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琼脂糖凝胶CL-6B亲和色谱法一步纯化蚯蚓半乳凝素陈义烘;黄慧敏;李任强【期刊名称】《色谱》【年(卷),期】2007(25)3【摘要】环节动物的S型凝集素在结构和生化性质上都有别于一般的S型凝集素,其在抗癌等研究方面的潜在价值重大.根据环节动物S型凝集素的性质,采用惰性分子筛填料Sepharose CL-6B(琼脂糖凝胶CL-6B)作为亲和色谱介质对蚯蚓S型凝集素进行了纯化.以2 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)-MEPBS(4 mmol/L β-巯基乙醇,150mmol/L NaCl,20 mmol/L磷酸盐,pH 7.2)溶液作为平衡液,以氨水(150 mmol/L,pH 10.5)作为洗脱液得到的蛋白质经SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)、凝血实验及荧光检测等证明了其即为蚯蚓S型凝集素.该方法只需一个步骤即可从蚯蚓提取液中分离到纯的S型凝集素,比传统方法更加快捷高效,优越性明显.该方法的应用将有利于对环节动物S型凝集素的深入研究.【总页数】5页(P332-336)【作者】陈义烘;黄慧敏;李任强【作者单位】暨南大学生物工程学系,广东,广州,510632;暨南大学生物工程学系,广东,广州,510632;暨南大学生物工程学系,广东,广州,510632【正文语种】中文【中图分类】O658【相关文献】1.高效亲和液相色谱法纯化基因重组人白细胞介素-2 [J], 郭立安;董建中2.亲和色谱法从融合蛋白GST-IL-6中纯化重组人白细胞介素-6 [J], 吴蕾;甘一如;林峰;黄鹤3.广州管圆线虫半乳凝素基因的克隆表达、蛋白纯化及免疫反应性研究 [J], 郝丽;吴焜;陈晓光;王琼4.半乳凝素-3促血管生成素-2肝肠黏连蛋白与消化道肿瘤的关系 [J], 唐艳5.通过膨胀床离子交换色谱法从未澄清的乳链球菌亚种乳A164的培养液中一步纯化乳链球菌素Z [J], CheighCI;陈丹;朱春宝因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
黏质沙雷氏菌胞外几丁质酶的纯化及特性施腾鑫;黄秀菁;刘嘉;贺淹才【摘要】黏质沙雷氏菌几丁质酶发酵上清液经硫酸铵沉淀、透析、DEAE一琼脂糖凝胶阴离子交换层析和苯基-琼脂糖凝胶疏水层析，得到电泳纯的几丁质酶和几丁质结合蛋白CBP21。
该几丁质酶和CBP21分子质量分别约为58ku和21ku，CBP21对该几丁质酶水解几丁质增效明显。
几丁质酶反应最适温度为50~C，最适pH约为6．5～7．0。
该酶在55℃以下、pH4．5～8．0范围内稳定。
酶的Km值为0．22mg／mL，k为1．26Ixmol／（min·mg）。
金属离子K＋、Sn2＋,Mn2＋对酶有一定激活作用，而Pb2＋、Hg2＋和Cu2＋则强烈抑制其活性。
该几丁质酶的糖基含量约为3．3％。
EDTA和2-ME可分别提高酶活力65％和105％。
H2O2强烈抑制酶活力，提示其活性中心可能存在硫氢基。
%An extracellular chitinase and a chitin-binding protein （CBP21） were isolated from the culture of Serratia marcescens and purified to electrophoretic homogeneity by ordinal procedures containing ammonium sulfate precipitation, DEAE-Sepharose and Phenyl-Sepharose chromatography. Their relative molecular masses were estimated to be respectively about 58kD and 21kD by SDS-PAGE. CBP21 had great synergistic effect with the chitinase on chitin hydrolysis. The optimum temperature and pH for the enzyme activity were 50℃ and 6.5 respectively. The enzyme activity was stable under 55℃ and in the pH range of 4.5 - 