胰蛋白酶消化液配置及保存

查看文章细胞消化胰酶的配制2008-12-10 12:46适用于，无师兄、师姐、非细心、单独开展细胞培养的实验者对一般细胞0.25% 胰酶(胰蛋白酶，Trypsin)配方：100ml PBS,0.25g胰酶步骤：1先配100mlPBS(1000mlPBS:8.0gNaCl,3.4785gPO4HNa2·12H2O/2.9gPO4HNa2 ,0.2gKCl,0.2gPO4H2K溶于1000ml蒸馏水)2 称胰酶0.25g3 加入PBS中，低速搅拌〈4h冰浴中,或者4℃过夜低速搅拌0.5h冰浴中4 调PH7.45 仍在冰浴中6 过滤，分装，-20℃保存，4℃短期内用完tip:低速很重要，机械搅拌对酶是一种冲击，如果起沫，酶就变性了。

低温，防止酶失活对难消化的细胞：在上述配方中，加入0.02g的EDTA(0.02%)tip:因为EDTA可以络合Ca2 ，增加消化效力问：请问哪位仁兄能告知一下EDTA-胰蛋白酶的配制。

急用！多谢！答：1、胰酶是0.25%,这是质量体积比，就是说0.25g胰酶溶于100ml PBS,注意，尽量不要用水来溶，因为要保持渗透压。

2、EDTA的工作液溶度是0.02%－0.1%，根据细胞消化的难易程度自己调整。

EDTA并不是必须的，容易消化的细胞可不加。

EDTA对细胞贴壁性有影响，因此使用时要甚重。

如果影响贴壁，但消化时必须要用，那么在用完全培养基终止消化后，可离心弃上清，再加完全培养基培养，可去除EDTA。

如果对贴壁没影响，那么可不离心。

3、EDTA的浓度也是质量体积比。

和胰酶一起溶于PBS。

4、注意，血清可终止胰酶的作用，但不能终止EDTA的作用，对有些细胞来说，终止消化后的离心是必要的。

5、胰酶和EDTA在pH 为8左右的时候最易溶解，在配制时可先滴几滴NaOH将pH调至8，注意，胰酶可使溶液变酸，所以要边溶边测pH，随时调整。

注意，不可加过量NaOH，否则过碱，细胞会受不了。

20ml0.25%胰蛋白酶的配制、过滤除菌与分装（1ml）
准备样品：Try干粉，PBS缓冲液，离心管两个、冻存管20个、盒子一个、枪头1盒、灭菌器、注射器。

准备工作：将离心管、冻存管装载盒子中高温高压灭菌。

配制：
1.称取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液浓度为0.25％，用电子天平准确称取粉剂50mg溶入离心管PBS（PH到7.2左右）液中。

搅拌混匀，置于4℃内过夜。

2.用注射滤器抽滤消毒：配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器（0.22微米微孔滤膜）抽滤除菌。

3.分装：将除菌之后的胰蛋白酶用移液枪分装到冻存管中，每个冻存管1ml，于-20℃保存以备使用。

0.25%胰酶-EDTA的配制细胞消化胰酶的配制对一般细胞0.25% 胰酶(胰蛋白酶，Trypsin)配方：100ml PBS,0.25g胰酶步骤：1先配100mlPBS(1000mlPBS:8.0gNaCl,3.4785gPO4HNa2·12H2O/2.9gPO4HNa2 ,0.2gKCl,0.2gPO4H2K溶于1000ml蒸馏水)2 称胰酶0.25g3 加入PBS中，低速搅拌〈4h冰浴中,或者4℃过夜低速搅拌0.5h冰浴中4 调PH7.45 仍在冰浴中6 过滤，分装，-20℃保存，4℃短期内用完tip:低速很重要，机械搅拌对酶是一种冲击，如果起沫，酶就变性了。

