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蛋白纯化硫酸铵沉淀盐析法The manuscript was revised on the evening of 2021蛋白纯化硫酸铵沉淀盐析还能想起那些在荧屏中曾经震撼过我们，具有超能力的英雄么？蜘蛛侠，敏捷，灵活迅速飞流直下，忽闪直冲高楼；绿巨人浩克，力量，速度，耐力，在我们的想象力中膨胀；还有，我们随身携带星形盾牌，品格高尚的美国队长……幻想里中的人物形象存在我们的记忆力，然而生物背景出身的我们，总归要锻炼出属于自己的实验技能，即便是相同的实验步骤，每个人做出来的结果也不尽相同，差别在哪？反复练习，用心总结出属于自己的心得，转化为自己的实验“超能力”吧。
本文总结了蛋白纯化硫酸铵沉淀详细的实验原理、步骤，供大家参考。
-------锻炼属于我们自己的实验“超能力”之一我是超级蜘蛛精看我有劲儿不？冲啊，我是美国队而我是一只冷静的科研小蜗牛这次，我们所要分享的便是一种很常见，但是也很重要的蛋白质纯化方法：硫酸铵沉淀蛋白法，一起走进实验室吧。
硫酸铵沉淀法是粗分离蛋白时常用的纯化和浓缩蛋白的技术。
蛋白质的溶解度和盐浓度密切相关，在低浓度的条件下，随着盐浓度的增加，蛋白质的溶解度增加；但在高浓度的盐溶液里，盐离子竞争性的结合蛋白表面的水分子，破坏蛋白表面的水化膜，溶解度降低，蛋白质在疏水作用下聚集形成沉淀。
每种蛋白质的溶解度不同，因此可以用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。
硫酸铵的溶解度大，解离形成大量的NH4+、SO42-离子，会结合大量的水分子，使蛋白质的溶解度下降，另外，其温度系数小，不易使蛋白质变性，因此，蛋白质粗分离时硫酸铵沉淀法是很重要的一种技术，后续可采用层析技术进一步纯化蛋白，效率更高。
硫酸铵沉淀法是常用的分离免疫球蛋白的方法。
各种不同蛋白质盐析需要不同浓度的硫酸铵溶液。
在实验中建议配置不同梯度浓度的硫酸铵溶液来确定蛋白质沉淀所需的最佳浓度。
（1）参照如下表格配置不同浓度的硫酸铵溶液；例如，在25 ℃条件下，配置饱和度为100 %的硫酸铵溶液，称取767 g的硫酸铵固体，边搅拌边加入到1 L的蒸馏水中，完全溶解后，用氨水或者硫酸调节pH到。
一，基本原理硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。
用此方法可以将主要的免疫球从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。
高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。
各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。
这种方法称之为盐析。
盐浓度通常用饱和度来表示。
硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白变性而应用最为广范。
二，试剂及仪器1 . 组织培养上清液、血清样品或腹水等2. 硫酸铵（NH 4 ）SO 43. 饱和硫酸铵溶液（SAS ）4. 蒸馏水5. PBS( 含0.2g /L 叠氮钠)6. 透析袋7. 超速离心机8. pH 计9. 磁力搅拌器三，操作步骤以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀。
各种不同的免疫球蛋白盐析所需硫酸铵的饱和度也不完全相同。
通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为33% —50% 。
（一）配制饱和硫酸铵溶液（SAS ）1.将767g （NH 4 ）2 SO 4 边搅拌边慢慢加到1 升蒸馏水中。
用氨水或硫酸调到硫酸pH7.0 。
此即饱和度为100% 的硫酸铵溶液（4.1 mol/L, 25 °C ）.2.其它不同饱和度铵溶液的配制（二）沉淀1.样品（如腹水）20 000 ′g 离心30 min ，除去细胞碎片；2.保留上清液并测量体积；3.边搅拌边慢慢加入等体积的SAS 到上清液中，终浓度为1 ：1 （4.将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6 小时或搅拌过夜（4 °C ），使蛋白质充分沉淀。
（三）透析1.蛋白质溶液10 000 ′g 离心30 min （4 °C ）。
