胰酶消化贴壁细胞

Western blot （细胞蛋白）1.取细胞：若细胞为贴壁细胞，先将细胞用胰酶消化下来（至L5ml EP管）；若为悬浮细胞，可直接抽取一部分细胞至EP管，离心（我们实验室小离心机4500rpm, 5min,具体可调节），去上清。

2.洗：加ImlPBS充分混匀，离心（同上，具体可调节），去上清。

3.裂解：加 80T20ul 裂解液（RIPA:PMSF： COCK TAIL=100:1:1）,充分混匀，冰上裂解30mino4.离：12000rmp,4℃, 10min o将上清转移至另一 L5ml EP 管。

5.定量（BCA法）6.加蛋白上样缓冲液（5X）,即步骤三所加裂解液的量4二所加蛋白上样缓冲液的量。

充分混匀。

7.沸水煮lOmin,取出冷却4℃,可放-20℃保存。

8.配胶：先配下层胶，按需求选择板子（1.0或1.5）,配完立即加无水乙醇等待30min凝（天冷时间可延长）。

上层胶，配完立即插梳子等20-30min （天冷时间可延长）。

9.加样第一孔加marker （3. 5-4ul）第二孔以后加样品，最后一个可再加marker（1.5-2. OuD&B：在电泳液中加样；电压80V. 30min,等到在压缩胶的作用下，处于同一水平线或看到marker红蓝分离，可调电压至120v （40-50min）0电泳液是IX SDSo10.切胶根据因子分子量（可扩大切胶范围，以防出现误差）11.转膜海绵用遇冷的转膜液浸湿，PDF膜用甲醇激活lmin.放置顺序海绵-膜-胶-海绵-电极板,注：赶气泡,然后通电12.封闭5%脱脂奶粉（比如称0. 5g奶粉，取10ml IX TBST） 2h.然后IX TBST洗13.孵育一抗，摇30min-lh后放4℃冰箱过夜。

14.回收一抗，IX TBST洗膜，洗3次，lOmin/次，转速130左右15.孵育二抗2h 2ml左右（转速70）16.回收二抗TBST洗膜，洗3次，10min/次17.显影（1:1）,每个膜2001d左右。

动物细胞贴壁的生长机理?
悬赏分：0 |解决时间：2011-3-7 17:50 |提问者：星级少年
最佳答案
你说的是细胞培养的时候吗？
细胞培养过程添加的血清中会含有贴壁因子，细胞就是考这些贴壁因子而贴壁生长的，一般的，细胞都会贴壁生长，但是经过无血清驯化后的细胞，会从贴壁生长转到悬浮生长，目前在生物工程制药领域，趋势是使用无血清的悬浮培养为主。

细胞不贴壁一样可以生长。

如果把贴壁的细胞洗下来最常用的办法就是加入胰酶消化，37℃环境下放置3～5min便可，但是残留培养瓶内的胰酶对细胞有毒性作用，所以都会添加低浓度的血清以中和胰酶的。

用超声的办法也可以把细胞分离下来，但是要注意超声的频率不能太大，而且细胞很娇嫩，超声会导致细胞的破裂。

这是由细胞的性质特点决定的
有些细胞是必须要附着在支持物上才可以生长的，比如肝细胞，胃上皮细胞等等而有些细胞可以悬浮生长，比如骨髓细胞白，血病细胞等等
这些细胞的生长都是需要添加血清的，而不是有些人说的，加入血清后会贴壁。