8.0. Michaelis constants of the enzyme were Km 0.22 mg/ mL and Vm 1.26 ixmol/（min·mg） respectively. The activity was enhanced by K＋, Sn2＋and Mn2＋ and was strong- ly inhibited by Pb2＋ , Hg2＋ and Cu2＋. EDTAand 2-mercaptoethanol （2-ME） enhanced the activity by 65% and 105% respectively. H2O2 strongly inhibited chitinase activity, which indicated that hydrosulfide group was the possi- ble essential residue for enzyme activity.【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2012(038)007【总页数】6页(P114-119)【关键词】黏质沙雷氏菌;几丁质酶;纯化;特性【作者】施腾鑫;黄秀菁;刘嘉;贺淹才【作者单位】福建福大百特科技发展有限公司酶高效表达国家工程实验室,福建福州350000;福建福大百特科技发展有限公司酶高效表达国家工程实验室,福建福州350000;华侨大学工业生物技术研究所,福建泉州362021;华侨大学工业生物技术研究所,福建泉州362021【正文语种】中文【中图分类】Q554.9几丁质(又称甲壳素)是N-乙酰-D-葡萄糖胺以2-1，4糖苷键连接起来的直链多聚物，是自然界中含量仅次于纤维素的可再生资源[1］。
碱性磷酸酶的提取分离和比活力的测定项目名称碱性磷酸酶的提取分离和比活力的测定xinpingzhao@实验目的1. 了解酶提取纯化的基本实验技术;2. 掌握碱性磷酸酶酶活力及比活力的测定方法实验材料新鲜兔肝或兔肾主要仪器设备匀浆器,冷冻离心机,分光光度计,电子天平等.实验原理碱性磷酸酶（简称AKP）在磷酸盐代谢中起重要作用。
核酸序列分析、DNA重组技术、酶标免疫检测技术以及临床检验中都需要利用此酶。
本实验取材于兔肝，经匀浆、正丁醇抽提、硫酸胺分段盐析或者有机溶剂沉淀，获得碱性磷酸酶制品。
本实验采用对硝基苯磷酸二钠（p-NPP）为底物的方法测定酶活。
对硝基苯磷酸二钠在碱性磷酸酶的作用下被水解为游离磷酸及对硝基苯酚，对硝基苯酚在强碱性条件下显示亮黄色，在405nm处有强烈的吸收峰。
因此可以测定405nm处的吸收值A405nm来计算产物的生成量，从而计算出酶活力，然后通过各级纯化步骤产物蛋白含量的测定,从而计算出酶的比活力.第一部分: 碱性磷酸酶的提取以下操作均在4℃进行。
方案一:1. 称取新鲜兔肝2g，剪碎后，置于玻璃匀浆器中，按1:2（m/v）加入预冷的0.05mol/LTris-HCl （pH9.0）缓冲液，匀浆后4℃抽提20 min；4℃，8000r/min离心10min；取上清；此为A 液。
另取1支试管编号为A，取0.1mLA 液，加1.9mLTris缓冲液(pH 8.8)，混匀，供测酶活性用。
2.上清液中加入1/5体积预冷正丁醇脱脂20min；8000r/min离心10min，取上清；此为B液。
吸取0.1m1B 液，置于编号为B 的试管中，加入1.9m1Tris 缓冲液(pH 8.8)，供测酶活用。
3.加入硫酸铵至35%饱和度；4℃30 min；8000r/min离心10min，弃沉淀；取上清；此为C 液。
吸取C 液0.2m1置于编号为c 的试管中，加入1.8m1Tris 缓冲液(PH 8.8)，供测酶活性用4.然后在上清液中加入硫酸铵至75%饱和度，4℃静置30 min后8000r/min离心10min，得沉淀..用0.05mol/LTris-HCl（pH9.0）缓冲液溶解沉淀；此为D 液。
用Blue Sepharose CL-6B快速纯化天花粉蛋白
袁惠东;夏其昌;张祖传
【期刊名称】《生物化学与生物物理进展》
【年(卷),期】1997(24)4
【摘要】差光谱显示染料cibacronblueF3GA与天花粉蛋白 (TCS)有特异性结合 ,复合物在可见光部分的最大吸收波长在 690nm ,摩尔消光系数ε =2 6× 1 0 - 3 (mol/L) - 1·cm- 1,解离常数Kd =1 8μmol/L,0 5mol/LNaCl可使复合物解离 .根据这一特点 ,用Blue SepharoseCL 6B凝胶从栝篓块茎中亲和纯化了TCS .此法快速、简便、高效 ,易于大量制备 .
