碳青霉烯类耐药铜绿假单胞菌感染治疗的研究进展

ʌ综述ɔ铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素耐药机制研究∗徐雁峰１ꎬ王慧敏２ꎬ张㊀冬２(１.内蒙古科技大学包头医学院ꎬ内蒙古包头０１４０００ꎻ２.内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院呼吸科)㊀㊀ＤＯＩ:１０.１６８３３/ｊ.ｃｎｋｉ.ｊｂｍｃ.２０１９.０９.０４８㊀㊀铜绿假单胞菌(ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａꎬＰＡ)是目前临床上常见的革兰阴性杆菌ꎬ是最常见的引起严重院内获得性感染的条件致病菌之一ꎮ在机体抵抗力下降或免疫功能受损或是侵入性操作时(如留置尿管㊁呼吸机辅助通气)易引起各种感染ꎬ如泌尿系感染㊁呼吸道感染㊁脑膜炎㊁烧伤感染等ꎬ其中以下呼吸道感染最为常见ꎬ包括支气管扩张合并感染㊁慢性阻塞性肺疾病合并感染㊁呼吸机相关性肺炎等ꎬ且主要分布于重症监护病房ꎮ铜绿假单胞菌具有易定值ꎬ易变异ꎬ易耐药特点[１]ꎮ该菌可随着医护人员的手接触㊁医疗用水㊁机械通气等直接或间接性传播ꎻ在国外ꎬ慢性铜绿假单胞菌的定植是囊性纤维化(ＣＦ)肺病过程中的核心因素ꎬ是导致ＣＦ患者发病率和死亡率上升的主要原因ꎮＺａｖａｓｃｋｉ等[２]进行的研究表明ꎬ抗生素的选择压力和长时间使用加快了细菌突变的速度ꎮ因此抗生素的滥用ꎬ使得铜绿假单胞菌基因发生突变ꎬ导致耐药性在细菌间进行水平转移ꎬ使得铜绿假单胞菌耐药现象逐渐突显ꎬ出现多重耐药铜绿假单胞菌(Ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ－ｒｅｓｉｓｔ￣ａｎｔｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａꎬＭＤＲＰＡ)ꎬ给人们的安全带来巨大的威胁ꎬ引起了感染相关专家对公共卫生的关注ꎮ由其所引起的疾病具有难治愈㊁高致死率及迁延不愈性等特点ꎬ给临床治疗带来巨大困难ꎬ严重威胁人类的健康ꎮ㊀㊀碳青霉烯类抗生素(Ｃａｒｂａｐｅｎｅｍａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ)是抗菌谱最广㊁抗菌活性最强的一类β－内酰胺类抗生素ꎬ曾一度是治疗铜绿假单胞菌感染的首选药物ꎮ２０世纪７０年代末期ꎬ默克公司研究人员从牲畜链霉菌中发现一类新的β－内酰胺类抗生素－硫霉素ꎬ这是历史上第一个碳青霉烯类抗生素ꎮ１９８７年ꎬ该公司通过对硫霉素的半合成结构修饰ꎬ成功开发出第一个用于临床的碳青霉烯类抗生素－亚胺培南ꎬ之后碳青霉烯类药物开始被陆续开发并广泛应用于临床各科室ꎬ目前以亚胺培南和美罗培南为代表的碳青霉烯类抗生素被临床广泛用于治疗铜绿假单胞菌感染ꎬ尤其在重症感染患者治疗上发挥了重要作用ꎮ然而近年来ꎬ世界各地逐渐出现了耐碳青霉烯类抗生素铜绿假单胞菌(Ｃａｒ￣ｂａｐｅｎｅｍ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａꎬＣＲＰＡ)ꎬ２０１７年世界卫生组织(ＷＨＯ)制定了一份关于全球耐药菌的排列名单ꎬ耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌与耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌ꎬ耐碳青霉烯类㊁第三代头孢菌素的肠杆菌科细菌排在最前ꎮ耐碳青霉烯铜绿假单胞菌的出现使得临床上对感染性疾病的治疗变得愈加困难ꎮＨｏｎｇ等[３]通过对５０个国家临床ＣＲＰＡ分离株的耐药情况进行分析ꎬ发现在巴西㊁秘鲁㊁哥斯达黎加㊁俄罗斯㊁希腊㊁波兰㊁伊朗和沙特阿拉伯等地铜绿假单胞菌对碳青霉烯类药物的耐药率均高于５０％ꎮ美国ＩＮ￣ＦＯＲＭ(Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｎｅｔｗｏｒｋｆｏｒｏｐｔｉｍａｌｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｍｏｎｉ￣ｔｏｒｉｎｇ)监测了２０１２~２０１５年７９个美国医疗中心铜绿假单胞菌对美罗培南的耐药率ꎬ结果显示耐药率从１８.０％上升到１９.１％[４]ꎮ２０１５年㊁２０１６年㊁２０１７年中国细菌耐药性监测ＣＨＩＮＥＴ结果显示ꎬＰＡ对亚胺培南的耐药率为２７.６％㊁２８.７％㊁２３.６％ꎬ对美罗培南耐药率为２３.４％㊁２５.３％㊁２０.９％ꎮ一项对全球ＣＲ￣ＰＡ的流行病学报道显示ꎬ南美洲㊁欧州和西南亚地区是ＣＲＰＡ的主要地区ꎬ对碳青霉烯类抗生素的耐药率最高可达７５.３％ꎮ可见铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素具有很高的耐药性ꎮ㊀㊀ＣＲＰＡ的出现ꎬ给临床抗感染带来了严峻的考验ꎬ因此研究铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素的耐药机制具有重要意义ꎬ本文就其耐药机制做一综述ꎮ１　产生碳青霉烯酶㊀㊀铜绿假单胞菌可产生β－内酰胺酶㊁氨基糖苷类钝化酶等多种酶ꎬ其中产β－内酰胺酶是ＰＡ耐药的主要机制ꎬ此酶可以通过水解或非水解方式破坏β－内酰胺酶的β－内酰胺环使抗菌药物失活而无法发挥抗菌作用ꎮ目前对于β－内酰胺酶的分类法主要有两类ꎬＡｍｂｌｅｒ分子结构法是１９８０年Ａｍｂｌｅｒ提出的ꎬ根据β－内酰胺酶氨基酸序列分为Ａ－Ｄ类ꎬ其中Ａ类㊁Ｃ类和Ｄ类β－内酰胺酶是依赖丝氨酸发挥作用ꎬ而Ｂ类β内酰胺酶是依赖金属离子发挥作用ꎬ是引起铜绿假单胞菌获得性耐药的主要酶ꎮ另一种分类方法是∗基金项目:内蒙古自治区自然科学基金项目[２０１７ＭＳ(ＬＨ)０８０３]通讯作者:张㊀冬Ｂｕｓｈ分类法ꎬ是Ｂｕｓｈ于１９９５年提出ꎬ他以酶作用的底物㊁抑制剂谱的不同将β－内酰胺酶分为四个大类(１－４)及六个亚类(ａ－ｆ)ꎬ主要包括超广谱β－内酰胺酶(ＥＳＢＬｓ)㊁金属酶(ＭＢＬｓ)㊁头孢菌素酶(ＡｍｐＣ)ꎬＯＸＡ型内酰胺酶等ꎮ碳青霉烯酶是一类能水解碳青霉烯类抗生素的β内酰胺酶ꎬ主要是指Ａｍｂｌｅｒ法的Ａ㊁Ｂ㊁Ｄ类ꎮ１.１㊀Ａ类碳青霉烯酶㊀Ａ类碳青霉烯酶包括ＫＰＣ型㊁ＧＥＳ型㊁ＳＭＥ型㊁ＩＭＩ型㊁ＳＦＣ型等ꎬ其中以ＫＰＣ型和ＧＥＳ型最为常见ꎬ以质粒形式存在ꎬ造成大范围耐药铜绿假单胞菌的传播ꎮ近年来对ＫＰＣ型碳青霉烯酶报道较多ꎬＫＰＣ多见于肺炎克雷伯杆菌ꎬ１９９６年首次在美国的一种肺炎克雷伯菌中检测到ꎮ２００６年ꎬ哥伦比亚国际医学研究和教育中心首次报道ＫＰＣ－２在假单胞菌中的存在情况ꎬ２０１１年浙江大学医学院附属第一医院报道了首例产ｂｌａＫＰＣ－２型碳青霉烯酶的铜绿假单胞菌ꎬ之后ＫＰＣ在铜绿假单胞菌的报道逐渐增多[５]ꎮＫＰＣ酶属于Ａｍｂｌｅｒ－Ａ类ꎬＢｕｓｈ－２ｆ类ꎬ位于质粒或染色体上ꎬ染色体编码的ＫＰＣ可能有利于产ＫＰＣ铜绿假单胞菌高风险克隆的扩散ꎮＧａｒｃｉａ等[６]通过比较产生ＫＰＣ酶的肺炎克雷伯菌感染爆发之前和之后铜绿假单胞菌分离株的耐药性ꎬ发现爆发后铜绿假单胞菌获得了ＫＰＣ基因ꎬ从而表明了ＫＰＣ基因可在细菌间传播导致铜绿假单胞菌获得对碳青霉烯类抗生素高水平的耐药性ꎮ目前已经鉴定出至少２３种ＫＰＣ蛋白变体ꎮ１.２㊀产金属β－内酰胺酶(ｍｅｔａｌ－β－ａｃｔａｍａｓｅｓꎬＭＢＬｓ)㊀金属β－内酰胺酶(ｍｅｔａｌ－β－ａｃｔａｍａｓｅｓꎬＭＢＬｓ)是以金属离子为活性中心的酶ꎬ可以水解大部分β－内酰胺类抗生素ꎬ且需要依赖金属离子Ｚｎ２＋发挥作用ꎮ首次发现是因蜡样芽胞杆菌产生能被ＥＤ￣ＴＡ抑制的β－内酰胺酶ꎬ之后世界各地相继报道了能产生ＭＢＬｓ的各种细菌ꎮ编码ＭＢＬｓ的基因位点存在于铜绿假单胞菌的质粒㊁转座子或染色体上ꎬ以基因盒存在于整合子之中ꎬ大部分位于Ⅰ类整合子ꎬ通过整合子传递作用ꎬ使耐药性在革兰阴性细菌间水平传播扩散ꎬ引起铜绿假单胞菌的多重耐药(ＭＤＲ)甚至泛耐药(ＸＤＲ)ꎬ进而导致感染的爆发ꎬ使得临床治疗变得复杂化ꎮＭＢＬｓ可分为天然和获得性金属酶ꎬ获得性ＭＢＬｓ主要为质粒介导的ꎬ随着质粒的移动将耐药基因播散在各个菌株ꎬ是临床上最多见的ꎮ天然ＭＢＬｓ为染色体编码的ꎬ存在于一些临床非重要致病菌中ꎬ不具有传导性ꎬ没有致病性ꎬ是细菌为适应生存环境而产生的酶ꎮ获得性ＭＢＬｓ是铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素产生获得性耐药的主要原因ꎮ脉冲场凝胶电泳实验(ＰＦＧＥ)发现ꎬ产ＭＢＬｓ铜绿假单胞菌在遗传学上紧密相关ꎬ表明ＭＢＬｓ基因的扩散是由耐药菌株的克隆传播或耐药基因在不同菌株间传递引起的[７]ꎮＭＢＬｓ属于Ａｍｂｌｅｒ－Ｂ类ꎬＢｕｓｈ－３类ꎬ目前发现的获得性金属酶包括ＩＭＰ㊁ＶＩＭ㊁ＧＩＭ㊁ＳＰＭ㊁ＳＩＭ㊁ＮＤＭ－１㊁ＦＩＭ－１ꎬ临床最常见的是ＩＭＰ和ＶＩＭꎮ近年来发现了ＭＢＬｓ的亚类ꎬ进一步说明了ＭＢＬｓ的持续多样化以及这些酶在革兰氏阴性菌种中的持续全球传播ꎮ㊀㊀ＩＭＰ－１是１９９１年日本研究者在粘质沙雷菌体内发现了第一个获得ＭＢＬｓꎬ之后不断发现新的获得ＭＢＬｓꎬ这些金属酶的宿主也从粘质沙雷菌扩大到了铜绿假单胞菌等肠杆菌科细菌ꎬ而铜绿假单胞