÊö»º³åҺϴÍÑÖÁÔÚ280nm 波长无光吸收发现第45号试管所对应的就是纳豆激酶的吸收峰还起到了脱盐的作用因为经过硫酸铵沉淀得到的粗酶中离子强度非常高甚至完全丧失吸附能力凝胶层析的纯化倍数为3.95号试管混合并进行SDS-PAGE 分析(图4)·Ö×ÓÁ¿²î±ð²»´ó图1 Superdex 75 凝胶层析的洗脱曲线 Fig.1 Superdex 75 gel filtration of nattokinaseafter salting-out with ammonium sulfate表2 Superdex 75 凝胶层析分离纳豆激酶 Table 2 Superdex 75 gel filtration of nattokinaseSample Eluent Total activities of NK/IU 181700 141330 Total protein / mg 30 6.0 Recovery of NK / % 100 77.8 Recovery of protein / % 100 20 Specific activities / IU ⋅mg −16057 23555 Purified factor13.966 高 校 化 学 工 程 学 报 2006年2月Fig.2 CM Sepharose Fast Flow IEC of nattokinase after Superdex 75gel filtrationFig.3 SP Sepharose Fast Flow IEC of nattokinase afterSuperdex 75 gel filtration3.3 离子交换层析纯化选择离子交换进一步分离提纯纳豆激酶且在pH 6~12的范围性质稳定[7]10 mmol ⋅L −1 pH 6.4的磷酸缓冲液作为平衡液从两种介质的分离图谱分析ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ的洗脱曲线见图3¶øÇҴ󲿷ÖÄɶ¹¼¤Ã¸²¢Ã»ÓÐÎü¸½ÔÚ½éÖÊÉ϶øSP 离子交换介质的分离效果明显好于CM将洗脱液进行SDS-PAGE 电泳检测这个结果说明经过离子交换层析的分离从表中可以看出离子交换的纯化倍数和回收率分别为1.2和78.7(1) 由于分离样品属于胞外产物(3) 经离子交换后这与文献报道的NK的精确分子量27,782相符[8]表3 SP Sepharose Fast Flow 层析分离纳豆激酶Table 3 SP Sepharose Fast Flow ion-exchange chromatography ofnattokinaseSample Eluent Total activities of NK/IU 141330 111270 Total protein / mg 6.0 3.9 Recovery of NK / % 100 78.7 Recovery of protein / % 100 65.0 Specific activities / IU ⋅mg −123555 28530 Purified factor11.2Lane 1-molecular weight standard proteins; Lane 2-fermentation broth; Lane 3-Superdex 75 gel filtration; Lane 4-SP Sepharose Fast Flow ion-exchange chromatography.图4 经过分离后的SDS-PAGE 电泳图 Fig.4 SDS-PAGE of purified nattokinasekD 97.0 66.0 45.0 30.0 20.114.41 2 3 427.7kD第20卷第1期高大海等最终确定的分离纯化路线是所得沉淀用10mmol⋅L−1 pH 6.4的磷酸缓冲液溶解后收集活性部分进行SP Sepharose Fast Flow离子交换层析比活到达了28530 IU⋅mg−1 (蛋白)×îÖյĴ¿»¯±¶ÊýΪ8.4±¾·½·¨Äܹ»µÃµ½µ¥Ò»Ìõ´øµÄÄɶ¹¼¤Ã¸ÇұȻî·Ç³£¸ßÓ뱾ʵÑéÊÒÇ°ÆڵŤ×÷Ïà±È[9]·ÖÀ빤ÒÕ¸ü¼ÓÎȶ¨以上实验表明该方法尤其适用于实验室规模制备高纯度纳豆激酶但是通过本研究这将有助于我们将来设计出效率更高参考文献。
实验题目：大蒜中SOD提取及分离纯化１.实验目的：（１）学习并掌握大蒜SOD提取与纯化的方法及原理。
（２）学习并掌握邻苯三酚自氧化法测定SOD酶活的方法。
２.实验原理：超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD5)广泛存在于动植物及微生物体内，可催化细胞内超氧负离子( O2-) 的歧化反应，使O2-转化为H2O2 和O2。
因此，SOD是一种具有抗脂质氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶及功能性酶，在医药、食品、化妆品等领域有着广阔的应用前景。
SOD是一种亲水性的酸性酶蛋白，在酶分子上共价连结金属辅基，按照其结合的金属离子，主要可分为Fe-SOD、Mn-SOD和Cu/Zn-SOD 3种。