贴壁细胞收集方法嘿，咱今儿就来讲讲贴壁细胞收集方法这档子事儿。

你可别小瞧了这收集贴壁细胞，就好像咱要从那墙上把宝贝给抠下来一样，得有技巧，有门道呢！想象一下，那贴壁细胞就像是一群调皮的小孩子，紧紧地贴在墙上不愿意下来。

那咱得想办法哄着它们下来呀！一般来说呢，最常用的就是胰蛋白酶消化法啦。

就好比给那些小家伙们喂点好吃的，让它们松松口。

咱先把培养皿里的培养液倒掉，然后加上适量的胰蛋白酶，让它在那静置一会儿。

这时候啊，就像给那些贴壁细胞挠痒痒似的，它们慢慢就会松动啦。

等过一会儿，你就会看到细胞开始变圆，这就是它们准备好要离开那面“墙”啦。

接下来可就是关键时候咯，得赶紧把胰蛋白酶倒掉，可不能让它待太久，不然那些细胞可就要遭殃啦。

然后加上新鲜的培养液，温柔地吹打几下，把那些松动的细胞都给收集起来。

这过程就好像是轻轻地把宝贝们从墙上摘下来，放进小篮子里。

还有一种方法呢，就是用细胞刮刀。

这就像是拿个小铲子去把贴壁细胞给铲下来。

不过这个可得小心点哦，别太用力把细胞给弄伤了。

用细胞刮刀慢慢地在培养皿底部刮一刮，把那些贴壁细胞给弄下来，然后再收集起来。

哎呀，这收集贴壁细胞可不简单呢，就跟咱干一件精细活儿似的。

你得有耐心，还得细心，不然一个不小心就可能把细胞给搞坏啦。

咱得像对待宝贝一样对待这些贴壁细胞呀，它们可是很重要的呢！在收集的过程中，你还得时刻注意观察，看看细胞的状态。

要是发现有什么不对劲的地方，赶紧调整方法。

可别傻乎乎地一直按照老办法来，得灵活应变呀！这就跟咱过日子一样，得随机应变，不能死脑筋。

总之呢，贴壁细胞收集方法可得好好掌握，这可是细胞实验里很关键的一步呢。

咱得把这些方法都记在心里，用的时候才能得心应手。

别到时候手忙脚乱的，那可不行！所以啊，大家都要好好学，好好练，把这门技术给掌握好咯！这样咱才能在细胞研究的道路上越走越远，越走越顺呀！你们说是不是这个理儿？。

细胞传代消化时所用胰酶浓度？
常见浓度为0.25%的胰酶（含有螯合剂），半贴壁细胞或者对胰酶敏感的细胞，可采用0.05%浓度的胰酶（含有或者不含有螯合剂）进行细胞消化。

由于细胞膜上的粘附蛋白需要金属离子维持其活性，常见的胰酶中含有EDTA等螯合剂，如果细胞贴壁不是非常紧密，也可用不含有螯合剂的胰酶进行细胞消化。

胰酶对细胞膜上粘附蛋白的损害比较大，如果进行细胞膜上蛋白的研究，建议选择温和的细胞消化试剂，尽量减少对细胞膜上蛋白的损伤。

此外，由于胰酶自身也是一种蛋白，胰酶也会自己剪切自己，建议胰酶不要反复冻融，拿到手中的大瓶胰酶进行分装使用。

除了常见的胰酶（含有或者不含有EDTA），百灵生物（除了提供cellmax 胎牛血清）还提供含另外一种更温和螯合剂的胰酶，对于娇贵或者贴壁不牢的细胞，这也不失为一种选择。