菌是主要宿主ꎮ目前已发现了ＩＭＰ五十几种亚型ꎬ分别由相应编码基因的不同位点发生突变产生ꎮ１９９９年意大利在铜绿假单胞菌中发现首个ＶＩＭ－１型酶ꎬ随后在美国㊁法国㊁英国㊁意大利等国家相继发现铜绿假单胞菌产不同亚型ＶＩＭ基因ꎮ目前已发现了ＶＩＭ四十几种ꎬＶＩＭ－２是铜绿假单胞菌中分布最广的ＭＢＬꎬ并且是多次爆发的来源ꎮ㊀㊀ＮＤＭ－１是一种新型金属酶ꎬ最初在２００９年从一位感染肺炎克雷伯杆菌的瑞典患者分离发现ꎬ之后在铜绿假单胞菌㊁鲍曼不动杆菌和大肠杆菌中均有发现ꎮ２０１１年ꎬ首次在塞尔维亚患者中记录了铜绿假单胞菌中ＮＤＭ－１的存在ꎬ之后在世界各地耐药铜绿假单胞菌均有发现ꎬＮＤＭ－１可以水解大部分β内酰胺类抗生素包括碳青霉烯类抗生素ꎬ是最广谱耐药的金属酶ꎮＮＤＭ－１位于质粒上ꎬ不仅可以在细菌间转移ꎬ而且能使所在宿主菌成为超级细菌ꎬ严重威胁着人类健康ꎮＦＩＭ－１是２０１２年从佛罗伦萨血管移植物感染患者培养的多重耐药铜绿假单胞菌中分离出一种新型金属酶ꎬ位于染色体上ꎬ与ＮＤＭ表现出最高的相似性(约４０％氨基酸同一性)ꎬＦＩＭ－１具有广泛的底物特异性ꎬ优选青霉素和碳青霉烯类[８]ꎮ㊀㊀ＫＨＭ－１是１９９７年在日本的多重耐药柠檬酸杆菌分离物中鉴定出来的ꎬ之后再未报道过ꎮＰｆｅｎｎｉｇｗ￣ｅｒｔｈ等[９]在铜绿假单胞菌分离物发现了新的金属酶ＨＭＢ－１ꎬ与ＫＨＭ－１在核苷酸水平上的同一性为７３.６％ꎬ在氨基酸水平上的同一性为７４.３％ꎬ但在碳青霉烯酶水解方面表现出明显差异ꎬ通过测定最低抑菌浓度(ＭＩＣ)发现ＨＭＢ－１对亚胺培南的水解高于ＫＨＭ－１的２倍ꎬ而对美罗培南㊁厄他培南的水解效率非常相似ꎮ１.３㊀产ＯＸＡ型酶㊀ＯＸＡ型酶属于ＡｍｂｌｅｒＤ类ꎬＢｕｓｈ２ｄ类ꎬ因对苯唑西林或是氯唑西林等有很强的水解能力而得名ꎮＯＸＡ型超广谱β－内酰胺酶ꎬ是从２０世纪８０年代后期随着ＤＮＡ测序技术的发展才从丝氨酸β－内酰胺酶中分离出来ꎬ并单独成为一类ꎮ之后该酶在世界范围内陆续被检测到ꎬ如法国㊁西班牙㊁英国等许多国家均检出ꎬ近日秘鲁发现了同时表达ＯＸＡ－１的铜绿假单胞菌[１０]ꎮ国内在安徽㊁湖南㊁郑州㊁苏州㊁贵州等地也曾报道过ＯＸＡ型酶ꎮＯＸＡ型酶主要分布在鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌ꎮＢｅｒｔ等[１１]阐述了ＯＸＡ型酶分５组ꎬ其中ＯＸＡ－５㊁ＯＸＡ－１０㊁ＯＸＡ－１１㊁ＯＸＡ－１４㊁ＯＸＡ－１６㊁ＯＸＡ－１７㊁ＯＸＡ－３１等见于铜绿假单胞菌内[１２]ꎮＯＸＡ－１９８是２０１１年Ｅｌ等[１３]新发现的Ｄ类β内酰胺酶ꎬＯＸＡ－１９８基因位于ＩｎｃＰ－１１型质粒携带的Ⅰ类整合子上ꎬ易于在铜绿假单胞菌或大肠杆菌中转化ꎮ最近ꎬＢｏｎｎｉｎ等[１４]描述了产生ＯＸＡ－１９８的铜绿假单胞菌与医院相关的丛集事件ꎬ揭示ＯＸＡ－１９８的产生使碳青霉烯类药物敏感性降低ꎮ２㊀膜通透性下降㊀㊀细胞膜是药物进入细菌内发挥作用的第一道屏障ꎬ铜绿假单胞菌的细胞内膜由具有流动性的脂质双分子层组成ꎬ外膜包括脂蛋白㊁外膜蛋白和脂多糖等ꎬ脂多糖为６~７条链相互共价连接而成的脂肪酸链组成ꎬ这可降低外膜的流动性ꎬ阻碍脂溶性药物通过细菌外膜ꎮ碳青霉烯类抗生素进入体内发挥作用的靶位是位于内膜上的青霉素结合蛋白(ＰＢＰｓ)ꎬ需先通过外膜才能到达靶点ꎬ所以任何导致铜绿假单胞菌外膜通透性降低的因素都会导致抗菌药物无法到达作用位点ꎬ从而使细菌对该种抗生素耐药ꎮ２.１㊀膜孔蛋白的丢失㊀铜绿假单胞菌外膜上有许多微孔通道蛋白ꎬ如ＯｐｒＣ㊁ＯｐｒＤ２㊁ＯｐｒＥꎬ其中外膜孔通道ＯｐｒＤ２是以亚胺培南为代表的碳青霉烯类抗菌药物进入ＰＡ唯一通道ꎮＯｐｒＤ２的基因突变或者缺失致使ＯｐｒＤ２功能缺失或表达下调造成细胞外膜对抗菌药物通透性下降ꎬ是铜绿假单胞菌对亚胺培南等碳青霉烯类抗生素耐药的重要机制ꎮＯｐｒＤ２的缺失突变体现在编码区的一段片段缺失导致移码突变ꎬ形成新的密码子从而引起肽链异常ꎬ导致铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药ꎮＬｉｕ等[１５]通过对１７株耐亚胺培南㊁美罗培南的铜绿假单胞菌分析显示其中１４株ＯｐｒＤ２蛋白的基因由于移码ꎬ无义突变或大缺失㊁或是缺少终止密码子而导致密码子编码提前终止ꎬ进一步表明ＯｐｒＤ２的丢失使铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素产生耐药性ꎮ因此认为Ｏｐｒｄ２是造成ＰＡ对亚胺培南耐药的重要因素ꎮＯｐｒＤ２的基因突变体现在ＯｐｒＤ２结构基因㊁调控基因㊁调控因子等突变ꎬ进而影响ＯｐｒＤ２蛋白水平或空间构象的改变ꎮ此外插入ＯｐｒＤ２的序列(ＩＳ)元件也可导致ＯｐｒＤ２基因失活ꎬ世界范围内均有报告不同的插入元件ＩＳꎬ南非(ＩＳＰａ２６)㊁克罗地亚(ＩＳＲＰ１０)㊁伊朗(ＩＳＰａ１３２８)㊁西班牙(ＩＳＰａ１３３)㊁中国(ＩＳＰａ１３２８㊁ＩＳＰｒｅ２)等ꎮＳｈａｒｉａｔｉ等[１６]在ＯｐｒＤ２蛋白基因中发现了一个新的插入序列ＩＳＰｐｕ２１与铜绿假单胞菌的碳青霉烯耐药性密切相关ꎮ２.２㊀主动外排系统过度表达㊀铜绿假单胞菌细胞膜上存在着将抗菌药物排出体外的外排泵系统ꎮ根据染色体的不同同源性ꎬ可将外排泵系统分为易化子超家族(ＭＦＳ)㊁耐药结节化细胞分化家族(ＲＮＤ)㊁ＡＴＰ结合盒超家族(ＡＢＣ)㊁多重药物和毒性化合物外排家族(ＭＡＴＥ)和小多重性耐药家族(ＳＭＲ)五个超家族ꎬ其中ＲＮＤ外排家族与碳青霉烯抗菌药物的耐药有关也是最早发现的外排泵系统ꎬ主要分布在革兰阴性菌ꎬ参与多种抗菌药物的排出ꎮ１９９３年Ｐｏｏｌｅ等在铜绿假单胞菌中发现了第一个多药外排泵ＭｅｘＡＢ－ＯｐｒＭꎬ之后陆续发现多个外排泵系统如:ＭｅｘＡＢ－ｏｐｒＭ㊁ＭｅｘＸＹ－ｏｐｒＭ㊁ＭｅｘＣＤ－ｏｐｒＪ㊁ＭｅｘＥＦ－ＯｐｒＮ等ꎮ外排泵系统由膜融合蛋白如ＭｅｘＡ㊁ＭｅｘＣꎬ转运蛋白如ＭｅｘＢ㊁ＭｅｘＤ和外膜蛋白如ＯｐｒＤ㊁ＯｐｒＪ三部分组成ꎬ三种蛋白协同作用将进入菌体内的碳青霉烯类药物排除体外ꎬ任一环节出现问题即可导致多重耐药甚至泛耐药ꎮＢａｂａｋ等[１７]研究显示６２％的个体外排泵ＭｅｘＡＢ－ＯｐｒＭ基因过度表达ꎬ与先前报道的这些基因的过度表达超过５０％相符ꎮＭｅｘＸＹ－ＯｐｒＭ系统和ＭｅｘＡＢ－ＯｐｒＭ系统共用ＯｐｒＭ作为其外膜通道蛋白ꎬ因此ＭｅｘＡＢ－ＯｐｒＭ低表达也降低ＭｅｘＸＹ活性ꎬ此外ＭｅｘＣＤ－ＯｐｒＪ过表达可明显使ＭｅｘＡＢ－ＯｐｒＭ产生不足ꎮ外排泵系统具有可诱导性ꎬ抗生素的不规范使用可诱导其表达增加ꎬ曾章悦等[１８－１９]通过体外碳青霉素诱导实验对敏感铜绿假单胞菌进行诱导ꎬ发现铜绿假单胞菌经其诱导后对美罗培南的最低抑菌浓度升高ꎬ考虑铜绿假单胞菌对美罗培南的耐药与外排泵表达量增加有关ꎮ３㊀细菌生物被膜(ｂａｃｔｅｒｉａｌｂｉｏｆｉｌｍꎬＢＦ)形成㊀㊀１９７８年Ｃｏｓｔｅｒｔｏｎ首先提出生物被膜这一概念ꎬ细菌生物被膜(ｂａｃｔｅｒｉａｌｂｉｏｆｉｌｍꎬＢＦ)是指细菌附着于惰性物体或生物物体表面如医疗设备ꎬ留置导管或坏死的组织上ꎬ繁殖并分泌一些多糖基质和纤维蛋白等细胞外聚合物ꎬ将细菌粘连包裹其中而形成的膜样物ꎮＢＦ结构坚韧稳固ꎬ长期存在可作为细菌的保护伞使其逃避宿主免疫应答㊁抵挡抗菌药物的杀菌作用而难以根除ꎬ对抗生素产生耐药ꎬ进而导致难治性感染和慢性㊁持续性感染ꎮ铜绿假单胞菌生物被膜细胞外聚合物(ＥＰＳ)可延缓包括抗生素的扩散ꎬ导致细菌对抗生素耐受ꎮＥＰＳ是由胞外多糖㊁蛋白质㊁核酸组成ꎬ其中主要成分胞外多糖包括ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓｌｏｃｕｓ(Ｐｓｌ)ꎬｐｅｌｌｉｃｌｅＦｏｒｍａｔｉｏｎ(Ｐｅｌ)和藻酸盐(Ａｌｇｉｎａｔｅ)ꎬ尤其是Ｐｓ１对铜绿假单胞菌中ＢＦ形成具有重要作用ꎮＰｓｌ多糖的过量产生导致铜绿假单胞菌的细胞表面和细胞间粘附增强ꎬ形成微菌落ꎬ稳固生物被膜结构的同时对抗生素产生耐药ꎮ研究发现形成生物被膜的多糖物质Ｐｓｌ可作为一种信号分子通过调节鸟苷酸的产生形成一种正反馈ꎬ进一步促进细菌产生细胞外基质形成生物被膜ꎬ这对于研究铜绿假单胞菌的耐药具有重要作用[２０]ꎮｃ－ｄｉ－ＧＭＰ信号通路被发现是导致生物膜形成的主要机制ꎮ藻酸盐(Ａｌｇｉｎａｔｅ)是ＥＰＳ主要成分ꎬ可以形成稳固的保护屏障阻碍抗生素穿透生物被膜ꎬ难以对包裹其中的细菌产生抗菌作用ꎬ导致感染反复发作ꎮ小ＲＮＡ(ｓＲＮＡ)是铜绿假单胞菌生物被膜形成的重要机制ꎮＴａｙｌｏｒ等[２１]描述了一个新的非编码小ＲＮＡ(ｓＲＮＡ)转录物ｓｒｂＡ对生物膜的形成和毒力有重要影响ꎮ４㊀整合子(ｉｎｔｅｇｒｏｎ)的形成㊀㊀整合子是存在于细菌质粒㊁染色体或转座子上的一种具有识别和捕获各种耐药基因并通过移动ꎬ将耐药基因传播在同种和不同种细菌间ꎬ最终导致临床上耐药现象的泛滥ꎮ整合子是Ｓｔｏｋｅｓ和Ｈａｌｌ于１９８９年首次提出的ꎬ由两端的保守区和中间的可变区构成ꎬ可变区中含有多种基因盒ꎬ大部分为耐药基因盒ꎬ在５ᶄ端保守段包含有编码整合酶的ｉｎｔＩ基因和负责基因转录的启动子ꎬ当整合子捕获到耐药基因盒后ꎬ在启动子的作用下发生转录从而使细菌获得耐药性ꎮ整合子根据其整合酶编码基因序列的不同可分为６类ꎬ其中Ⅰ类整合子最为常见且与铜绿假单胞菌耐药密切相关ꎮ目前在Ⅰ类整合子可变区中发现多种耐药基因盒ꎬ如ＶＩＭ㊁ＩＭＰ㊁ＳＨＶ等ꎬ这些耐药基因使铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素产生高耐药水平ꎮＫｈｏｓｒａｖｉ等[２２]通过研究发现铜绿假单胞菌耐药性与整合子密切相关ꎬ发现大多数(９５.