弃上清保留沉淀；2.将沉淀溶于少量（10-20ml ）PBS -0.2g /L 叠氮钠中。
沉淀溶解后放入透析袋对PBS -0.2g /L 叠氮钠透析24-48 小时（4 °C ），每隔3-6 小时换透析缓冲液一次，以彻底除去硫酸氨；3.透析液离心，测定上清液中蛋白质含量。
蛋白纯化硫酸铵沉淀盐析之袁州冬雪创作还能想起那些在荧屏中曾震撼过我们，具有超才能的英雄么？蜘蛛侠，火速，矫捷迅速飞流直下，忽闪直冲高楼；绿伟人浩克，力气，速度，耐力，在我们的想象力中膨胀；还有，我们随身携带星形盾牌，品格高尚的美国队长……幻想里中的人物形象存在我们的记忆力，然而生物布景出身的我们，总归要锻炼出属于自己的实验技能，即即是相同的实验步调，每一个人做出来的成果也不尽相同，不同在哪？反复操练，用心总结出属于自己的心得，转化为自己的实验“超才能”吧.本文总结了蛋白纯化硫酸铵沉淀详细的实验原理、步调，供大家参考.-------锻炼属于我们自己的实验“超才能”之一我是超等蜘蛛精看我有劲儿不？冲啊，我是美国队长而我是一只岑寂的科研小蜗牛这次，我们所要分享的即是一种很罕见，但是也很重要的蛋白质纯化方法：硫酸铵沉淀蛋白法，一起走进实验室吧.硫酸铵沉淀法是粗分离蛋白时常常使用的纯化和稀释蛋白的技术.蛋白质的溶解度和盐浓度紧密亲密相关，在低浓度的条件下，随着盐浓度的增加，蛋白质的溶解度增加；但在高浓度的盐溶液里，盐离子竞争性的连系蛋白概况的水分子，破坏蛋白概况的水化膜，溶解度降低，蛋白质在疏水作用下堆积形成沉淀.每种蛋白质的溶解度分歧，因此可以用分歧浓度的盐溶液来沉淀分歧的蛋白质.硫酸铵的溶解度大，解离形成大量的NH4+、SO42-离子，会连系大量的水分子，使蛋白质的溶解度下降，别的，其温度系数小，不容易使蛋白质变性，因此，蛋白质粗分离时硫酸铵沉淀法是很重要的一种技术，后续可采取层析技术进一步纯化蛋白，效率更高.硫酸铵沉淀法是常常使用的分离免疫球蛋白的方法.各种分歧蛋白质盐析需要分歧浓度的硫酸铵溶液.在实验中建议配置分歧梯度浓度的硫酸铵溶液来确定蛋白质沉淀所需的最佳浓度.（1）参照如下表格配置分歧浓度的硫酸铵溶液；例如，在25 ℃条件下，配置饱和度为100 %的硫酸铵溶液，称取767 g的硫酸铵固体，边搅拌边加入到1 L的蒸馏水中，完全溶解后，用氨水或者硫酸调节pH到7.0.（2）沉淀蛋白将样品离心，去除沉淀，保存上清液并丈量体积；一边搅拌一边渐渐的加入硫酸铵.接着，将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6 h，或者4 ℃，搅拌过夜，使蛋白质充分沉淀.加入硫酸铵有两种方式，一种是直接加入硫酸铵固体，在操纵上速度缓慢，不容易太快，否则会造成蛋白变性；另外一种方式是加入饱和的硫酸铵液体，但若需要较高浓度的硫酸铵溶液，需要加入较大体积的饱和硫酸铵溶液，在后续实验操纵中，因蛋白质上清液和硫酸铵饱和溶液的体积之和过大，离心机无法离心，因此根据需要加入的硫酸铵饱和溶液的体积选择合适的方法.别的，每种蛋白质沉淀所需要的硫酸铵溶液的浓度也分歧，因此在每次实验中应该做好观察记录，积累经历值.分享来自网上的一种简单的方法来估计蛋白沉淀所需要的硫酸铵溶液的浓度范围，供大家参考：将蛋白质溶液分成5份，每份分别加入硫酸铵至浓度分别为20%、30%、40%、50%、60%，离心，弃蛋白质沉淀，留取上清，再向上清液中加入硫酸铵，使得浓度从原先的20%升高到30%，30%的浓度升到40%，40%的浓度升为50%.......，离心保存沉淀，分析沉淀中是否含有目标蛋白，以此确定沉淀目标蛋白所需要的最佳硫酸铵溶液的浓度.（3）透析除去硫酸铵将蛋白质溶液离心沉淀，弃上清保存沉淀.加入10-20 ml的PBS-叠氮化钠溶液溶解蛋白质，叠氮化钠不于蛋白质反应，但能防止蛋白质变性.蛋白沉淀溶解之后，放入透析袋中透析24-48 h，每隔5 h 更换透析液除去硫酸铵.收集透析液，离心，测定上清中蛋白质的含量.友情提示：成长中的实验达人：从未犯错的人，从未试图创新.--------爱因斯坦所以做好详细的实验步调，实验成果的分析，不竭测验测验，不竭总结吧.。
硫酸铵盐析1.盐析的成败决定于溶液的pH值与离子强度，溶液pH值越接近蛋白的等电点，蛋白质越容易沉淀。
2.盐析一般用的硫酸铵，容易吸潮，因而在使用前，一般先磨碎，平铺放入烤箱内60摄氏度烘干后再称量，这样更准确。
3.在加入盐时应该缓慢均匀，搅拌也要缓慢，越到后来速度应该更注意缓慢，如果出现一些未溶解的盐，应该等其完全溶解后再加盐，以免引起局部的盐浓度过高，导致酶失活。