【总页数】5页(P369-373)
【关键词】天花粉蛋白;Cibacronblue;FEGA;亲和层析;纯化
【作者】袁惠东;夏其昌;张祖传
【作者单位】中国科学院上海生物化学研究所
【正文语种】中文
【中图分类】Q946.1
【相关文献】
1.琼脂糖凝胶CL-6B亲和色谱法一步纯化蚯蚓半乳凝素 [J], 陈义烘;黄慧敏;李任强
2.DEAE-Sepharose CL-6B离子交换色谱分离αs酪蛋白的研究 [J], 向明霞;王丽娜;李子超;成希飞;徐明芳
3.用Blue一Sepharose·CL·6B亲和层析法分离纯化甲鱼和北京鸭LDH＿1、LDH ＿5A亚基 [J], 王素云;陈谨;吴鹤龄
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碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)的分离与纯化一、实验目的1.掌握酶分离纯化的一般步骤及相关原理；2.悉碱性磷酸酶的分离纯化的方法步骤。
二、实验原理有机溶剂分级沉淀是分离蛋白质的常用方法之一。
有机溶剂能使许多溶于水的酌生物大分子发生沉淀，其主要作用是降低水溶液的介电常数。
例如20℃时水的介电常数为80，82％的乙醇溶液的介电常数为40。
溶液的介电常数降低意味着溶质分子间异性电荷库仑引力增加，从而使溶质的溶解度降低。
这一点可从静电学的库仑定律中得到阐明。
同时有机溶剂溶于水，对大分子物质表面的水化膜具有破坏作用，最后使这些大分子脱水而互相聚集析出。
沉淀不同物质所需有机溶剂的浓度不同，利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中发生沉淀作用而达到分离。
用于生物大分子分级分离的溶剂主要是能与水互溶的有机溶剂，常用的有乙醇、甲醇和丙酮等。
进行有机溶剂沉淀时，欲使原溶液中有机溶剂达到一定浓度，需加入有机溶剂的浓度和体积可按下式计算：V－需加10 0％有机溶剂剂的体积；V0－原溶液的体积；S1－原溶液中有机溶剂的浓度；S2－要求达到的有机溶剂浓度；100－指加入的有机溶剂浓度为100％。
如所加入的有机溶剂的浓度为95％，上式(100一S2)项应改为(95一S2)。
在大规模制备沉淀时，若溶剂浓度的要求不太严格时，可用简单的交叉方法求出。
本实验采用有机溶剂沉淀法从肝匀桨中分离纯化碱性磷酸酶(简称AKP)。
先用低浓度醋酸钠(低渗破模作用)制备肝匀浆。
醋酸镁则有保护和稳定AKP 的作用。
匀浆中加入正丁醇可使部分杂蛋白变性，释出膜中酶，过滤后，以去除杂蛋白。
含有AKP 的滤液用冷丙酮和冷乙酸进行重复分离纯化。
根据AKP 在33％的丙酮或30％的乙醇中溶解，而在50％的丙酮或60％的乙酸中不溶解的性质，用冷丙酮和冷乙醇重复分离提取，可从含有AKP 的滤液中获得较为纯净的碱性磷酸酶。
用有机溶剂分离纯化酶(或蛋白质)必须注意以下几点：(1)有机溶剂沉淀是个放热过程，所以要在低温下进行。
碱性磷酸酶的分离纯化及比活性与米氏常数测定一、实验原理(1).碱性磷酸酶的分离纯化1.机械破碎法制备肝匀浆低浓度乙酸钠：低渗破膜低浓度乙酸镁：保护和稳定AKP2.有机溶剂沉淀法分离纯化AKP加入不同有机溶剂重复离心正丁醇：沉淀部分除AKP的蛋白质33%丙酮、30%乙醇：溶解AKP50%丙酮、60%乙醇：沉淀AKP(2).比活性测定1.比活性的定义*单位重量的蛋白质样品中所含的酶活性单位。
*通常用每毫克蛋白质具有的酶活性单位来表示。
*用以鉴定酶的纯化程度，是酶分离提纯完成的评价指标之一。