７％)分离株包含Ⅰ类整合子且对美罗培南耐药性可达到(９０.３２％)ꎬ对亚胺培南的耐药率达(８３.８７％)ꎮ㊀㊀总之ꎬ铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素的耐药现象是多种耐药机制协同作用的结果ꎬ并不单纯是由一种因素造成ꎮＣＲＰＡ的出现ꎬ给临床治疗造成了巨大的压力ꎬ这需要我们进一步深入研究其耐药及流行机制ꎬ为指导抗生素的合理使用及开发新的有效抗菌药物提供理论依据ꎮ近年来ꎬ多位点序列分型(Ｍｕｌｔｉ￣ｌｏｃｕｓｓｅｑｕｅｎｃｅｔｙｐｉｎｇꎬＭＬＳＴ)被广泛用于记录细菌基因的变异ꎬ进而实现耐药菌株的追踪ꎬ对研究铜绿假单胞菌的耐药机制具有重要意义ꎮ多位点序列分型是Ｍａｉｄｅｎ等人在１９９８年提出的用于分析基因的核苷酸序列ꎬ进而发现细菌基因的变异ꎮＭＬＳＴ通过使用管家基因中的序列变异来定义类型ꎬ以ＳＴ编号为基本分析单位ꎬ每一个ＳＴ标号代表一种核苷酸序列信息ꎬ目前应用于耐药菌株的追踪ꎮ通过对铜绿假单胞菌的７个管家基因(ａｃｓＡ㊁ａｒｏＥ㊁ｇｕａＡ㊁ｍｕｔＬ㊁ｎｕｏＤ㊁ｐｐｓＡ和ｔｒｐＥ)进行ＰＣＲ扩增纯化ꎬ产物测序后与ＢＬＡＳＴ对比得出七个管家基因等位基因谱编号ꎬ依据编号的组合即能够得到ＳＴ型ꎬ进而实现对全球铜绿假单胞菌的流行趋势及毒力进化变异的追踪调查ꎮ在铜绿假单胞菌中ꎬＭＢＬｓ的产生通常与序列类型(ＳＴｓ)１１１㊁１７５㊁３５７和２３５的多耐药高风险克隆相关ꎬ表明高风险克隆在成功传播临床重要抗药性决定因素中的重要作用ꎮＰａｐａｇｉａｎｎｉｔｓｉｓ等[２３]发现捷克医院中携带ＩＭＰ－７的铜绿假单胞菌中ＳＴ３５７克隆编码整合子Ｉｎ－ｐ１１０ꎬ证明大多数ＳＴ３５７分离株与ＩＭＰ型ＭＢＬｓ的产生相关ꎮＶａｎｅｇａｓ等[２４]研究表明高抗生素选择压力有利于多克隆的出现ꎬ这些克隆能够分别含有ＫＰＣ和ＶＩＭ碳青霉烯酶ꎬ主要是ＳＴ２３５和ＳＴ１１１ꎬ但同时出现其他克隆如ＳＴ１７５５㊁ＳＴ４６３ꎮ序列类型２３５(ＳＴ２３５)是重要的铜绿假单胞菌克隆ꎬ铜绿假单胞菌ＳＴ２３５可以通过突变和获得当地耐药基因ꎬ对碳青霉烯类抗生素产生耐药性[２５]ꎮ在ＳＴ２３５中已经描述了多种碳青霉烯酶ꎬ最常见的是ＶＩＭꎬ其次是ＩＭＰꎬＯＸＡꎬＧＥＳꎬＫＰＣ和ＮＤＭꎮ目前发现质粒编码的产ＮＤＭ－１的铜绿假单胞菌ＭＬＳＴ分型有ＳＴ２３５ꎬ染色体编码的ＫＰＣ基因可能有利于产生ＫＰＣ的铜绿假单胞菌ＳＴ２３５扩增时的传播ꎮＨｕ等[２６]首次报道了产生ＫＰＣ－２的ＳＴ４６３铜绿假单胞菌分离株的克隆ꎬ该克隆在浙江省快速出现和传播ꎮ参考文献[１]㊀中华医学会呼吸病学分会感染学组.铜绿假单胞菌下呼吸道感染诊治专家共识[Ｊ].中华结核和呼吸杂志ꎬ２０１４ꎬ３７(１):９－１６.[２]㊀ＺａｖａｓｃｋｉＡＰꎬＣａｒｖａｌｈａｅｓＣＧꎬＰｉｃãｏＲＣꎬｅｔａｌ.Ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ－ｒｅ￣ｓｉｓｔａｎｔｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａａｎｄａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｂａｕｍａｎ￣ｎｉｉ:ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｓａｎｄｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒｔｈｅｒａｐｙ[Ｊ].ＥｘｐｅｒｔＲｅｖＡｎｔｉＩｎｆｅｃｔＴｈｅｒꎬ２０１０ꎬ８(１):７１－９３. [３]㊀ＨｏｎｇＤＪꎬＢａｅＩＫꎬＪａｎｇＩＨꎬｅｔａｌ.Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒ￣ｉｓｔｉｃｓｏｆｍｅｔａｌｌｏ－β－ｌａｃｔａｍａｓｅ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ[Ｊ].ｉｎｆｅｃｔｃｈｅｍｏｔｈｅｒꎬ２０１５ꎬ４７(２):８１－９７. [４]㊀ＳａｄｅｒＨＳꎬＨｕｂａｎｄＭＤꎬＣａｓｔａｎｈｅｉｒａＭꎬｅｔａｌ.Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙｒｅｓｕｌｔｓｆｒｏｍｆｏｕｒｙｅａｒｓ(２０１２ｔｏ２０１５)ｏｆｔｈｅｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｎｅｔｗｏｒｋｆｏｒｏｐｔｉｍａｌｒｅ￣ｓｉｓｔａｎｃｅｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇｐｒｏｇｒａｍｉｎｔｈｅｕｎｉｔｅｄｓｔａｔｅｓ[Ｊ].Ａｎｔｉｍｉ￣ｃｒｏｂＡｇｅｎｔｓＣｈｅｍｏｔｈｅｒꎬ２０１７ꎬ６１(３):ｅ０２２５２－０２２６７.[５]㊀ＧｅＣꎬＷｅｉＺꎬＪｉａｎｇＹꎬｅｔａｌ.ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＫＰＣ－２－ｐｒｏ￣ｄｕｃｉｎｇｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａｉｓｏｌａｔｅｓｉｎＣｈｉｎａ[Ｊ].ＪＡｎｔｉ￣ｍｉｃｒｏｂＣｈｅｍｏｔｈｅｒꎬ２０１１ꎬ６６(５):１１８４－１１８６. [６]㊀ＧａｒｃíａＲＤꎬＮｉｃｏｌａＦꎬＺａｒａｔｅＳꎬｅｔａｌ.ＥｍｅｒｇｅｎｃｅｏｆＰｓｅｕｄｏ￣ｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａｗｉｔｈＫＰＣ－ｔｙｐｅｃａｒｂａｐｅｎｅｍａｓｅｉｎａｔｅａｃｈｉｎｇｈｏｓｐｉｔａｌ:ａｎ８－ｙｅａｒｓｔｕｄｙ[Ｊ].ＪＭｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌꎬ２０１３ꎬ６２(Ｐｔ１０):１５６５－１５７０.[７]㊀万强ꎬ李娟ꎬ陈杨.辽宁省大连市耐亚胺培南铜绿假单胞菌产金属β－内酰胺酶基因检测及脉冲场凝胶电泳分型[Ｊ].疾病监测ꎬ２０１７ꎬ(１):３８－４２.[８]㊀ＰｏｌｌｉｎｉＳꎬＭａｒａｄｅｉＳꎬＰｅｃｉｌｅＰꎬｅｔａｌ.ＦＩＭ－１ａｎｅｗａｃｑｕｉｒｅｄｍｅｔａｌｌｏ－β－ｌａｃｔａｍａｓｅｆｒｏｍａＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａｃｌｉｎ￣ｉｃａｌｉｓｏｌａｔｅｆｒｏｍＩｔａｌｙ[Ｊ].ＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂＡｇｅｎｔｓＣｈｅｍｏｔｈｅｒꎬ２０１３ꎬ５７(１):４１０－４１６.[９]㊀ＰｆｅｎｎｉｇｗｅｒｔｈＮꎬＬａｎｇｅＦꎬＢｅｌｍａｒＣＣꎬｅｔａｌ.Ｇｅｎｅｔｉｃａｎｄｂｉｏ￣ｃｈｅｍｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＨＭＢ－１ꎬａｎｏｖｅｌｓｕｂｃｌａｓｓＢ１ｍｅｔａｌｌｏ－β－ｌａｃｔａｍａｓｅｆｏｕｎｄｉｎａＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａｃｌｉｎｉｃａｌｉｓｏｌａｔｅ[Ｊ].ＪＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂＣｈｅｍｏｔｈｅｒꎬ２０１７ꎬ７２(４):１０６８－１０７３.[１０]㊀ＲíｏｓＰꎬＲｏｃｈａＣꎬＣａｓｔｒｏＷꎬｅｔａｌ.Ｅｘｔｅｎｓｉｖｅｌｙｄｒｕｇ－ｒｅｓｉｓｔ￣ａｎｔ(ＸＤＲ)ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｉｎＬｉｍａＰｅ￣ｒｕｃｏ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇａＶＩＭ－２ｍｅｔａｌｌｏ－β－ｌａｃｔａｍａｓｅꎬＯＸＡ－１β－ｌａｃｔａｍａｓｅａｎｄＧＥＳ－１ｅｘｔｅｎｄｅｄ－ｓｐｅｃｔｒｕｍβ－ｌａｃｔａｍａｓｅ[Ｊ].ＪＭＭＣａｓｅＲｅｐꎬ２０１８ꎬ５(７):ｅ００５１５４. [１１]㊀ＢｅｒｔＦꎬＢｒａｎｇｅｒＣꎬＬａｍｂｅｒｔ－ＺｅｃｈｏｖｓｋｙＮ.ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＰＳＥａｎｄＯＸＡｂｅｔａ－ｌａｃｔａｍａｓｅｇｅｎｅｓｉｎＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａｕｓｉｎｇＰＣＲ－ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｆｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈｐｏｌｙｍｏｒ￣ｐｈｉｓｍ[Ｊ].ＪＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂＣｈｅｍｏｔｈｅｒꎬ２００２ꎬ５０(１):１１－１８. [１２]㊀刘晓一ꎬ刘文恩.ＯＸＡ型超广谱β－内酰胺酶的研究进展[Ｊ].中国感染控制杂志ꎬ２０１０ꎬ(６):４６２－４６７. [１３]㊀ＥｌＧＦꎬＢｏｇａｅｒｔｓＰꎬＢｅｂｒｏｎｅＣꎬｅｔａｌ.ＯＸＡ－１９８ａｎａｃｑｕｉｒｅｄｃａｒｂａｐｅｎｅｍ－ｈｙｄｒｏｌｙｚｉｎｇｃｌａｓｓＤｂｅｔａ－ｌａｃｔａｍａｓｅｆｒｏｍＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ[Ｊ].ＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂＡｇｅｎｔｓＣｈｅｍｏｔｈ￣ｅｒꎬ２０１１ꎬ５５(１０):４８２８－４８３３.[１４]㊀ＢｏｎｎｉｎＲＡꎬＢｏｇａｅｒｔｓＰꎬＧｉｒｌｉｃｈＤꎬｅｔａｌ.ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｈａｒａｃ￣ｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｏｘａ－１９８ｃａｒｂａｐｅｎｅｍａｓｅ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇｐｓｅｕｄｏ￣ｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａｃｌｉｎｉｃａｌｉｓｏｌａｔｅｓ[Ｊ].ＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂＡｇｅｎｔｓＣｈｅｍｏｔｈｅｒꎬ２０１８ꎬ６２(６):ｅ２０４９６－２０５１７.[１５]㊀ＬｉｕＨꎬＫｏｎｇＷꎬＹａｎｇＷꎬｅｔａｌ.ＭｕｌｔｉｌｏｃｕｓｓｅｑｕｅｎｃｅｔｙｐｉｎｇａｎｄｖａｒｉａｔｉｏｎｓｉｎｔｈｅｏｐｒＤｇｅｎｅｏｆＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍａｈｏｓｐｉｔａｌｉｎＣｈｉｎａ[Ｊ].ＩｎｆｅｃｔＤｒｕｇＲｅｓｉｓｔꎬ２０１８ꎬ１１:４５－５４.[１６]㊀ＳｈａｒｉａｔｉＡꎬＡｚｉｍｉＴꎬＡｒｄｅｂｉｌｉＡꎬｅｔａｌ.Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｌｉｎａｃｔｉｖａ￣ｔｉｏｎｏｆｏｐｒＤｉｎｃａｒｂａｐｅｎｅｍ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉ￣ｎｏｓａｓｔｒａｉｎｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｂｕｒｎｐａｔｉｅｎｔｓｉｎＴｅｈｒａｎꎬＩｒａｎ[Ｊ].ＮｅｗＭｉｃｒｏｂｅｓＮｅｗＩｎｆｅｃｔꎬ２０１８ꎬ２１:７５－８０.[１７]㊀ＰｏｕｒａｋｂａｒｉＢꎬＹａｓｌｉａｎｉｆａｒｄＳꎬＹａｓｌｉａｎｉｆａｒｄＳꎬｅｔａｌ.Ｅｖａｌｕａ￣ｔｉｏｎｏｆｅｆｆｌｕｘｐｕｍｐｓｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｔｐｓｅｕｄｏ￣ｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａｉｓｏｌａｔｅｓｉｎａｎｉｒａｎｉａｎｒｅｆｅｒｒａｌｈｏｓｐｉｔａｌ[Ｊ].ＩｒａｎＪＭｉｃｒｏｂｉｏｌꎬ２０１６ꎬ８(４):２４９－２５６.[１８]㊀曾章锐ꎬ王卫萍ꎬ王莹ꎬ等.碳青霉烯类抗生素诱导铜绿假单胞菌外膜蛋白及外排系统突变的机制研究[Ｊ].临床检验杂志ꎬ２０１３ꎬ(６):４５０－４５４.[１９]㊀ＣｈｏｕｄｈｕｒｙＤꎬＤａｓＴＡꎬＤｕｔｔａＣＭꎬｅｔａｌ.Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌａ￣ｎａｌｙｓｉｓｏｆｍｅｘａｂ－ｏｐｒｍｅｆｆｌｕｘｐｕｍｐｓｓｙｓｔｅｍｏｆｐｓｅｕｄｏ￣ｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａａｎｄｉｔｓｒｏｌｅｉｎｃａｒｂａｐｅｎｅｍｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎａｔｅｒｔｉａｒｙｒｅｆｅｒｒａｌｈｏｓｐｉｔａｌｉｎｉｎｄｉａ[Ｊ].ＰＬｏＳＯｎｅꎬ２０１５ꎬ１０(７):ｅ０１３３８４２.[２０]㊀ＨａＤＧꎬＯ'ＴｏｏｌｅＧＡ.ｃ－ｄｉ－ＧＭＰａｎｄｉｔｓｅｆｆｅｃｔｓｏｎｂｉｏｆｉｌｍｆｏｒｍａｔｉｏｎａｎｄｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ:ａｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａｒｅｖｉｅｗ[Ｊ].ＭｉｃｒｏｂｉｏｌＳｐｅｃｔｒꎬ２０１５ꎬ３(２):ＭＢ－０００３－２０１４. [２１]㊀ＴａｙｌｏｒＰＫꎬＶａｎＫｅｓｓｅｌＡＴＭꎬＣｏｌａｖｉｔａＡꎬｅｔａｌ.ＡｎｏｖｅｌｓｍａｌｌＲＮＡｉｓｉｍｐｏｒｔａｎｔｆｏｒｂｉｏｆｉｌｍｆｏｒｍａｔｉｏｎａｎｄｐａｔｈｏｇｅ￣ｎｉｃｉｔｙｉｎＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ[Ｊ].ＰＬｏＳＯｎｅꎬ２０１７ꎬ１２(８):ｅ０１８２５８２.[２２]㊀ＫｈｏｓｒａｖｉＡＤꎬＭｏｔａｈａｒＭꎬＡｂｂａｓｉＭＥ.Ｔｈｅｆｒｅｑｕｅｎｃｙｏｆｃｌａｓｓ１ａｎｄ２ｉｎｔｅｇｒｏｎｓｉｎＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａｓｔｒａｉｎｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｂｕｒｎｐａｔｉｅｎｔｓｉｎａｂｕｒｎｃｅｎｔｅｒｏｆＡｈｖａｚꎬＩｒａｎ[Ｊ].ＰＬｏＳＯｎｅꎬ２０１７ꎬ１２(８):ｅ０１８３０６１.[２３]㊀ＰａｐａｇｉａｎｎｉｔｓｉｓＣＣꎬＭｅｄｖｅｃｋｙＭꎬＣｈｕｄｅｊｏｖａＫꎬｅｔａｌ.Ｍｏｌｅｃ￣ｕｌａｒｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｃａｒｂａｐｅｎｅｍａｓｅ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇｐｓｅｕｄｏ￣ｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａｏｆｃｚｅｃｈｏｒｉｇｉｎａｎｄｅｖｉｄｅｎｃｅｆｏｒｃｌｏｎａｌｓｐｒｅａｄｏｆｅｘｔｅｎｓｉｖｅｌｙｒｅｓｉｓｔａｎｔｓｅｑｕｅｎｃｅｔｙｐｅ３５７ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇＩＭＰ－７Ｍｅｔａｌｌｏ－β－Ｌａｃｔａｍａｓｅ[Ｊ].ＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂＡｇｅｎｔｓＣｈｅｍｏｔｈｅｒꎬ２０１７ꎬ６１(１２):１８１１－１８１７.[２４]㊀ＶａｎｅｇａｓＪＭꎬＣｉｅｎｆｕｅｇｏｓＡＶꎬＯｃａｍｐｏＡＭꎬｅｔａｌ.Ｓｉｍｉｌａｒｆｒｅ￣ｑｕｅｎｃｉｅｓｏｆｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａｉｓｏｌａｔｅｓｐｒｏｄｕｃｉｎｇｋｐｃａｎｄｖｉｍｃａｒｂａｐｅｎｅｍａｓｅｓｉｎｄｉｖｅｒｓｅｇｅｎｅｔｉｃｃｌｏｎｅｓａｔｔｅｒｔｉａ￣ｒｙ－ｃａｒｅｈｏｓｐｉｔａｌｓｉｎｍｅｄｅｌｌíｎꎬｃｏｌｏｍｂｉａ[Ｊ].ＪＣｌｉｎＭｉｃｒｏ￣ｂｉｏｌꎬ２０１４ꎬ５２(１１):３９７８－３９８６.[２５]㊀ＴｒｅｅｐｏｎｇＰꎬＫｏｓＶＮꎬＧｕｙｅｕｘＣꎬｅｔａｌ.ＧｌｏｂａｌｅｍｅｒｇｅｎｃｅｏｆｔｈｅｗｉｄｅｓｐｒｅａｄＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａＳＴ２３５ｃｌｏｎｅ[Ｊ].ＣｌｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌＩｎｆｅｃｔꎬ２０１８ꎬ２４(３):２５８－２６６.[２６]㊀Ｃａｒｒａｒａ－ＭａｒｒｏｎｉＦＥꎬＣａｙôＲꎬＳｔｒｅｌｉｎｇＡＰꎬｅｔａｌ.Ｅｍｅｒ￣ｇｅｎｃｅａｎｄｓｐｒｅａｄｏｆｋｐｃ－２－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａｉｓｏｌａｔｅｓｉｎａｂｒａｚｉｌｉａｎｔｅａｃｈｉｎｇｈｏｓｐｉｔａｌ[Ｊ].ＪＧｌｏｂＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂＲｅｓｉｓｔꎬ２０１５ꎬ３(４):３０４－３０６.(收稿日期:２０１９￣０２￣２６)。