4.盐析后最好搅拌40分钟到一个小时而且再在冰浴中放置一段时间。
3.5为了避免盐对酶的影响，一般脱盐处理后再测酶活性。
5.盐析后的蛋白质最好尽快脱盐处理，以免变性，透析较慢，一般可用超滤或者G-25，G-50 处理。
6.一般粗提物蛋白完全沉淀是在硫酸铵浓度在70%左右。
盐析法①原理：盐析法对于许多非电解质的分离纯化都是适合的，也是蛋白质和酶提纯工作应用最早，至今仍广泛使用的方法。
其原理是蛋白质、酶在低盐浓度下的溶解质随着盐液浓度升高而增加（此时称为盐溶）；当盐浓度不断上升时，蛋白质和酶的溶解度又以不同程度下降并先后析出，称为蛋白质的盐析。
这一现象是由于蛋白质分子内及分子间电荷的极性基团有着静电引力，当水中加入少量盐类时，由于盐类离子与水分子对蛋白质分子上的极性基团的影响，使蛋白质在水中溶解度增大。
但盐浓度增加到一定程度时，蛋白质表面的电荷大量被中和，水化膜被破坏，于是蛋白质就相互聚集而沉淀析出。
盐析法就根据不同蛋白质和酶在一定浓度的盐溶液中溶解度降低程度的不同而达到彼此分离的方法。
②盐的选择：蛋白质盐析常用中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。
其中应用最广的是硫酸铵，其优点是温度系数小而溶解度大（25℃时饱和溶解度为4.1mol/L,即767g/L;0℃时饱和溶解度为3.9mol/L，即676g/L），在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来，而且硫酸铵价廉易得，分段效果比其他盐好，不容易引起蛋白质变性。
应用硫酸铵时，对蛋白氮的测定有干扰，缓冲能力比较差，故有时也应用硫酸钠，如盐析免疫球蛋白，用硫酸钠的效果也不错，硫酸钠的缺点是30℃以上溶解度太低。
硫酸铵沉淀原理
硫酸铵沉淀法的基本原理:这是一种从大量粗制品中提取并部分提纯蛋白质的方法。
主要是通过将免疫球蛋白从试样中分离，通常采用的方法是：高浓度的盐离子蛋白溶液和蛋白质的水分子发生竞争，导致其水和蛋白质分子减弱，通过溶解度从溶液沉淀出来。
因不同的蛋白质溶解度相同，所以用相同的盐溶液进行沉淀，称为盐析。
盐的含量一般用饱和度来表示，而硫酸铵由于具有较高的溶解度，较低的温度系数，容易引起蛋白的变性，因此得到广泛的应用。
硫酸铵分级沉淀的原理【硫酸铵分级沉淀原理及实验方案】一，基本原理硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。
用此方法可以将主要的免疫球从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。
乳酸盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从氢氧化钠中沉淀出来。
各种脂肪酸的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来氢氧化钾沉淀不同的蛋白质。
这种方法称之为盐析。
盐浓度通常用饱和度来表示。
硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使弯果而应用最为广范。
二，试剂及仪器1 . 组织培养上清液、血清成品或腹水等2. 硫酸铵（ NH 4 ） SO 43. 饱和硫酸铵溶液（ SAS ）4. 蒸馏水5. PBS( 含 0.2g /L 叠氮钠 )6. 透析袋7. 超速离心机8. pH 计9. 磁力搅拌器三，操作步骤以腹水或组织培养选种上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀。
各种不同的免疫球蛋白所需硫酸铵的饱和度也不完全相同。
通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为 33% — 50% 。
（一）配制饱和硫酸铵溶液（ SAS ）1.将 767g （ NH 4 ） 2 SO 4 边蒸馏边慢慢加到 1 升蒸馏水中。
用氨水或硫酸吴萸到硫酸pH7.0 。
此即饱和度为 100% 的硫酸铵溶液（4.1 mol/L, 25 ° C ）.2.其它不同饱和度铵溶液的酿制（二）沉淀1.样品（如腹水）20 000 ′ g 离心 30 min ，除去细胞碎片；2.保留上清液并测量体积；3.烘烤边搅拌边慢慢加入等体积的 SAS 到上清液中，终浓度为1 ： 1 （4.将溶液磁力放在磁力搅拌器上所搅拌 6 小时或搅拌过夜（ 4 °C ），使大分子充分沉淀。