Cu/Zn-SOD是分布最广而且是最重要的SOD，主要存在于真核细胞的细胞浆内，分子量约为32KD，一般由两个亚基组成。
SOD对热、pH以及某些理化性质有很强的稳定性，即使温度达到60℃，经短时处理酶活几乎无损失；同时，酶活性不受乙醇和氯仿影响，但Cu/Zn-SOD对氰化物及过氧化氢均敏感。
SOD不溶于丙酮，可用丙酮将其沉淀析出。
Cu/Zn-SOD由于色氨酸含量低，其最大紫外吸收为258nm，由于含铜，所以在可见光680nm处有最大吸收。
国内测定SOD活力一般采用邻苯三酚自氧化法或改良的邻苯三酚自氧化法。
在碱性条件下，邻苯三酚会迅速自养化生成有色中间产物，同时生成超氧负离子（O2-）。
中间产物在325 nm 和420nm 波长处均有强烈的光吸收。
邻苯三酚的自氧化速率与O2-的浓度有关。
当有SOD存在时，由于它可催化超氧负离子(O2-) 的歧化反应，生成氧和过氧化氢：，从而抑制邻苯三酚的自氧化，阻止了中间产物的积累。
因此，可通过监测SOD 对这个反应的抑制程度间接测定SOD 活力。
大蒜中的SOD正属于Cu/Zn-SOD。
３.实验材料实验材料：大蒜４.实验操作步骤[试剂和器材]：材料：市售新鲜大蒜.仪器：恒温水浴锅、分光光度计、试管、研钵、烧杯、量筒、搅棒、高速离心机、葡聚糖G-75层析柱。
透析袋在使用前如何处理透析已成为生物化学实验室最简便最常用的分离纯化技术之一。
在生物大分子的制备过程中，除盐、除少量有机溶剂、除去生物小分子杂质和浓缩样品等都要用到透析的技术。
透析只需要使用专用的半透膜即可完成。
通常是将半透膜制成袋状，将生物大分子样品溶液置入袋内，将此透析袋浸入水或缓冲液中，样品溶液中的大分子量的生物大分子被截留在袋内，而盐和小分子物质不断扩散透析到袋外，直到袋内外两边的浓度达到平衡为止。
保留在透析袋内未透析出的样品溶液称为“保留液”，袋（膜）外的溶液称为“渗出液”或“透析液”。
透析的动力是扩散压，扩散压是由横跨膜两边的浓度梯度形成的。
透析的速度反比于膜的厚度，正比于欲透析的小分子溶质在膜内外两边的浓度梯度，还正比于膜的面积和温度，通常是4℃透析，升高温度可加快透析速度。
透析膜可用动物膜和玻璃纸等，但用的最多的还是用纤维素（再生纤维素RC、纤维素酯CE、PVDF等）制成的透析膜，目前常用的是美国美国光谱医学公司（spectrum，上海欧韦达仪器科技有限公司是中华区特约总经销）和美国Union Carbide （联合碳化物公司，上海欧韦达仪器科技有限公司是华东区特约经销商）生产的各种尺寸的透析管，截留分子量MwCO（即留在透析袋内的生物大分子的最小分子量，缩写为MwCO）大概有100、500、1000、2000、3500、8000、10000、15000、20000、25000、50000、100000、250000、500000、1000000等种类，单位为道尔顿（D）。
商品透析袋制成管状，其扁平宽度为8 mm～77 mm不等。
为防干裂，出厂时都用10％的甘油处理过，并含有极微量的硫化物、重金属和一些具有紫外吸收的杂质，它们对蛋白质和其它生物活性物质有害，用前必须除去。
透析膜可用动物膜和玻璃纸等，但用的最多的还是用纤维素制成的透析膜，目前常用的是美国Union Carbide （联合碳化物公司）和美国光谱医学公司生产的各种尺寸的透析管，截留分子量MwCO（即留在透析袋内的生物大分子的最小分子量）通常为1万左右。
一，基本原理
硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。
用此方法可以将主要的免疫球从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。
高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。
各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。
这种方法称之为盐析。
盐浓度通常用饱和度来表示。
硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。
二，试剂及仪器
1 . 组织培养上清液、血清样品或腹水等
2. 硫酸铵（NH 4 ）SO 4
3. 饱和硫酸铵溶液（SAS ）
4. 蒸馏水
5. PBS( 含0.2g /L 叠氮钠)
6. 透析袋
7. 超速离心机
8. pH 计
9. 磁力搅拌器
三，操作步骤
以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀。
各种不同的免疫球蛋白盐析所需硫酸铵的饱和度也不完全相同。
通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为33% — 50% 。
（一）配制饱和硫酸铵溶液（SAS ）
1.将767g （NH 4 ）2 SO 4 边搅拌边慢慢加到1 升蒸馏水中。
用氨水或硫酸调到硫酸pH7.0 。
此即饱和度为100% 的硫酸铵溶液（4.1 mol/L, 25 ° C ）.