铜绿假单胞菌对碳青霉烯类耐药的机制及临床研究[关键词] 铜绿假单胞菌；耐药性；美罗培南；亚胺培南各种抗假单胞菌药物在治疗铜绿假单胞菌感染过程中或治疗后可出现不同程度的耐药导致治疗失败，但各种药物诱导耐药的相对危险性可有差异。

了解铜绿假单胞菌对碳青霉烯类耐药的机制，及时掌握新的耐药动向及其相关因素，有助于制定切合实际的控制耐药方案。

1铜绿假单胞菌对碳青霉烯类耐药的机制OprD为铜绿假单胞菌外膜孔道蛋白，可被动性摄取碱性氨基酸，亦可渗透碳青霉烯类药物。

对亚胺培南的渗透率为736nm／s，对美罗培南为73nm／s，表明亚胺培南透入铜绿假单胞菌比美罗培南快10倍。

OprD丢失后，两者的渗透率分别为6nm／s及5.5nm／s，对亚胺培南的MIC从1-2mg／L上升到8-32mg ／L，对美罗培南的MIC从0.12～0.5mg／L上升到2~4mg／L。

铜绿假单胞菌OprD丢失或下降是介导对亚胺培南耐药的主要机制，对美罗培南的影响较少可能与通过尚未确定的通道进入菌体有关。

因单纯OprD丢失不影响对非碳青霉烯类药物的敏感性，属窄谱耐药机制。

亚胺培南为强力β-内酰胺酶诱导剂，诱导铜绿假单胞菌产生Bush IB-内酰胺酶，Bush I酶可快速水解抗假单胞菌头孢菌素类及青霉素类药物，但对亚胺培南只具缓慢水解作用。

铜绿假单胞菌外膜孔道蛋白(OprD)丢失可引起对亚胺培南耐药，但若单纯OprD丢失而无β一内酰胺酶参入，则对亚胺培南的MIC只由0.25mg ／L增至0.5mg／L，若OprD丢失同时伴口一内酰胺酶的作用，则可使其MIC 增至16mg／L，表明β-内酰胺酶与渗透性改变介导对亚胺培南耐药具协同作用。

美罗培南比亚胺培南对β-内酰胺酶更稳定，OprD丢失伴β-内酰胺酶作用仅使铜绿假单胞菌对美罗培南的MIC增至2-4mg／L。

产金属β-内酰胺酶的菌株亦可能需要OprD丢失才对碳青霉烯类耐药，虽然产金属酶类药物仍属少见，但正在成为铜绿假单胞菌对亚胺培南及美罗培南高度耐药的原因，并可能成为今后严重的问题。

碳青霉烯类的使用量与铜绿假单胞菌耐药性分析田红英;杜江;马张稳【摘要】目的探讨碳青霉烯类抗菌药物的用药频度(DDDs)与铜绿假单胞菌对其耐药性的相关性,指导临床合理用药.方法对延安大学附属医院2011～2015年临床送检做细菌培养的各类临床标本分离出的铜绿假单胞菌及其对碳青霉烯类抗菌药物的药敏结果进行回顾性分析.结果共分离临床感染菌株8995株,其中绿假单胞菌菌株1542株,占临床感染菌株分离菌株数的17.14％.碳青霉烯类抗生素DDDs值、亚胺培南/西司他丁和美罗培南的DDDs值呈先升后降的趋势,而帕尼培南/倍他米隆和比阿培南的DDDs值呈逐年下降的趋势.与2011年相比,2012、2013、2014、2015年碳青霉烯类抗生素DDDs值分别上升了6.50％、26.46％、56.37％和22.77％.铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素的耐药率与碳青霉烯类抗生素DDDs值之间呈显著相关(r=0.925,P＜0.05).结论铜绿假单胞菌耐药形势十分严峻,铜绿假单胞菌耐药性与碳青霉烯类抗生素的用药量具有相关性.【期刊名称】《延安大学学报（医学科学版）》【年(卷),期】2017(015)002【总页数】3页(P13-15)【关键词】碳青霉烯类抗生素;铜绿假单胞菌;用药频度;耐药性【作者】田红英;杜江;马张稳【作者单位】延安大学医学院病原生物学教研室,陕西延安716000;延安市人民医院普外科二病区,陕西延安716000;延安大学附属医院创伤修复外科,陕西延安716000【正文语种】中文铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa) 为非发酵革兰阴性菌，是医院感染的主要致病菌，易形成获得性耐药[1]。

临床上可选择的药物极其有限，对其感染治疗一直较为棘手，病死率亦高。

而监测铜绿假单胞菌的耐药性的变化，对临床用药指导和减少广谱耐药菌的均有着重要的现实意义。

碳青霉烯类是临床上常用的治疗革兰阴性菌感染的抗生素类药物，特别是对铜绿假单胞菌为医院感染的首选药物，也使得铜绿假单胞菌对其产生了耐药性[2-3]，给临床治疗带来很大困难。

Mod Diagn Treat 现代诊断与治疗2021Apr 32(8)肠杆菌科细菌碳青霉烯类抗生素耐药治疗的研究进展吴鸿滨(天津市第五中心医院检验科,天津300450)Research Progress in the Treatment of Carbapenem-resistant Enter 鄄obacteriaceaeWU Hong-bin (Department of Clinical Laboratory,Peking University Binhai Hospital,Tianjin 300450,China )Abstract :Enterobacteriaceae are facultative anaerobic or obligate aerobic gram -negative bacilli and coccobacillusthat widely exist in human and in the intestine of most warm-blooded animals,and most of them are normal flora.As one of the most widely distributed pathogenic bacteria,Enterobacteriaceae can be transformed into conditional pathogenic bacteriawhen the immunity of host decreases,which not only causes external acquired infection,but also iatrogenic infection inside the hospital.Carbapenems are β-lactam antibiotics with broadantibacterial spectrum and strong antibacterial property,and is thus often used as the final drug therapyin the treatment of multi-drugresistant gram-negative bacillus infection.However,the unscientific usage and dosage of broad-spectrum antibioticsin recent years has given rise toa large number of carbapenem-resistant Enterobacteriaceae (CRE),the drug resistance rate ofwhich is increasing year by year.Keywords :Enterobacteriaceae ;Drug resistance ;Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae ;Resistance mechanism;Ther ⁃影响,其不同形状大小会对患者治疗效果产生较大影响,在治疗时应根据患者实际情况进行选择。