低温，防止酶失活对难消化的细胞：在上述配方中，加入0.02g的EDTA(0.02%)tip:因为EDTA可以络合Ca2 ，增加消化效力实验常用溶液的配制1.革兰氏碘液：称碘化钾2g溶于100ml蒸馏水中，再加1g碘使其溶解，最后用蒸馏水稀释至300m1，盛于棕色瓶内，保存于暗冷处。

2.1.苯酚品红改良液（一）①A液：取3克碱性品红，溶于100ml 70％酒精中（此液可长期保存）。

②B液：取A液10m1，加入90ml 5％苯酚水溶液（一般在两周使用为好）。

③C液：取B液45m1，加入 6ml冰醋酸和6ml 37％甲醛。

④、苯酚品红改良液：取C液10m1，加入90ml45％冰醋酸和1克山梨醇。

2.2.苯酚品红改良液（二）：A液：碱性品红3g＋100ml 70％乙醇。

B液：A液10ml＋5％苯酚水溶液90m1。

C液：B液120ml＋冰醋酯12ml＋甲醛12ml。

D液：C液120ml＋45％冰醋酸480ml。

在D液中加1％山梨醇（600mlD液中加 6g山梨醇），此液配好后至少放4一5天方可使用，可保存几年。

3.1.甲基绿一哌罗宁混合染液（一）：①醋酸缓冲液（pH4.8）0．2mol.L-1醋酸（A.R）（取1.2ml加蒸馏水至100ml）4份0．2mol.L-1醋酸钠（A.R）（取2．72g加蒸馏水至100ml）6份。

胰酶的配制过程姓名：李达专业：预防兽医学号：2013022060 导师：汤德元一．胰酶-EDTA的配制1、专用PBS缓冲液配方：1000mlPBS: 7.000g NaCl1.100g Glucose·H2O 或 1.000g Glucose0.3700g KCl0.2g Na2PO4H3.000g Tris0.2400g KH2PO40.4000g EDTA超纯水1000ml所有试剂全部为细胞培养专用sigma试剂。

0.0010g 酚红5ml PS2.5g 胰酶（HyClone 胰蛋白酶1:250 SH30848.018）2、配制步骤：1）所用容器先泡酸12小时，后用自来水洗至无色后用蒸馏水洗净，再用超纯水洗三遍，最后高压灭菌，烘干。

2）将缓冲液配好后高压灭菌，同时洗好的广口瓶灭一瓶超纯水备用。

3）加入5ml双抗（PS）。

4）以灭菌的超纯水补足高压过程中损失的水分定容至1000ml。

5）转移到1L的试剂瓶中，加入酚红（0.0010g）。

6）调PH至7.2-7.4。

7）低温冰浴中溶解Tryspin2.5g.混匀。

此过程避免产生气泡，否则将损失酶活性。

8）在细胞间里用0.22um的滤膜过滤，分装入灭菌的50ml或1.5ml离心管中。

此过程避免产生气泡，否则将损失酶活性。

-20℃保存。

9）不可反复冻存。

每次解冻后4℃保存，并在短期内用完。

3、注意事项：1）整个分装过程在无菌条件下进行。

2）机械搅拌对酶是一种冲击，如果起沫酶就变性了。

低温可防止酶失活。

3）加入的EDTA可以络合细胞外基质中的Ca2+ ，增加消化效力。

4）在调节PH时一定要注意保护探头，防止损伤电极。

5）分装时不要太满，防止冻存后体积增大而溢出。

50ml离心管装45ml左右，1.5ml离心管装1.4ml左右。

6）分装后的胰酶尽快转移到-20℃冰箱中冻存。

二．0.25%胰酶（无EDTA）的配制1、250ml胰酶配制方法Tryspin 0.625gPS 2.5ml苯酚红0.1g所有试剂全部为细胞培养专用sigma试剂。

细胞消化液的配制操作规程一、目的：建立细胞消化液的配制规程，规范操作。

二、适用范围：0.02%EDTA-0.25%胰蛋白酶溶液的配制、除菌。

三、责任者：操作人员。

四、正文：1.配制：1.1按十万级更衣程序进入配液室,洗手、消毒手臂。

1.2按规程准备相应的化学试剂：氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、蛋白酶（1：250）、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）1%酚红溶液。