2.测定样品的比活性必须测定：*每毫升样品中的酶活性单位数。
*每毫升样品中的蛋白质毫克数。
3.磷酸苯二钠法测定碱性磷酸酶活性反应原理(3).米氏常数测定K m即为米氏常数，V max为最大反应速度＊如上式表示,米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物浓度,因此,米氏常数的单位为mol/L。
当反应速度等于最大速度一半时,即V = 1/2 V max, K m = [S]＊吸光度表示不同底物浓度时的酶反应速度。
以吸光度的倒数作纵坐标，以底物浓度的倒数作横坐标，按Lineweaver-Burk作图法可求出Km值。
二. 器材721分光光度计台式离心机恒温水浴锅微量移液器托盘天平匀浆器试管三.试剂1. 0.5mol/L醋酸镁溶液称取醋酸镁5.3625g溶于蒸馏水中,稀释至50ml.2. 0.1mol/L醋酸钠溶液称取醋酸钠0.0820g溶于蒸馏水中,稀释至10ml.3. 0.01mol/L醋酸镁---醋酸钠溶液取0.5mol/L醋酸镁溶液2ml及0.1mol/L醋酸钠溶溶液10ml,混合均匀后加蒸馏水稀释至100ml.4. 丙酮(分析纯).5. 95%乙醇(分析纯).6. Tris缓冲液(Ph8.8) 称取Tris 6.05g,用蒸馏水溶解成50ml,为0.1mol/L Tris 液,取0.1mol/L Tris液10ml,加0.5mol/L醋酸镁2ml,加蒸馏水80ml,再用1%醋酸调pH至8.8,然后用蒸馏水稀释至100ml.7. 0.01mol/L基质液称取磷酸苯二钠(C6H5PO4Na2.2H2o)0.3g,4-氨基安替比林0.15g,分别溶于煮沸冷却后的蒸馏水中;两液混合并蒸馏水稀释至50ml,加0.2ml氯仿防腐,盛于棕色瓶中,冰箱内保存,可用一星期;临用时与等量0.1mol/L pH10的碳酸盐缓冲液混合即可.8. 0.1mol/L pH10的碳酸盐缓冲液称取无水碳酸钠0.318g及碳酸氢钠0.168g溶于蒸馏水,稀释至50ml.9. 碱性溶液量取0.5mol/L氢氧化钠溶液与0.5mol/L碳酸氢钠溶液各20ml,混合后加蒸馏水至100ml.10. 0.5%铁氰化钾溶液称取铁氰化钾0.25g和硼酸0.75g,各溶于20ml蒸馏水中,溶解后两液混合均匀,再加蒸馏水至50ml,置棕色瓶中暗处保存.11. 0.1mol/L醋酸镁溶液称取醋酸镁0.2145g溶于蒸馏水中,稀释至10ml.12. 酚标准液(0.1mg/ml).四.实验步骤(1). “碱性磷酸酶分离纯化”实验操作(2).“碱性磷酸酶比活性测定”实验操作1.样品中碱性磷酸酶活性测定:(1).取5支试管,编号,按表1操作:表1A’B’C’D’标准空白各阶段稀释液(ml) 0.1 0.1 0.1 0.1 - -0.1mg/ml酚标准液(ml) - -- - 0.1 -pH8.8Tris缓冲液(ml) - - - - - 0.1置37℃水浴中保温5分钟复合基质液(ml) 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0混匀,37℃水浴中准确保温15分钟.保温结束后,各管立即加入1.0ml碱性溶液终止反应,再加入0.5%铁氰化物钾2.0ml,立即混匀,静置10min,在510nm波长下比色测定.2.酶活性单位计算每毫升酶液中酶活性单位=测定OD/标准OD X标准管中酚含量X1/0.1X稀释倍数3.样品中蛋白质含量的测定(1)测定蛋白质时,保留的A’管还需稀释5倍为A’’管,否则蛋白质浓度太高,其余各管不需再稀释,各用1.0ml进行测定.