中国畜牧兽医 2024,51(4):1717-1728C h i n aA n i m a lH u s b a n d r y &V e t e r i n a r y Me d i c i n e 树鼩源碳青霉烯耐药性铜绿假单胞菌的分离鉴定及生物学特性研究穆政融1,程晴晴1,张东洁2,5,翟珊珊2,李竹欣2,陶俊宇2,3,4,冷 静1,2,3,4(1.广西医科大学基础医学院,南宁530021;2.广西中医药大学,南宁530200;3.广西高发传染病中西医结合转化医学重点实验室,南宁530200;4.广西特色实验动物病证模型重点实验室,南宁530200;5.南宁市中医医院,南宁530001)摘 要:ʌ目的ɔ确定养殖过程中死亡树鼩的致病原因并分析病原的生物学特性㊁致病性和耐药情况,制定防治方法㊂ʌ方法ɔ对死亡树鼩进行病理剖检,记录肺脏㊁肝脏㊁脾脏㊁肠道等主要脏器的病变情况,通过平板划线法从主要病变脏器中分离单个菌落,观察菌落形态并进行革兰染色镜检,通过生化试验㊁药敏试验㊁致病性试验及16Sr R N A 基因测序和全基因组测序等手段对分离株进行进一步分析㊂ʌ结果ɔ从死亡滇西树鼩的脾脏㊁肠道中分离获得1株碳青霉烯耐药性铜绿假单胞菌,分离菌株在L B 琼脂培养基中呈现产绿色水溶色素的灰白色菌落,镜检为革兰阴性杆菌;生化试验进一步证实分离菌为非发酵菌;通过序列进化分析可知,分离菌与G e n B a n k 收录的土壤来源铜绿假单胞菌F 4相似性高达99%㊂药敏试验结果显示,分离菌对亚胺培南和美罗培南等碳青霉烯类及左氧氟沙星等喹诺酮类抗菌药均具有一定的耐药性㊂致病性试验结果显示,该分离株对成年昆明小鼠的半数致死量(L D 50)为3.382ˑ108C F U ,对死亡小鼠脏器组织进行病理学观察,可见肺脏㊁肝脏㊁脾脏㊁肠道等的炎性损伤和坏死㊂对各脏器再次进行细菌分离,基于16S r R N A 序列分析发现铜绿假单胞菌可在死亡小鼠的脾脏㊁肠道㊁血液中存在,具有较高的致病性㊂全基因组测序结果证实,分离菌具有碳青霉烯耐药性相关基因,并与铜绿假单胞菌高致病参考菌株具有相似的毒力因子基因㊂ʌ结论ɔ本研究从病死滇西树鼩体内分离出碳青霉烯耐药性铜绿假单胞菌,为树鼩微生物致病研究和驯化养殖提供了新的理论依据㊂关键词:树鼩;铜绿假单胞菌;耐药性中图分类号:S 852.61文献标识码:AD o i :10.16431/j.c n k i .1671-7236.2024.04.039 开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):收稿日期:2023-10-07基金项目:广西特色实验动物病证模型重点实验室建设项目(04B 21126);广西高发传染病中西医结合转化医学重点实验室(K J T 19044)联系方式:穆政融,E -m a i l :q d m u z r @163.c o m ㊂通信作者陶俊宇,E -m a i l :t a o j y @g x t c m u .e d u .c n ;冷静,E -m a i l :l j986771558@163.c o m I s o l a t i o n ,I d e n t i f i c a t i o na n dB i o l o g i c a l C h a r a c t e r i s t i c s o fC a r b a pe n e m -r e s i s t a n t P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s af r o m T u p a i a b e l a n ge r i MUZ h e n g r o n g 1,C H E N G Q i n g q i n g 1,Z H A N G D o n g ji e 2,5,Z H A I S h a n s h a n 2,L I Z h u x i n 2,T A OJ u n y u 2,3,4,L E N GJ i n g1,2,3,4(1.S c h o o l o f B a s i cM e d i c i n e ,G u a n g x iM e d i c a lU n i v e r s i t y ,N a n n i n g 530021,C h i n a ;2.G u a n g x i U n i v e r s i t y o f C h i n e s eM e d i c i n e ,N a n n i n g 530200,C h i n a ;3.G u a n g x iK e yL a b o r a t o r y o f T r a n s l a t i o n a lM e d i c i n e f o rT r e a t i n g H i g h -i n c i d e n c e I n fe c t i o u sD i s e a s e s w i t h I n t e g r a t i v eM e d i c i n e ,N a n n i n g 530200,C h i n a ;4.K e y L a b o r a t o r yf o rC o m p l e m e n t a r y a n dA l t e r n a t i v eM e d i c i n eE x p e r i m e n t a lA n i m a lM o d e l s o f G u a ng x i ,N a n n i n g 530200,C h i n a ;5.N a n n i n g T r a d i t i o n a lC h i n e s eM e d i c i n eH o s p i t a l ,N a n n i n g 530001,C h i n a )A b s t r a c t :ʌO b j e c t i v e ɔT h i se x p e r i m e n tw a sa i m e dt od e t e r m i n et h ec a u s eo fd e a t ho f T u pa i ab e l a n ge r i d u r i n g t h eb r e e d i n gp r o c e s s ,a n a l y z et h eb i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c s ,p a t h o g e n i c i t y a n d中国畜牧兽医51卷d r u g r e s i s t a n c e o ft h e p a t h o g e n,a n d d e v e l o p p r e v e n t i o n a n d c o n t r o l m e t h o d s.ʌM e t h o dɔP a t h o l o g i c a l d i s s e c t i o nw a s p e r f o r m e d o n t h e d e a d T u p a i a b e l a n g e r i a n d t h e p a t h o l o g i c a l c h a n g e s o f e a c hm a j o r o r g a nw e r e r e c o r d e d,i n c l u d i n g l u n g,l i v e r,s p l e e n a n d i n t e s t i n e.S i n g l e c o l o n i e sw e r e i s o l a t e d f r o mt h em a i nd i s e a s e do r g a n s u s i n g t h e s t r e a k p l a t em e t h o d,a n d t h em o r p h o l o g y o f t h e c o l o n i e s w a s o b s e r v e d.A tt h e s a m e t i m e,G r a m s t a i n i n g w a s u s e d t o o b s e r v e u n d e r t h e m i c r o s c o p e,f o l l o w e db y b i o c h e m i c a la n dd r u g r e s i s t a n c et e s t s,a n d p a t h o g e n i c i t y t e s t.F u r t h e r a n a l y s i sw a sc o n d u c t e do nt h ei s o l a t e ds t r a i n su s i n g16Sr R N A g e n es e q u e n c i n g a n db a c t e r i a g e n o m e s e q u e n c i n g.ʌR e s u l tɔAc a r b a p e n e m-r e s i s t a n t P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a s t r a i nw a s i s o l a t e df r o mt h e s p l e e na n d i n t e s t i n e o f t h ed e c e a s e d T u p a i a b e l a ng e r i chi n e n s i s.T h e i s o l a t e p r e s e n t e d ag r a y-w h i t e c o l o n yp r o d u c i n gg r e e n w a t e r-s o l u b l e p i g m e n t s i nL Ba g a rm e d i u m,a n d w a sG r a m-n e g a t i v eu n d e r m i c r o s c o p e.B i o c h e m i c a lt e s t sf u r t h e rc o n f i r m e dt h a ti t w a sa n o n-f e r m e n t i n g b a c t e r i u m.S e q u e n c e e v o l u t i o na n a l y s i s s h o w e d t h a t i th a dah i g hs i m i l a r i t y o f99%w i t ht h e s o i l s o u r c e P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a F4i nG e n B a n k.T h e d r u g s e n s i t i v i t y t e s t r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e i s o l a t e ds t r a i nh a d c e r t a i n r e s i s t a n c e t o c a r b a p e n e ma n t i b i o t i c s s u c h a s i m i p e n e ma n dm e r o p e n e m, a sw e l l a s q u i n o l o n e a n t i b i o t i c s s u c h a s l e v o f l o x a c i n.T h e p a t h o g e n i c i t y t e s t r e s u l t s h o w e d t h a t t h e m e d i a n l e t h a l d o s e(L D50)o f t h e i s o l a t e d s t r a i n t o a d u l tK u n m i n g m i c ew a s3.382ˑ108C F U.T h e o r g a n sa n dt i s s u e so fd e a d m i c e w e r ei s o l a t e df o r p a t h o l o g i c a lo b s e r v a t i o n,a n di n f l a m m a t o r y d a m a g e a n dn e c r o s i so f t h el u n g s,l i v e r,s p l e e n,i n t e s t i n e,e t c.w e r eo b s e r v e d.B a c t e r i a l i s o l a t i o n w a s c o n d u c t e d a g a i no nv a r i o u s o r g a n s,a n db a s e do n16Sr R N As e q u e n c e a n a l y s i s,P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a c o u l d b e f o u n d i n t h e s p l e e n,i n t e s t i n e a n d b l o o d o f d e a d m i c e,w i t h h i g h p a t h o g e n i c i t y.T h ew h o l e g e n o m es e q u e n c i n g r e s u l t sc o n f i r m e dt h a t t h e i s o l a t es t r a i nh a d g e n e s r e l a t e dt o c a r b a p e n e m r e s i s t a n c e a n d s h a r e d s i m i l a r v i r u l e n c ef a c t o r g e n e s w i t h t h e h i g h l y p a t h o g e n i cr e f e r e n c es t r a i no f P s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a.