（三）透析1.蛋白质溶液10 000 ′ g 离心 30 min （4 ° C ）。
弃上清保留沉淀；2.将沉淀溶于少量（ 10-20ml ） PBS -0.2g /L 叠氮钠中。
实验四 血清IgG 的分离制备—盐析法实验类型：验证型目的和要求掌握盐析法的原理及操作。
原理IgG 是免疫球蛋白（Immunoglobulin ，简称IgG ）的主要成分之一，分子量约为15万~16万，沉降生活费数约为7s 。
IgG 是动物和人体血浆的重要成分之一。
血浆蛋白质的成分多达70余种，要从血浆中分离出IgG ，首先要进行尽可能除去其他蛋白质成分的粗分离程序，使IgG 在样品中比例大为增高，然后再纯化而获得IgG 。
盐析法是粗分离蛋白质的重要方法之一。
许多蛋白质在纯水或低盐溶液中溶解度较低，若稍加一些无机盐则溶解度增加，这种现象称为“盐溶”（Salting in ）。
而当盐浓度继续增加到某一浓度时，蛋白质又变得不深而自动析出，这种现象称为“盐析‘（Salting out ）。
这些现象的原理大致是由于蛋白质是亲水胶体，带有羧基解离的负电荷或氨基解离的正电荷，其极性基团使分子间相互排斥，同时与水分子形成水膜，这些因素保证蛋白质形成溶于水的溶胶状态。
当加入少量盐时，增多了蛋白质分子上的极性基团，因而增大了蛋白质在水中溶解度，出现“盐溶”现象。
但当盐浓度增加到一定浓度时，一方面大量的水同盐分子结合，使得蛋白质没有足够的水维持溶解状态，破坏了维持蛋白质亲水胶的水膜，容易沉淀出来；另一方面加入的盐离子中和了蛋白质分子相互磁撞时即发生相互聚集沉淀出来，这样就出现了“盐析”现象。
由于各种蛋白质“盐析”出来所需的盐浓度也各异，盐析所需的最小盐量称做盐析浓度。
盐析法就是通过控制盐的浓度，使蛋白质混合溶液中的各个成分分步“盐析”出来，达到分离目的蛋白质。
盐析法是1878年Hammarster 首次使用的，他用硫酸镁成功地将血清蛋白分成为清蛋白、球蛋白两部分。
自那以后曾使用过硫酸钠、氯化钠、磷酸钠和硫酸铵等中性盐来盐析蛋白质，其中运用最广的是硫酸铵。
因为硫酸铵有许多其他盐所不具备的优点，如在水中化学性质稳定；溶解度大，25℃时能达到4.1mol/L 的浓度；溶解度的温度系数变化较小，在0~30℃范围内溶解度变化不大，如25℃时饱和溶解度为4.12mol/L ，即767g/L ，0℃时饱和溶解度为3.9mol/L ，即676g/L 。
固液分离和硫酸铵分级沉淀纯化藻蓝蛋白一、目的1掌握提取液的固液分离方法。
2掌握硫酸铵分级沉淀藻蓝蛋白的原理和方法。
3熟练硫酸铵分级沉淀蛋白技术。
二、原理硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。
用此方法可以将提取液中的藻蓝蛋白和杂蛋白分离。
高浓度的盐离子在蛋白质溶液中一方面可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，另外可以中和蛋白质表面所带电荷，降低蛋白质之间的静电排斥，使之从溶液中沉淀出来。
各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。
这种方法称之为盐析。
采用硫酸铵分级沉淀可以分别沉淀杂蛋白和藻蓝蛋白，实现藻蓝蛋白的纯化。
三、实验器材及试剂1实验仪器及工具：机械搅拌器、冰箱、电子天平、酸度计、漏斗、离心机、三角瓶、烧杯、移液枪等。
2实验原料及试剂硫酸铵、稀酸、稀碱等。
四、实验方法及步骤1、样品准备：打开低温离心机预冷30分钟，将藻蓝蛋白提取液分装至50毫升离心管中，每管装液量约为30～40毫升，不能超过40毫升，每管都要用天平进行称重平衡。
2、固液分离：将平衡好的离心管对称放置，装样品不能对称时，可以用离心管装水对称，盖好盖子后开始离心，离心过程中必须有专人看管，离心结束后必须等到转速降为0才能打开离心机。
3、藻蓝蛋白提取液体积量取：用量筒量取上清液体积并记录，然后将藻蓝蛋白提取液分为设定份数，记录体积（留取1份放至冰箱冷藏）。
4、硫酸铵分级沉淀：根据藻蓝蛋白提取计算出10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%饱和度所需的硫酸铵，分别加入到上述藻蓝蛋白溶液中，机械搅拌均匀后放在4℃静置过夜分级沉淀。
5、沉淀蛋白量测定：将沉淀蛋白固液分离后称取湿重，记录湿重。
五、实验结果记录藻蓝蛋白提取液体积记录藻蓝蛋白溶液颜色观察、记录沉淀蛋白颜色记录沉淀上清液颜色记录六、实验结果分析。