表2A’’B’C’D’空白各阶段稀释液(ml) 1.01.01.01.0 -0.1mg/ml酚标准液(ml) - -- -1.0pH8.8Tris缓冲液(ml) 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0混匀,置20~25℃水浴中保温10分钟复合基质液(ml) 0.50.50.50.50.5(2)立即振摇均匀,在20~25℃保温30min后,于650nm波长处比色.(3)蛋白质浓度计算:从Lowry法标准曲线查得的蛋白质毫克数,乘以稀释倍数,即为每毫升样品中蛋白质毫克数.4.比活性及得率计算碱性磷酸酶比活性=每毫升样品中碱性磷酸酶活性单位数/每毫升样品中蛋白质毫克数纯化倍数=各阶段比活性数/匀浆(A液)比活性数得率=各阶段酶的总活性单位/匀浆(A液)中的酶的总活性单位X100%5.实验结果将上述各实验计算结果填入表3内.表3分离总体积蛋白质总蛋白每毫升酶总活性比活性纯化得率阶段(ml) 浓度(mg) 活性单位单位(U/mg ) 倍数(%)(mg/ml) (U/ml) (U)匀浆(A液)第一次丙酮沉淀(B液)第二次丙酮沉淀(C液)第三次丙酮沉淀(D液)3．米氏常数测定1. 取15只试管，按照下表操作，1～7号重复两组，0 号为空白对照。
#### 一、实验背景碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，AKP）是一种广泛存在于生物体内的酶，具有在碱性条件下水解多种磷酸酯底物的能力。
AKP在生物体内参与多种生理和代谢过程，如钙磷代谢、细胞信号转导等。
本研究旨在通过实验手段对AKP进行分离纯化，并对其性质进行初步探讨。
#### 二、实验材料与仪器1. 材料：- 兔肝匀浆液- 丙酮、乙醇、正丁醇、硫酸铵等有机溶剂- DEAE-Sepharose FF、Sephacryl S-200等层析介质- SDS-PAGE电泳试剂- 蛋白质分子量标准品- 碱性磷酸酶底物及检测试剂2. 仪器：- 高速离心机- 紫外可见光分光光度计- 凝胶成像系统- 层析柱- 电泳槽- 移液器#### 三、实验方法1. 碱性磷酸酶的提取：- 将兔肝匀浆液用4℃预冷的丙酮沉淀，于4℃条件下静置2小时。
- 12,000 r/min离心30分钟，收集沉淀。
- 将沉淀用少量水溶解，加入硫酸铵至饱和，于4℃条件下静置2小时。
- 12,000 r/min离心30分钟，收集沉淀。
- 将沉淀用少量水溶解，加入正丁醇，于4℃条件下静置2小时。
- 12,000 r/min离心30分钟，收集含有碱性磷酸酶的上清液。
2. 碱性磷酸酶的纯化：- 将上清液用DEAE-Sepharose FF层析柱进行阴离子交换层析。
- 以磷酸盐缓冲液为洗脱液，收集碱性磷酸酶活性峰。
- 将活性峰用Sephacryl S-200分子筛层析柱进行分子筛层析。
- 以磷酸盐缓冲液为洗脱液，收集碱性磷酸酶活性峰。
3. 碱性磷酸酶的鉴定：- 将纯化后的碱性磷酸酶进行SDS-PAGE电泳，与蛋白质分子量标准品进行对比，确定其分子量。
- 利用紫外可见光分光光度计测定碱性磷酸酶的吸光度，计算其浓度。
4. 碱性磷酸酶的性质研究：- 通过酶活性测定，探讨碱性磷酸酶的最适pH值、最适温度等性质。
#### 四、实验结果1. 分离纯化结果：- 经过上述实验步骤，从兔肝匀浆液中成功提取并纯化了碱性磷酸酶。
实验日期：2023年10月25日实验地点：生化实验室实验目的：1. 了解碱性磷酸酶（AKP）的分离纯化原理和方法。
2. 掌握碱性磷酸酶活性测定的原理和方法。
3. 通过实验验证碱性磷酸酶的动力学特性，计算其米氏常数（Km）和最大反应速度（Vmax）。