ʌC o n c l u s i o nɔT h i ss t u d y i s o l a t e do n e c a r b a p e n e m-r e s i s t a n t P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a f r o mt h ed e c e a s e d T u p a i a b e l a n g e r i,p r o v i d i n g a n e wt h e o r e t i c a lb a s i sf o rt h es t u d y o f m i c r o b i a l p a t h o g e n i c i t y a n d d o m e s t i c a t i o n o f T u p a i a b e l a n g e r i.K e y w o r d s:T u p a i a b e l a n g e r i;P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a;d r u g r e s i s t a n c e铜绿假单胞菌(P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a)又称绿脓杆菌,属假单胞菌属,需氧革兰阴性杆菌,普遍存在于饮用水㊁土壤等外界环境和动植物体内,为条件性人兽共患病原菌[1]㊂在机体免疫功能低下时,铜绿假单胞菌引发的严重感染会导致高发病率和高死亡率[2]㊂随着铜绿假单胞菌对碳青霉烯类化合物的抗性越来越强,碳青霉烯耐药性铜绿假单胞菌(c a r b a p e n e m-r e s i s t a n t P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a, C R P A)在全世界范围内的流行率不断上升,已成为导致全球性感染的主要病原体之一,占铜绿假单胞菌感染病例的10%~30%[3-4]㊂在世界卫生组织2017年列举的20种迫切需要新治疗方案的耐药细菌中,C R P A排名第2位[5]㊂树鼩(T u p a i ab e l a n g e r i)是一种小型哺乳动物,与人类在基因组结构和序列上有较高的相似性[6],尤其在免疫系统[7]㊁代谢途径和肝脏功能[8]等方面,这使得树鼩成为研究人类疾病模型的合适选择㊂此外,树鼩对一些传染性疾病具有易感性,如乙型肝炎病毒等[9],可用来建立相应的疾病模型,研究疾病的发病机制㊁传播途径及药物治疗的有效性㊂树鼩的肠道微生物群中普遍存在抗生素耐药菌株[10],但相关的报道甚少㊂近日,于广西中医药大学人工驯化养殖实验中心发现1只树鼩(滇西亚种,12月龄,雌性)精神萎靡不振,活动力严重减弱,无法对试验养殖者的喂食行为做出反应,遂在该树鼩死亡时对其进行剖检,对其器官进行细菌分离并进行了系统鉴定,通过药敏试验和成年昆明小鼠致病性试验确定其耐药特征及致病过程,以期为今后针对树鼩相关疾病的有效预防和研究提供参考依据㊂81714期穆政融等:树鼩源碳青霉烯耐药性铜绿假单胞菌的分离鉴定及生物学特性研究1材料与方法1.1材料1.1.1试验动物4周龄健康S P F级雄性昆明小鼠(25ʃ5)g购自斯贝福(北京)生物技术有限公司(许可证号:S C X K(京)2019 0010)㊂试验经广西中医药大学伦理审查委员会审查通过,动物使用遵循了3R(替代(r e p l a c e m e n t)㊁减少(r e d u c t i o n)和改良(r e f i n e m e n t))原则㊂1.1.2主要试剂 L B琼脂平板㊁哥伦比亚血琼脂平板㊁非发酵细菌鉴定管均购自广东环凯微生物科技有限公司;药敏纸片购自湖南比克曼生物科技有限公司;细菌D N A提取试剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司;电泳凝胶回收试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司;D r e a m T a q G r e e n P C R M a s t e rM i x购自赛默飞世尔科技有限公司;其他常规分析试剂均为分析纯㊂1.2方法1.2.1病死树鼩剖检与病理检查于超净工作台中剖检死亡树鼩,观察脏器病变情况,并取肺脏㊁肝脏㊁脾脏㊁肠道等组织,使用无菌手术刀切取病变组织制作病理切片,进行病理组织学观察㊂1.2.2细菌分离纯化使用接种环无菌取发病树鼩肝脏㊁脾脏㊁肺脏㊁肠道于灭菌生理盐水中充分搅拌溶解,用灭菌接种环挑取一环,用平板划线分离法将样本接种于L B琼脂平板和哥伦比亚血琼脂平板,37ħ恒温培养24h,观察菌落形态与特征,挑取可疑优势菌落继续接种于L B琼脂平板和哥伦比亚血琼脂平板培养24h,挑取单个菌落接种于营养琼脂斜面,4ħ保存待用㊂1.2.3细菌16Sr R N A测序分析使用浓度为2ˑ105U/m L的溶菌酶裂解细菌,并使用细菌D N A柱提法试剂盒提取细菌基因组D N A,并以此为模板使用16Sr R N A基因通用引物进行P C R扩增㊂引物序列:F:5'-A G A G T T T G A T C A T G G C T-C A G-3';R:5'-G T G T G A C G-G G C G G T G T G T A C-3'[11]㊂P C R反应体系50μL:D r e a m T a q G r e e n P C R M a s t e rM i x(2ˑ)25μL,D N A模板2μL,上㊁下游引物(10n m o l/L)各1μL,无菌无酶水21μL㊂P C R 反应条件:95ħ预变性5m i n;95ħ变性30s,55ħ退火30s,72ħ延伸1m i n,共35个循环;72ħ延伸5m i n㊂P C R产物进行2.0%琼脂糖凝胶电泳后进行胶回收,将回收的P C R产物委托生工生物工程(上海)股份有限公司测序,将测序后的序列进行B L A S T序列比对,得到同源性较高的菌株,采用M e g a11.0软件,以N e i g h b o r-J o i n i n g(N J)法[12]构建系统发育树㊂1.2.4细菌生长曲线测定与平板菌落计数采用比浊法测定细菌生长曲线,分别于4㊁8㊁12㊁24和36h测定菌液D600n m值,并在每个时间段取一定量的稀释液涂布到琼脂平板上,根据稀释倍数和取样接种量换算不同时间段含菌数,绘制 时间-吸光度-菌落数 曲线[13]㊂1.2.5细菌生化鉴定将分离纯化的菌株进行触酶试验,并按说明书接种于各生化反应管中,于37ħ恒温培养箱中培养24~48h,结合试验结果鉴定可疑菌株㊂1.2.6药敏试验根据美国临床实验室标准化协会(C L S I)发布的抗微生物药物敏感性试验执行标准,采用K i r b y-B a u e r纸片琼脂扩散法[14],根据抑菌圈直径(I Z D)大小检测细菌对9种抗菌药物的敏感性㊂1.2.7小鼠回归试验和病理检查将分离菌株接种于50m LL B液体培养基中,于37ħ摇床200r/m i n 培养过夜,依据改良寇氏(K a r b e r)法设计试验,将25只S P F级雄性昆明小鼠随机分为5组,每组5只,其中4组为感染组,分别通过腹腔注射浓度为1.2ˑ1010㊁1.2ˑ109㊁1.2ˑ108㊁1.2ˑ107C F U/m L 的分离菌菌液,每只注射0.2m L;剩余1组为对照组,注射等量的生理盐水㊂观察7d,记录小鼠发病及死亡情况,剖检1.2ˑ1010和1.2ˑ109C F U/m L 组死亡小鼠,依次观察肝脏㊁脾脏㊁肺脏㊁小肠等组织器官的病变状况,并于4%多聚甲醛中固定,制作石蜡切片进行H E染色观察㊂取相应脏器进行细菌培养,取脾脏㊁肠道㊁血液细菌菌液,基于16S r R N A序列二代测序进行微生物分类分析[15]㊂1.2.8细菌全基因组学分析细菌基因组测序和基因组组分㊁功能注释等分析委托深圳华大科技有限公司完成㊂获得测序菌株基因集合后,对基因进行综合性抗生素耐药性数据库(C A R D)[16]㊁致病菌毒力因子数据库(V F D B)[17]比对注释,确定与耐药和毒力因子[18]相关基因的种类与功能,明确C R P A相关的毒力因子表达情况㊂结合铜绿假单胞菌参考菌株P A O1(A T C C15692)㊁C r1(A T C C 9027)㊁B136-33[19]等,使用T r e e B e S T软件[20],基于各菌株基因家族分析结果,采用N J法构建系统发育树㊂依据V F D B毒力因子分类树绘制气泡热图㊂9171中国畜牧兽医51卷2结果2.1病死树鼩临床症状与病理剖检待解剖的树鼩处于濒死状态,反应迟钝,且伴有腹泻㊁抽搐等症状,观察数十分钟后死亡,遂即进行剖检㊂解剖发现其腹腔具有恶臭气味和渗出物,可见脾脏色泽暗沉(图1A),肠道严重产气(图1B),肠道内容物呈现黑色㊂H E染色镜检可见肠道和脾脏组织均损伤严重,形态紊乱㊂脾脏白髓和红髓界限模糊㊁形状不规则(图2A,箭头a),脾小梁数量明显增多,炎细胞浸润较明显(图2A,箭头b);肠组织结构基本完整,绒毛上皮细胞坏死脱落(图2B,箭头c),绒毛间质中有大量炎细胞浸润(图2B,箭头d)㊂2.2细菌分离培养与生化鉴定结果将死亡树鼩的脾脏㊁肠道样品中分离获得的2株可疑菌株,划线于L B琼脂平板和哥伦比亚血平板,脾脏和肠道组织划线的平板上均可分离出产绿色水溶色素的灰白色菌落,通过观察血平板可发现溶血现象且菌落呈现金属光泽(图3A),分离菌革兰染色镜检显示为革兰阴性杆菌(图3B)㊂A,脾脏;B,肠道㊂下同A,S p l e e n;B,I n t e s t i n e.T h e s a m e a sb e l o w图1感染树鼩脏器病变F i g.1P a t h o l o g i c a l o r g a n s o f i n f e c t e d T u p a i a b e l a n g e ri图2感染树鼩组织病理学观察(400ˑ)F i g.2H i s t o p a t h o l o g i c a l o b s e r v a t i o no f i n f e c t e d T u p a i a b e l a n g e r i(400ˑ)图3分离菌株血平板培养菌落形态(A)及革兰染色镜检(B,1000ˑ)观察F i g.3O b s e r v a t i o no f c o l o n y m o r p h o l o g y i nb l o o d p l a t e c u l t u r e(A)a n dG r a ms t a i n i n g m i c r o s c o p y(B,1000ˑ)o f t h e i s o l a t e 02714期穆政融等:树鼩源碳青霉烯耐药性铜绿假单胞菌的分离鉴定及生物学特性研究2.3 分离菌株16S r R N A 测序与分析对树鼩肠道和脾脏分离到的2株细菌16S r R N A 基因P C R 扩增获得长度约为1300b p 的片段(图4),目的片段回收进行一代测序,测序结果经B L A S T 序列比对,结果表明2条序列测序结果一致,与铜绿假单胞菌F 4(H F 572851)的相似性为99%㊂本研究将其命名为MU 45-B 02,结合不同来源(人类㊁动植物㊁土壤㊁水等)相似性较高的铜绿假单胞菌株16Sr R N A 序列构建系统发育树,结果显示,分离菌株MU 45-B 02与G e n B a n k 中收录的从不同物种或环境中分离的铜绿假单胞菌处于相同的大分支内,有较近的亲缘关系(图5),基于16S r R N A 序列的高度保守性,确定分离株为铜绿假单胞菌㊂M ,G N 3KD N A M a r k e r ;1,空白对照;2,肠道分离株;3,脾脏分离株M ,G N 3K D N A M a r k e r ;1,B l a n k c o n t r o l ;2,I s o l a t ef r o m i n t e s t i n e ;3,I s o l a t e f r o ms pl e e n 图4 分离菌株16S r R N A 基因P C R 扩增结果电泳图F i g .4 P C R a m p l i f i c a t i o ne l e c t r o p h e r o g r a m o f16Sr R N A ge n e of t h e i s o l a t e d s t r a in 图5 分离菌株与参考菌株基于16S r R N A 基因的系统发育树F i g .5 P h y l o ge n e t i c t r e e of t h e i s o l a t e d s t r a i na n d