1.3准备所需要的器具：根据配制量准备相应大小的洁净的血清瓶、玻璃棒、天平等。

1.4检查注射用水水质是否符合要求，注射用水冷却至25℃以下备用。

1.5根据所要配制的体积量，计算所需要的化学试剂量，具体配方如下：1L 0.02%EDTA-0.25%胰酶消化液配方NaCl 8.5gKCl 0.2gNa2HPO4·12H2O 2.9gKH2PO4 0.2gEDTA-2Na 0.2g胰酶(1:250) 2.5g1%酚红溶液 0.2ml1.6取一相应大小洁净的血清瓶,加入注射用水800毫升，按上述配方依次称量各试剂，加入水中搅拌溶解,当第一种试剂完全溶解后加入下一种试剂，依次加完所需的试剂，其中EDTA和胰蛋白酶(1：250)可采用分别单独溶解的办法,溶解后分别加入上述溶液中，补水到1L摇匀，注意不能起泡沫。

1.7 4℃温放置6小时以后（或过夜），在层流罩下，用微孔除菌滤器（0.1um）正压过滤，分装到小瓶中（根据细胞产量确定装量），做好标识（溶液名称、批号、日期）。

1.8分装后按分装前、中、后顺序各抽样1瓶，在酒精灯控制下做无菌检验， 5～7天以后观察结果。

分装好的溶液-20℃保存冷冻保存，待鉴定溶液无菌后，方可投入生产。

2 使用时，用7.5%碳酸氢钠溶液调整pH值至7.6-7.8。

3.填写记录：批记录。

胰酶的配制过程姓名：李达 专业：预防兽医学号： 2013022060 导师：汤德元NaCl Glucose H 2O 或 I.OOOg Glucose KCl Na 2PO 4HTrisKH 2PO 4 EDTA1OOOml所有试剂全部为细胞培养专用sigma 试剂 O.OO1Og酚红 5ml PS2.5g 胰酶（ HyClone 胰蛋白酶 1:25O SH3O848.O18） 2、配制步骤：1 ）所用容器先泡酸 12 小时，后用自来水洗至无色后用蒸馏水洗净， 再用超纯水洗三遍，最后高压灭菌，烘干。

2）将缓冲液配好后高压灭菌，同时洗好的广口瓶灭一瓶超纯水备用。

3） 加入 5ml 双抗（ PS ）。

4） 以灭菌的超纯水补足高压过程中损失的水分定容至 1OOOml 。

5） 转移到1L 的试剂瓶中，加入酚红（O.OOIOg ）。

6） 调 PH 至 7.2-7.4。

7） 低温冰浴中溶解Tryspin2.5g.混匀。

此过程避免产生气泡，否则将损失酶活性。

8） 在细胞间里用0.22um 的滤膜过滤，分装入灭菌的 50ml 或1.5ml 离心管中。

此过程避免产生气泡，否则将损失酶活性。

-2O C 保存。

9） 不可反复冻存。

每次解冻后4 C 保存，并在短期内用完。

一．胰酶 -EDTA 的配制1、专用 PBS 缓冲液配方：1000mlPBS: 7.000g1.100g 0.3700g 0.2g3.000g 0.2400g 0.4000g 超纯水3、注意事项：1）整个分装过程在无菌条件下进行。