实验原理：碱性磷酸酶（AKP）是一种非特异性磷酸单酯酶，主要存在于动物和微生物体内，具有磷酸基团转移活性。
在碱性条件下，AKP能水解多种磷酸单酯化合物，生成相应的醇和磷酸盐。
本实验采用有机溶剂沉淀法从兔肝匀浆液中提取分离AKP，并通过比色法测定其活性。
实验材料：1. 兔肝匀浆液2. 丙酮3. 0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）4. 磷酸苯二钠5. 4-氨基安替比林6. 铁氰化钾7. 移液管、移液枪、试管、试管架、恒温水浴箱、分光光度计实验步骤：1. 碱性磷酸酶提取：- 将兔肝匀浆液与丙酮以体积比1:1混合，室温下静置过夜。
- 4,000 rpm离心10分钟，弃去上清液。
- 将沉淀用0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）溶解，得到碱性磷酸酶粗提液。
2. 碱性磷酸酶活性测定：- 取6支试管，分别加入0.02 mol/L磷酸苯二钠溶液、0.1 mol/L Tris-HCl 缓冲液（pH 8.0）、4-氨基安替比林溶液和铁氰化钾溶液。
- 在上述溶液中加入不同浓度的碱性磷酸酶粗提液，混匀后置于恒温水浴箱中反应10分钟。
- 在510 nm波长下测定吸光度，以酶活力单位（U）表示。
3. 米氏常数（Km）和最大反应速度（Vmax）计算：- 以酶活力单位（U）为纵坐标，底物浓度（mol/L）为横坐标，绘制酶活力曲线。
- 利用双倒数法（Lineweaver-Burk plot）计算米氏常数（Km）和最大反应速度（Vmax）。
实验结果：1. 碱性磷酸酶活性曲线：- 随着底物浓度的增加，酶活力逐渐增加，但在一定浓度后趋于稳定。
2. 米氏常数（Km）和最大反应速度（Vmax）：- 米氏常数（Km）为0.05 mol/L，最大反应速度（Vmax）为150 U/min。
纯化和鉴定链霉菌IK的几丁质酶摘要：链霉菌IK分离自堆肥有机质，其在含胶状几丁质的培养基中30℃发酵96H，可以产生胞外几丁质酶。
使用硫酸铵沉淀法和DEAE纤维素柱层析结合的方法来纯化酶。
SDS电泳发现其分子量为71KDa.该酶的最佳活性是在pH6.7和37℃。
Km 值为2.92mg/ml，最大反应速率Vmax 4.26 mg/h关键词：几丁质酶，链霉菌，纯化，鉴定。
前言：几丁质是不溶的由α-1,4-N-乙酰葡糖胺的聚合物，它是自然界中第二丰富的聚合物。
这种多糖是在真菌细胞壁和甲壳类的外骨骼中发现的。
几丁质和其衍生物具有很广泛的应用，比如，作为免疫佐剂，废水污泥的絮凝剂，农药。
在土壤中添加几丁质可以降低植物病原真菌的群落数量，这些几丁质的低聚物的生物活性主要依赖于其链和溶解度。
很多生物都可以产生几丁质酶，包括细菌，植物，脊椎动物。
在细菌中，几丁质酶主要是用来摄取营养和达到寄生的目的。
为了完全降解几丁质为自由的N-乙酰葡糖胺，需要不同类型的几丁质酶和其他酶协同作用。
按照几丁质的水解特征，几丁质酶被分为两种类型。
外切几丁质酶和内切几丁质酶。
内切几丁质酶可以断开几丁质内部任意的链，把它们切成小片段。
外切几丁质酶从末端水解几丁质，释放壳二糖。
最近几丁质和几丁质酶被生物学家不断重视。
N, N-α-二乙酰壳二糖已经广泛用于生物活性化合物的合成材料中。
最近人类的血清中也发现了几丁质酶，可能对防止病原真菌的入侵起重要作用。
细菌，真菌，植物，昆虫是四种主要的几丁质酶来源。
细菌中，芽孢杆菌和链霉菌是高产几丁质酶的菌株。
链霉菌IK，是从堆肥有机质中分离的，其可高产几丁质酶。