2.其它不同饱和度铵溶液的配制
（二）沉淀
1.样品（如腹水）20 000 ′ g 离心30 min ，除去细胞碎片；
2.保留上清液并测量体积；
3.边搅拌边慢慢加入等体积的SAS 到上清液中，终浓度为1 ：1 （
4.将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6 小时或搅拌过夜（4 ° C ），使蛋白质充分沉淀。
（三）透析
1.蛋白质溶液10 000 ′ g 离心30 min （4 ° C ）。
弃上清保留沉淀；
2.将沉淀溶于少量（10-20ml ）PBS -0.2g /L 叠氮钠中。
沉淀溶解后放入透析袋对
PBS -0.2g /L 叠氮钠透析24-48 小时（4 ° C ），每隔3-6 小时换透析缓冲液一次，以彻底除去硫酸氨；
3.透析液离心，测定上清液中蛋白质含量。
四，应用提示
（一）先用较低浓度的硫酸氨预沉淀，除去样品中的杂蛋白。
1.边搅拌边慢慢加SAS 到样品溶液中，使浓度为0.5:1 (v/v) ；
2.将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6 小时或过夜（4 ° C ）；
3.3000 ′ g 离心30 min （4 °
C ），保留上清液；上清液再加SAS 到0.5:1(v/v) ，再次离心得到沉淀。
将沉淀溶于PBS ，同前透析，除去硫酸氨；
4.上清液再加SAS 到0.5:1 (v/v) ，再次离心得到沉淀。
将沉淀溶于PBS ，同前透析，除去硫酸氨；
5.杂蛋白与欲纯化蛋白在硫酸氨溶液中溶解度差别很大时，用预沉淀除杂蛋白是非常有效（二）为避免体积过大，可用固体硫酸氨进行盐析（硫酸氨用量参考表1 ）；硫酸氨沉淀法与层析技术结合使用，可得到更进一步纯化的抗体。
今天作的实验是利用硫酸铵沉淀蛋白质，从之前作过的经验知道，这一个步骤是有名的烦，要慢慢用敲的把硫酸铵缓缓的加入蛋白质溶液中。
相关的原理可以在庄荣辉学习网站中找到，与盐溶刚好相反，在蛋白质溶液中加入硫酸铵，会使得蛋白质的溶解度下降，因而沉淀出来。
因为硫酸铵所解离的离子容很大，所带的电子数也多(NH4+, SO42-)，因此当其溶入水中时，会吸引大量水分子与这些离子水合。
蛋白质分子表面多少有一些较不具极性的区域，水分子会在这些非极性区的表面聚集，形成类似『水笼』的构造(请见下图)，以便把蛋白质溶入水中。
一旦蛋白质溶液加入硫酸铵，后者吸引了大量水分子，使水笼无法有效隔离蛋白质的非极性区，造成这些非极性区之间的吸引，因而沉淀下来。
因此，分子表面上若有越多的非极性区域，就越容易用硫酸铵沉淀下来。
在计算所添加的硫酸铵的重量方面，找到了一个不错的网站——硫酸铵计算机
这个网页上可以靠着输入实验温度、溶液体积、想要到达的百分浓度以及初始的百分浓度这四个数值，就可以得到需要添加的硫酸铵克数，以及在加入固体硫酸铵后所增加的体积，算是一个很不错的网站。
此外另一个比较值得提的，是我有用两种方式加入硫酸铵，第一种是固体的硫酸铵模碎加入，另一种是将硫酸铵溶成饱和溶液再加入，各有各的优缺点，比较如下：
1.造成蛋白质变质的程度：固体的硫酸铵>硫酸铵饱和溶液
利用硫酸铵饱和溶液真的超棒，滴入的速度可以很快而不造成变质(没试过用倒入的)。
不像固体的硫酸铵只能磨碎慢慢加入，速度一快蛋白质就坏了(溶液有致密的白色气泡产生)。
2.操作的容易度：硫酸铵饱和溶液>>固体的硫酸铵
固体硫酸铵最大的缺点就是操作不容易，要一直敲敲敲又不能太快，所以当你要溶解的蛋白质很多时，这是很累的步骤。
然而硫酸铵饱和溶液比较麻烦只有在配制部分，要先加热让它饱合后，回到操作温度让它过饱和，最后用滤纸把硫酸铵结晶去掉。
3.蛋白质溶液的体积放大程度硫酸铵饱和溶液>>固体的硫酸铵
这是使用硫酸铵饱和溶液最头痛的部分，举例来说，要让100 ml的硫酸铵百分比从0%到25%，如果是加入固体的硫酸铵，只会让溶液从100 ml变成107 ml左右，但若是加入硫酸铵饱和溶液，会让溶液变成125 ml！而且若是要提高到50%，须加等量的硫酸铵饱和溶液，所以会让蛋白质溶液从100 ml变成200 ml。
因此在加入硫酸铵时，若是低百分浓度可以利用硫酸铵饱和溶液，然而如果是高百分浓度的，除非不在意蛋白质溶液体积的放大(反正都要离心离下来)，否则还是用固体硫酸铵来的好。
所以今天从0%拉到25%及从25%拉到50%时，都是利用硫酸铵饱和溶液，但是当要从50%拉到75%时，我选择利用固体硫酸铵，因为如果用硫酸铵饱和溶液，离心机无法离那么多的溶液体积。