Cellmax胎牛血清Max choice, Max cells。

PI染色检测细胞周期1)细胞样品的准备：（1）对于贴壁细胞：小心收集细胞培养液到一离心管内备用。

用胰酶消化细胞，至细胞可以被轻轻用移液管或枪头吹打下来时，加入前面收集的细胞培养液，吹打下所有的贴壁细胞，并轻轻吹散细胞。

再次收集到离心管内。

1000g左右离心3-5分钟，沉淀细胞。

对于特定的细胞，如果细胞沉淀不充分，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。

小心吸除上清，可以残留约50微升左右的培养液，以避免吸走细胞。

加入约1毫升冰浴预冷的PBS，重悬细胞，并转移到1.5毫升离心管内。

再次离心沉淀细胞，小心吸除上清，可以残留约50微升左右的PBS，以避免吸走细胞。

轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。

（2）对于悬浮细胞：1000g左右离心3-5分钟，沉淀细胞。

对于特定的细胞，如果细胞沉淀不充分，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。

小心吸除上清，可以残留约50微升左右的培养液，以避免吸走细胞。

加入约1毫升冰浴预冷的PBS，重悬细胞，并转移到1.5毫升离心管内。

再次离心沉淀细胞，小心吸除上清，可以残留约50微升左右的PBS，以避免吸走细胞。

轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。

2)细胞固定：将细胞加入到1毫升冰浴预冷70%乙醇中，快速轻轻吹打混匀，4℃固定2小时或更长时间。

固定12-24小时可能效果更佳。

1000g左右离心3-5分钟，沉淀细胞。

对于特定的细胞，如果细胞沉淀不充分，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。

小心吸除上清，可以残留约50微升左右的70%乙醇，以避免吸走细胞。

加入约1毫升冰浴预冷的PBS，重悬细胞。

再次离心沉淀细胞，小心吸除上清，可以残留约50微升左右的PBS，以避免吸走细胞。

轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。

3)碘化丙啶染色液的配制4)染色：每管细胞样品中加入0.5毫升碘化丙啶染色液，缓慢并充分重悬细胞沉淀，37℃避光温浴30分钟。

随后可以4℃或冰浴避光存放。

一.组织RNA提取1.最好新鲜组织,这样RNA提取的效果比较好,这是肯定的;2.如果不是新鲜的最好在半年之内,-80℃或者液氮中冻存的组织,注意不要反复冻融,从冰冻状态拿到0-4℃,注意不要拿到常温,待组织解冻后,用DEPC泡过的剪刀剪一小块组织,称重后,放到预冷的匀浆器中,然后加入一定量的T R I Z O L试剂,然后匀浆; 注意：速度不要太快,要匀一会挺一会,否则由于摩擦产热,RNA遇热会加速降解;如果一次做多个标本的RNA提取,也要这样做,更不能急;后面的步骤和细胞RNA提取一样;二.培养细胞的RNA提取1.贴壁细胞,需要先用胰酶消化后,然后收集到中,离心,去上清,然后用PBS多洗2-3次,以去除多余的胰酶;悬浮细胞,直接用或者加样枪吹打评壁,以使细胞基本可以被吹下来;然后离心去上清,不需要用PBS洗;2.然后将少量细胞悬液转移到预冷的DEPC泡过的1.5毫升EP管中,然后加入一定量的TRIZOL细胞多的话加1毫升,细胞少的话加0.5毫升就可以,然后用枪头吹打混匀5-10分钟;如果有时间就继续往下做,如果没有时间,可以把加了TRIZOL后的细胞裂解液冻存到-80℃,用的时候提取和新的提取的效果一样;在冰上操作;3.上面的混匀5-10分钟,基本可以使细胞裂解,然后可以进行下面的步骤,详细的步骤我就不介绍了;介绍一些需要注意的地方;1.一定要注意冰上操作,低温离心;2.戴口罩和勤换手套,去任何东西都要带着手套去取;3.每次去器材的时候都要用镊子去夹,镊子要在酒精灯上烧一下;4.所有的器材都要经过DEPC浸泡后高压后才可以使用,所需要的氯仿,酒精,异丙醇等都保证没有被RNA酶污染,不能用没有泡过DEPC的枪头去提取液体,一定要用DEPC浸泡过的枪头去吸,如果发现试剂有可能被污染了,要立即更换;5.吸取上清一定不要吸到中间层的蛋白,如果吸到蛋白一定要重新用氯仿抽提,因为,吸到的蛋白很可能会对RNA产生降解作用;一定要少吸,不要贪多,RNA提取不要求量,更多的要求质;6.最后用75%的酒精洗一次就可以,尽量减少RNA提取时间;7.最后一步,用DEPC水溶解RNA,不要用太多的体积,以保证RNA的浓度;提取完后,电泳观察结果,如果上面的两条带都比较清楚的话,说明RNA提取的不错,可以一次多逆转录几管,不要把RNA冻存,以后在逆转录的效果不好。

Western Blot 相关实验方法与试剂（湿转法）人工肝实验室学习姚瑶（一）目的蛋白提取：（1）单层贴壁细胞总蛋白的提取：1、倒掉细胞培养液，加入Hanks液洗涤一次后倒掉，根据所用细胞决定是否用胰酶消化，加入适量（约5ml）新鲜细胞培养液后，将贴壁细胞吹起，并转移至4支离心管内，配平后，1500转离心10min。

2、倒掉上清，用4度预冷PBS溶液洗涤沉淀，1500转离心10min。

共洗三次，每次十分钟。

3、倒掉上清，吸净，每管加入50ul 细胞裂解液RIPA，吹散，加入后由于DNA的释放可迅速变粘稠，故应尽快转移至1.5ml EP 管内，-20℃裂解30min。

4、超声波细胞裂解仪上将各管裂解15s。

（可不做）5、4℃，12000转离心10min。

6、将上清转移至0.5ml EP管中，每管100ul，冰浴待用。

（2）组织中总蛋白的提取：1、取约100mg肝组织于研磨器内，加入500ul 细胞裂解液RIPA，研磨后吸出于1.5ml EP管内，再加入500ul RIPA，研磨后吸出于上EP管内。