2）机械搅拌对酶是一种冲击，如果起沫酶就变性了。

低温可防止酶失活。

3）加入的 EDTA 可以络合细胞外基质中的 Ca 2+，增加消化效力。

4）在调节 PH 时一定要注意保护探头，防止损伤电极。

5）分装时不要太满，防止冻存后体积增大而溢出。

50ml 离心管装 45ml 左右， 1.5ml 离心管装 1.4ml 左右。

6）分装后的胰酶尽快转移到-20C 冰箱中冻存。

0.25%胰酶-EDTA的配制细胞消化胰酶的配制对一般细胞0.25%胰酶(胰蛋白酶，Trypsin)配方：100ml PBS,0.25g胰酶步骤：1先配100mlPBS(1000mlPBS:8.0gNaCl,3.4785gPO4HNa2·12H2O/2.9gPO4HNa2 ,0.2gKCl,0.2gPO4H2K溶于1000ml蒸馏水)2称胰酶0.25g3加入PBS中，低速搅拌〈4h冰浴中,或者4℃过夜低速搅拌0.5h冰浴中4调PH7.45仍在冰浴中6过滤，分装，-20℃保存，4℃短期内用完tip:低速很重要，机械搅拌对酶是一种冲击，如果起沫，酶就变性了。

低温，防止酶失活对难消化的细胞：在上述配方中，加入0.02g的EDTA(0.02%)tip:因为EDTA可以络合Ca2，增加消化效力问：请问哪位仁兄能告知一下EDTA-胰蛋白酶的配制。

急用！多谢！答：1、胰酶是0.25%,这是质量体积比，就是说0.25g胰酶溶于100mlPBS,注意，尽量不要用水来溶，因为要保持渗透压。

2、EDTA的工作液溶度是0.02%－0.1%，根据细胞消化的难易程度自己调整。

EDTA并不是必须的，容易消化的细胞可不加。

EDTA对细胞贴壁性有影响，因此使用时要甚重。

如果影响贴壁，但消化时必须要用，那么在用完全培养基终止消化后，可离心弃上清，再加完全培养基培养，可去除EDTA。

如果对贴壁没影响，那么可不离心。

3、EDTA的浓度也是质量体积比。

和胰酶一起溶于PBS。

4、注意，血清可终止胰酶的作用，但不能终止EDTA的作用，对有些细胞来说，终止消化后的离心是必要的。

5、胰酶和EDTA在pH为8左右的时候最易溶解，在配制时可先滴几滴NaOH将pH调至8，注意，胰酶可使溶液变酸，所以要边溶边测pH，随时调整。

注意，不可加过量NaOH，否则过碱，细胞会受不了。

6、胰酶EDTA相对比较难溶，可用磁力搅拌器，或放入4度冰箱过夜，待溶解后过滤除菌。

细胞消化液的配制操作规程一、目的：建立细胞消化液的配制规程，规范操作。

二、适用范围：0.02%EDTA-0.25%胰蛋白酶溶液的配制、除菌。

三、责任者：操作人员。

四、正文：1.配制：1.1按十万级更衣程序进入配液室,洗手、消毒手臂。

1.2按规程准备相应的化学试剂：氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、蛋白酶（1：250）、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）1%酚红溶液。

1.3准备所需要的器具：根据配制量准备相应大小的洁净的血清瓶、玻璃棒、天平等。

1.4检查注射用水水质是否符合要求，注射用水冷却至25℃以下备用。

1.5根据所要配制的体积量，计算所需要的化学试剂量，具体配方如下：1L 0.02%EDTA-0.25%胰酶消化液配方NaCl 8.5gKCl 0.2gNa2HPO4·12H2O 2.9gKH2PO4 0.2gEDTA-2Na 0.2g胰酶(1:250) 2.5g1%酚红溶液 0.2ml1.6取一相应大小洁净的血清瓶,加入注射用水800毫升，按上述配方依次称量各试剂，加入水中搅拌溶解,当第一种试剂完全溶解后加入下一种试剂，依次加完所需的试剂，其中EDTA和胰蛋白酶(1：250)可采用分别单独溶解的办法,溶解后分别加入上述溶液中，补水到1L摇匀，注意不能起泡沫。

1.7 4℃温放置6小时以后（或过夜），在层流罩下，用微孔除菌滤器（0.1um）正压过滤，分装到小瓶中（根据细胞产量确定装量），做好标识（溶液名称、批号、日期）。