本文主要是从链霉菌中纯化粗几丁质酶。
材料和方法：菌株和培养条件：链霉菌是从堆肥有机质中分离的（印尼），接种在琼脂斜面，30℃培养7天，然后将分生孢子接种入250ml锥形瓶中，加入50ml的液体培养基，30℃，培养48-72小时，直到大多数孢子停止产生。
从链霉菌CS495中分离新的碱性几丁质酶
摘要:从韩国的土壤中分离了一种链霉菌CS495，从中的到一种碱性几丁质酶。
通过一步层析纯化和生化鉴定。
通过Sepharose Cl-6B柱纯化7倍，收率为33.9%。
酶的分子量为41KDa,同时发现其具有稳定的pH范围（5-12.5）最佳温度60℃。
最大反应速率和米氏常数为1.34±2.9 mg/mL 和889±3.6 mmol/min。
N-端序列为APREKINLLYFLGYF。
HPLC和TLC分析显示产物中N-乙酰葡糖胺是次要的产物，二乙酰基壳二糖是主要产物。
产物对腐皮镰刀菌和曲霉菌属显示具有抗菌活性。
因为，作为纯化产物，极端嗜碱，稳定广泛的pH范围内，能以产生寡糖，和抗真菌活性，Ch495具有潜在的应用在行业作为医疗益生元或用于农业致病菌的生物防治。
前言：
几丁质分解酶，几丁质酶已被广泛的发现存在很多生物中，如真菌，甲壳类，和昆虫以及无几丁质的生物，像古细菌，细菌，病毒，高等植物，动物和人类。
最近，细菌几丁质酶已被广泛用于抑制真菌生长，可以有效地控制植物致病真菌引起的疾病。
真菌抑制作用的原因是几丁质酶在真菌细胞壁作为植物保护剂。
几丁质酶，作为有前途的生物防治剂，无论是直接作用于真菌细胞壁或增加植物对疾病的响应已早已报道从链霉菌M-20[7]，链霉菌cyaneus SP-27[8]，委内瑞拉链霉菌P10[9]，链霉菌DA11[10]。
在这里，我们描述了一种有效的几丁质酶的分离和鉴定生产菌-链
霉菌CS495。
此外，纯化单步柱层析，产物对腐皮镰刀菌和曲霉菌属显示具有抗菌活性。
材料和方法：
材料:几丁质，乙二醇壳聚糖，TLC硅胶板，壳二糖，壳三糖，Sepharose Cl-6B，F.solani and A. brasiliensis菌株，生长条件，筛选：从不同的地区收集了15种菌株，几丁质培养基培养，pH6.5,0.5%的胶状几丁质，0.5%的酵母膏，1%的胰蛋白胨，0.07%KH2PO4, 0.03% K2HPO4, 0.4% NaCl, and 0.05% MgSO4. The strains were cultivated in 250 mL Erlenmeyer flask containing 50 mL medium at 28 ◦C and 110 rpm for 7 days. 离心at 6000×g for 30 min and上清液was used to determine the enzyme activity.
酶活和蛋白质分析:
酶的纯化：
所有的纯化过程在0℃进行，菌株CS495培养7天，上清液离心6000,1小时。
粗样通过30-80%进行硫酸铵分级沉淀。
6000rpm；离心1h使蛋白质得到回收。
使用10mM Tris/HCI（pH7.0）透析。
然后用超滤进行过滤（5kDa）,透析的酶溶液，装样入Sepharose CL-6B column(85 cm×1.7 cm)平衡用10mM Tris/HCI（pH7.0）蛋白质洗脱流速为30ml/h.几丁质酶的活性部分富集，进行纯度分析。
然后进行特性分析。
电泳：
pH和温度的影响：
金属离子的影响：
氨基酸的N-断序列:
底物专一性和动力学参数：
保质期：
抗真菌活性：
几丁质水解作用：
结论：酶的产生和纯化：酶被纯化7倍，产率为33.9%。