冰上裂解30min。

2、配平后，4℃，14000转离心10min。

3、将上清分装于0.5ml EP管内，每管100ul，冰浴待用（二）蛋白含量的测定：1、稀释标准品：10ul标准品C液+90ul PBS溶液，混匀。

2、按0、1、2、4、8、12、16、20ul将稀释后的标准品加入于96孔板内，并用PBS将各孔补足20ul。

3、将第2、3排96孔板分别加入样品1ul、0.5ul，（可采用倍比稀释法），并用PBS将各孔补足20ul。

4、配制工作液：按A液：B液=50：1配制适量工作液，每孔加入200ul。

5、37℃水浴30min。

6、酶标仪测定各孔OD值（A570，Mode1）。

7、绘制标准曲线，计算样品蛋白浓度。

（三）SDS-PAGE电泳：（1）清洗玻璃板（2）灌胶与上样：1、配胶：根据目的蛋白的大小，决定分离胶的浓度。

胰酶消化贴壁细胞原理胰酶是一种重要的消化酶，它在人体消化过程中起到了关键作用。

胰酶主要由胰腺分泌，它能够帮助人体消化食物中的蛋白质、脂肪和碳水化合物等营养物质。

而胰酶消化贴壁细胞则是指胰酶在消化过程中与肠道内的贴壁细胞发生作用的机制。

胰酶消化贴壁细胞的原理主要包括胰酶的合成、分泌和作用三个过程。

首先是胰酶的合成。

胰酶是由胰腺内的特殊细胞合成的。

这些细胞受到胃内食物的刺激后，通过胰腺神经末梢的刺激而开始合成和分泌胰酶。

合成的胰酶经过胰管进入小肠。

接下来是胰酶的分泌。

胰酶的分泌主要通过胰腺分泌液的产生和排泄来实现。

当胃内食物通过幽门进入小肠后，小肠壁上的细胞会分泌一种叫做胃腺素的物质，这种物质能够刺激胰腺分泌液的分泌。

胰腺分泌液中含有胰酶和其他消化酶，它们经过胰管进入小肠，与食物中的营养物质发生作用。

最后是胰酶的作用。

胰酶主要通过两种方式作用于贴壁细胞。

一种方式是直接作用，胰酶直接与贴壁细胞接触并发挥作用。

另一种方式是间接作用，胰酶作用于食物中的营养物质，将其分解为小分子物质后再与贴壁细胞发生作用。

胰酶对蛋白质的消化作用是最为重要的。

胰酶能够将蛋白质分解为多肽、肽和氨基酸等小分子物质，这些小分子物质能够被贴壁细胞吸收和利用。

胰酶还能够作用于脂肪，将脂肪分解为甘油和脂肪酸等物质，以便贴壁细胞吸收。

此外，胰酶还能够作用于碳水化合物，将其分解为糖类物质，供贴壁细胞吸收利用。

总的来说，胰酶消化贴壁细胞的原理是胰酶合成、分泌和作用三个过程的综合作用。

通过胰酶的作用，食物中的营养物质可以被分解为小分子物质，以便贴壁细胞吸收和利用。

胰酶消化贴壁细胞的过程是人体消化过程中不可或缺的一部分，它保证了人体能够获得所需的营养物质，维持正常的生理功能。

贴壁细胞的消化方法介绍日期：2012-05-11 来源：互联网标签：贴壁细胞细胞消化方法相关专题：摘要: 用得也是非常多。

一般浓度在0.02%左右。

作用于细胞与间质，对细胞间也有一定作用。

注意，它能显著影响pH值，而且在弱碱性条件下才易溶。

因此，配制时应调节好酸碱度。

它不能被终和。

因此，消化下来的细胞要洗一遍。

一、酶消化法。

1、胰酶。

这是用得最多的。

一般浓度在0.25-0.5%。

作用时间根据细胞种类、作用温度等因素而变化很大，从几分钟到几十分钟不等。

0.25%的胰酶作用于单层贴壁的细胞，在37度条件下，一般消化1-5分钟就足够了。

终止是用血清。

主要作用于细胞间。

配制时不能用含钙、镁的平衡液，否则影响活性。

保存于-20度。

2、胶原酶。

这种方法比较少，一般是用原代培养时，从组织消化下细胞。

这种方法作用温和，对细胞损伤较小，但是，价格也较贵。

中止同样是用血清。

二、离子螯合剂：不破坏细胞表面分子，仅与CAMs螯合，因此，如果检测细胞表面分子的话，尽量，甚至是一定不要用酶消化法。

1、EDTA。

用得也是非常多。

一般浓度在0.02%左右。

作用于细胞与间质，对细胞间也有一定作用。

注意，它能显著影响pH值，而且在弱碱性条件下才易溶。

因此，配制时应调节好酸碱度。

它不能被终和。

因此，消化下来的细胞要洗一遍。

2、商品化的无酶消化液。

个人的使用经常觉得对细胞的损伤比较大，但是分离成单细胞悬液的能力确实比较强。

三、物理法。

直接吹打或用细胞刮子将细胞刮下来。

四、冷冻法。

此方法仅能用于细胞传代时。

无法使组织上的细胞脱落下来。

本方法的原理，我想是因细胞冷冻后收缩，从而从培养瓶上脱落下来。

优点是：对细胞损伤小，不需要中止或洗细胞，方便，不需要另外配制消化液。

特别适用那些贴壁不是特别紧，又特别娇气的细胞。

不足是细胞常成小片脱落。

此种方法曾用于因用其它方法传代导致大量细胞死亡操作的间充质干细胞、DC细胞的培养，效果非常满意。

具体过程是：1、用较多的4度的PBS洗涤一遍细胞(以6孔板为例，加1.5ml/孔)，2、再加0.5ml 4度的PBS，静置操作台上，很快细胞就小片脱落，3、轻轻吹打，细胞即完全脱落，4、按一定比例传代。