1.8分装后按分装前、中、后顺序各抽样1瓶，在酒精灯控制下做无菌检验， 5～7天以后观察结果。

分装好的溶液-20℃保存冷冻保存，待鉴定溶液无菌后，方可投入生产。

2 使用时，用7.5%碳酸氢钠溶液调整pH值至7.6-7.8。

3.填写记录：批记录。

胰酶配制一、器材与试剂：干粉型培养基、胰蛋白酶、青霉素、链霉素、纯净水系统、电子天平、PH计、磁力搅拌器。

具体步骤：(1)水的制备：细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。

需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水。

(2)PBS的制备与消毒（也可用于其它BSS，如：Hanks，D-Hanks液的配制）：1、溶解定容：将药品（NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2 HPO4 ?H2 O 1.56g，KH2 PO4 0.2g ）倒入盛有双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000ml，摇匀即成新配制的PBS 溶液。

2、移入溶液瓶内待消毒：将PBS倒入溶液瓶（大的吊针瓶）内，盖上胶帽，并插上针头放入高压锅内8磅消毒20分钟。

注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。

(3) 胰蛋白酶溶液的配制与消毒：胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。

不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。

胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在pH为8.0、温度为37℃时，胰酶溶液的作用能力最强。

使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。

因Ca2+ 、Mg2+ 和血清、蛋白质可降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+ 、Mg2+ 的BSS，如：D-Hanks液。

终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。

1、称取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液浓度为0.25％，用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水（若用双蒸水需要调PH到7.2左右）或PBS（D-hanks）液中。

搅拌混匀，置于4℃内过夜。

2、用注射滤器抽滤消毒：配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器（0.22微米微孔滤膜）抽滤除菌。

然后分装成小瓶于20℃保存以备使用。

(4)青、链霉素溶液的配制与消毒1、所用纯净水（双蒸水）需要15磅高压20分钟灭菌。

2、具体操作均在超净台内完成。

Hanks液是常见的平衡盐溶液(BSS)之一。

D-Hanks液则是无钙镁离子的Hanks液。

BS S与细胞生长状态下的pH值、渗透压及无菌状态一致，且配方简单，是组织培养基本用液，常用于配制培养基及其他用液，或洗细胞等，细胞在BSS中可生存几个小时。

胰蛋白酶(胰酸)溶液是一种常用的细胞消化液，原代培养时用于处理组织块，使细胞分离下来。

传代时用胰蛋白酶使培养细胞离开所贴附的培养瓶表面，并分散成单个细胞。

胰蛋白酶主要采自牛或猪的胰脏，呈白色粉末状，易潮解，应在低温干燥处保存。

胰酶的活力常用一份胰酶解离酪蛋白的份数表示，常用胰酶活力为1：125或1：250。

本实验室一般用1：250(GRC公司生产)。

胰蛋白酶对细胞的分离效果与细胞的类型、特性和瓶壁表面特性有关。

一般来说浓度大、温度高(勿高于37℃)、作用时间长，则对细胞分离能力大。

但超过一定程度会损伤细胞，导致细胞传代后不能贴壁或死亡。

胰酶在pH 8.0、37℃时消化能力最强。

溶液中的Ca2+、Mg2+和血清会降低胰酶活力，所以配制胰酶时须用无Ca2+、Mg2+的D-Hanks液。

当消化结束时，可加入少量血清或含血清的培养基以终止胰酶作用。

细胞传代使用的胰酶浓度是0．25％或0．2％。

用于原代细胞培养消化组织块则为0．1％或0．125％。

------ 来自司徙镇强主编〈细胞培养〉（P41页）NaCL--------------- 8.00gKCL --------------- 0.40gCaCL2 ------------- 0.14gMgSO4.7H20 ------0.20gNa2HP04.H2O------ 0.06gKH2PO4 ------------0.06gNaHCO3 ------------0.35g葡萄糖------------- 1.00g酚红--------------- 0.02g加水至1L，用NaHCO3调PH至7.2~7.4Hank's液不能高压，滤膜除菌。