r e f e r e n c e s t r a i n s b a s e do n16S r R N Ag e n e 2.4 分离菌株生长曲线和吸光度-菌落数曲线通过测定分离菌株菌液D 600n m 值与生长时间的关系,并进行菌落计数,发现该细菌在生长到18h时即可到达平台期,当D 600n m 值为0.5时,对应的菌落数约为3ˑ1010C F U /m L (图6)㊂2.5 细菌生化鉴定结果生化鉴定结果显示,分离菌株能分解葡萄糖㊁甘露糖和木糖,不分解麦芽糖,硝酸盐还原试验㊁枸橼酸盐利用试验㊁乙酰胺酶试验㊁精氨酸双水解酶试验㊁脲酶试验㊁氧化酶试验均为阳性,其余为阴性(表1),结果符合铜绿假单胞菌生化特征㊂2.6 药敏试验分离菌株药敏试验结果见表2㊂由表2可知,该菌株对氟喹诺酮类药物㊁碳青霉烯类药物亚胺培南和美罗培南具有一定耐药性,为碳青霉烯耐药性菌株㊂对头孢他啶㊁哌拉西林㊁阿米卡星等药物均敏感㊂1271中 国 畜 牧 兽 医51卷图6 分离菌株生长曲线(A )和吸光度-菌落形成单位曲线(B )F i g .6G r o w t h c u r v e (A )a n da b s o r b e n c e -c o l o n y f o r m i n g u n i t s c u r v e (B )o f t h e i s o l a t e d s t r a i n 表1 分离菌株生化鉴定结果T a b l e 1 B i o c h e m i c a l i d e n t i f i c a t i o n r e s u l t s o f t h e i s o l a t e d s t r a i n 项目I t e m s 结果R e s u l t s项目I t e m s结果R e s u l t s葡萄糖G l u c o s e +精氨酸双水解酶A r g i n i n e d i h y d r o l a s e +甘露糖M a n n o s e +脲酶U r e a s e +木糖X yl o s e +氧化酶O x i d a s e +麦芽糖M a l t o s e -赖氨酸L y s i n e -硝酸盐N i t r a t e +鸟氨酸O r n i t h i n e-枸橼酸盐C i t r a t e+吲哚I n d o l e -乙酰胺酶A c e t a m i d a s e+硫化氢H 2S -+,阳性;-,阴性+,P o s i t i v e ;-,N e g a t i v e 表2 分离菌株药敏试验结果T a b l e 2 D r u g s e n s i t i v i t y t e s t r e s u l t s o f i s o l a t e d s t r a i n 抗菌药物A n t i m i c r o b i a l d r u g s 抑菌圈直径I Z D /m m敏感性S e n s i t i v i t y头孢他啶C A Z 29S 哌拉西林P I P27S 阿米卡星AMK 22S 环丙沙星C I P 18R 诺氟沙星N O R 12R 左氧氟沙星L E V10R 庆大霉素G E N 9R 亚胺培南I P M6R 美罗培南M E M 14RS ,敏感;R ,耐药S ,S e n s i t i v e ;R ,R e s i s t a n t2.7 小鼠回归试验试验组小鼠在接种菌液后,精神萎靡,不喜活动㊂8h 后,腹腔注射浓度1.2ˑ1010C F U /m L 菌液组小鼠全部死亡㊂24h 后,1.2ˑ109C F U /m L 组小鼠出现4只死亡㊂第1天内死亡的9只小鼠眼睛出现脓性分泌物,爪尖和尾尖发黑,腹部膨大,毛发散乱㊂48h 后,1.2ˑ108C F U /m L 组小鼠死亡1只,未死亡的小鼠出现聚堆㊁远离水源和食源的行为㊂继续观察,剩余小鼠全部存活,对照组小鼠继续饲养7d 后全部存活,剖检未见相关病变㊂根据小鼠死亡数量与对应的菌液浓度,采用改良寇氏法可计算出分离菌株L D 50为3.382ˑ108C F U (表3)㊂22714期穆政融等:树鼩源碳青霉烯耐药性铜绿假单胞菌的分离鉴定及生物学特性研究表3 分离菌株小鼠致病性试验T a b l e 3 P a t h o g e n i c i t y t e s t o f i s o l a t e d s t r a i n s i nm i c e 菌液浓度B a c t e r i ac o n c e n t r a t i o n /(C F U /m L )小鼠总数T o t a l n u m b e r o fm i c e死亡小鼠数量N u m b e r o f d e a dm i c e 1d 2d 3d 4d 5d 6d 7d 死亡小鼠总数T o t a l n u m b e r o fd e a dm i c e1.2ˑ10105500000051.2ˑ1095400000041.2ˑ1085010000011.2ˑ107500000000对照组C o n t r o l g r o u p5剖检1.2ˑ1010和1.2ˑ109C F U /m L 组死亡小鼠,可见肝脏有灰白色坏死点,脾脏颜色暗沉,肠道鼓气,腹膜有大量白色脓性分泌物㊂病理切片镜检结果显示,感染组肺脏组织整体损伤严重,大量肺泡腔融合㊁变小,肺泡隔增厚,较多气管上皮细胞发生坏死,胞核溶解㊁消失(图7B 2,箭头a ),气管周围重度炎细胞浸润(图7B 2,箭头b ),肺泡间质有出血现象(图7B 2,箭头c )㊂肝脏组织结构损伤,肝窦间隙有炎细胞浸润(图7D 2,箭头e ㊁f),肝细胞坏死,核固缩(图7D 2,箭头d )㊂脾脏损伤严重,整体组织结构改变明显(图7F 1,箭头g );脾脏白髓红髓界限不明显,不规则;发生大量炎细胞浸润及细胞坏死(图7F 2,箭头h )㊂小肠组织结构损伤,发生糜烂,绒毛断裂㊁脱落(图7H 1,箭头i ),肌层发生坏死(图7H 1,箭头j )㊂对照组小鼠各组织均无异常㊂图7 腹腔注射分离菌株后小鼠不同器官组织病理组织学观察F i g .7 H i s t o p a t h o l o g i c a l o f d i f f e r e n t o r g a n s o fm i c e a f t e r i n t r a p e r i t o n e a l i n je c t i o nof t h e i s o l a t e 从病死小鼠脾脏㊁肠道㊁血液中重新分离得到的细菌基于16S r R N A 序列二代测序进行微生物分类分析,结果可见假单胞菌属存在,且脾脏感染细菌的微生物组成与肠道㊁血液相似,显示细菌经血液循环发生了移行(图8)㊂对肠道㊁血液和脾脏中疑似铜绿假单胞菌单菌落与MU 45-B 02菌株一同进行生化鉴定,其结果相同㊂2.8 全基因组测序与分析结果通过第二代高通量测序和数据库比对,确定MU 45-B 02菌株测序基因组为单个环状染色体3271中国畜牧兽医51卷(7112856b p,G C含量为65.84%),包含6860个基因,另有359个非编码R N A(图9)㊂所携带的质粒(438683b p,G C含量为56.37%)包含390个基因,另有C R I S P R序列1条(90b p)㊂图816S r R N A微生物分类分析F i g.816S r R N A m i c r o b i a l c l a s s i f i c a t i o na n a l y s is图9M U45-B02基因组圈图F i g.9C i r c u l a r r e p r e s e n t a t i o no fM U45-B02g e n o m e42714期穆政融等:树鼩源碳青霉烯耐药性铜绿假单胞菌的分离鉴定及生物学特性研究C A RD 数据库注释结果显示,MU 45-B 02包括耐药基因69个,其中与碳青霉烯类㊁氟喹诺酮类抗菌药耐药相关的基因共有38个(图10),其机制与抗菌药外排㊁渗透率降低和药物作用靶位改变有关㊂本研究在该菌株注释基因中发现了碳青霉烯酶编码基因b l a O X A -50,O X A 型碳青霉烯酶作为D 型碳青霉烯酶,在铜绿假单胞菌中广泛分布,与其他抗药机制协同发挥作用㊂图10 抗菌药耐药性相关基因类型F i g .10 A n t i b i o t i c r e s i s t a n c e r e l a t e d g e n e t y pe s V F B D 数据库注释结果显示,MU 45-B 02包括毒力因子741个,具有铜绿假单胞菌典型的毒力基因,如参与合成脂多糖和分泌绿脓菌素的基因㊁外膜蛋白相关基因(O p r F ㊁O p r D 和O pr E 基因)㊁外毒素相关基因(t o x A 和e x o T 基因)㊁弹性蛋白酶相关基因(l a s A 和l a s B 基因)等㊂有60个毒力因子参与了铜绿假单胞菌生物膜的形成,其中包括L a s I ㊁L a s R ㊁R h l I 和R h l R 等关键基因㊂此外,该铜绿假单胞菌分离株携带表达Ⅲ型分泌系统(T 3S S )效应蛋白的基因e x o T 和e x o U ,不携带e x o S 和e x o Y 基因㊂C R P A 携带共有的毒力基因t o x A ㊁pl c N ㊁p l c H ㊁p h z M ㊁p h z S ㊁a l g D ㊁l a s B ㊁l a s A ㊁p v d A ㊁pi l A 和p i l B 等,这些基因均在MU 45-B 02基因组中得到注释㊂基于铜绿假单胞菌P A O 1㊁C r 1㊁P A K ㊁L E S 400㊁B 136-33㊁D M C 30b 菌株之间的基因家族类型构建进化树,结果如图11所示㊂其中,MU 45-B 02与高毒力菌株B 136-33的基因家族类型最为相近,该菌株会导致人类出现严重腹泻,也可引起社区获得性败血症伴坏死性肠炎㊂V F B D 数据库将不同的毒力因子归为不同的类型,气泡热图可见MU 45-B 02与人源铜绿假单胞菌致病分离株有着相似的毒力特征(图12)㊂图11 分离菌株与参考菌株基于基因家族类型的系统发育树F i g .11 P h y l o g e n e t i c t r e e o f t h e i s o l a t e d s t r a i na n d r e f e r e n c e s t r a i n s b a s e do n g e n e f a m i l y t y pe s 5271中 国 畜 牧 兽 医51卷图12 V F D B 毒力因子分类气泡热图F i g .12 V F D Bv i r u l e n c e f a c t o r c l a s s i f i c a t i o nb u b b l e h e a t m a p3 讨 论铜绿假单胞菌是革兰阴性人兽共患菌,该菌具有多种毒力因子,强大的生物膜形成能力和鞭毛系统,使其能在土壤㊁水和动物宿主等不同环境中生存[18]㊂作为条件致病菌,在机体免疫功能低下时易导致感染,引起人和动物不同疾病,能感染水貂[21]㊁禽类[22]等动物,而在树鼩中的相关报道较少㊂树鼩一般生活在潮湿环境中,铜绿假单胞菌通常在其体表定植[23]㊂在驯化和实验室笼养过程中,人类饲养行为和工业化生产的水源㊁饲料等均可引发细菌相关感染,而铜绿假单胞菌在诸如肠道性感染等疾病中发挥了重要作用㊂小鼠攻毒试验表明,单一的铜绿假单胞菌感染会逐渐发展为由肠杆菌科和铜绿假单胞菌共同参与的全身性感染㊂B a c h t a等[24]通过小鼠铜绿假单胞菌菌血症模型证实,铜绿假单胞菌可从血液扩散到肠道,通过粪便传播,其研究通过示踪发现铜绿假单胞菌在胆囊富集,而在本次试验中,铜绿假单胞菌可从脾脏中分离获得,说明铜绿假单胞菌具有较强的血行感染能力,由该菌引起的肠道菌群失调继发全身性感染可能是易感动物的主要死因㊂铜绿假单胞菌属于耐药水平较高的细菌,该菌能通过高表达自身的外排泵[25]㊁降低外膜蛋白通透性㊁产碳青霉烯酶㊁改变抗菌药物作用靶位㊁形成生物膜㊁自身基因组携带的C R I S P R /C a s 系统[26]等多种机制对不同药物产生天然耐药,包括头孢菌素类㊁青霉素类㊁氨基糖苷类㊁碳青霉烯类和氟喹诺酮类抗菌药物,耐药机制复杂,同时表现出多重耐药性㊂人类的胃肠道是铜绿假单胞菌及其抗性基因的宿主,H u 等[4]通过分离临床株发现,人类肠道C R P A 的检出率为41.3%,碳青霉烯酶介导的铜绿假单胞菌碳青霉烯酶耐药仍是一个值得关注的问题,极大地限制了抗感染策略的选择㊂作为良好的细菌实验动物模型,早在2011年,L i 等[27]就利用铜绿假单胞菌建立树鼩细菌感染模型以评价抗菌药物疗效,由树鼩体内分离出产碳青霉烯酶菌株对探索实验动物模型具有一定的指导意义㊂基于16S r R N A 基因和全基因组的遗传进化树分析结果显示,不同物种来源的铜绿假单胞菌与本试验分离菌株MU 45-B 02具有较高的相似性,它们分离自不同的外界环境和物种,可跨物种感染㊂被铜绿假单胞菌感染的人或动物的排泄物可将铜绿假单菌向其他动物传播,其途径包括饮用水㊁饲料㊁笼具接触等㊂具有耐药性的铜绿假单胞菌对树鼩驯化养殖具有一定的潜在威胁,应在饲养过程中予以重视㊂4 结 论本研究从发病树鼩脾脏和肠道中分离出铜绿假单胞菌,结合全基因组测序技术,报道了O X A -50型碳青霉烯耐药性铜绿假单胞菌感染树鼩的案例,为预防树鼩在实验室饲养过程中引发细菌感染相关疾病提供了重要的参考依据㊂参考文献(R e f e r e n c e s):[1] C HU N GJ ,E I S HAS ,P A R KS ,e t a l .H o wt h r e e s e l f -s e c r e t e d b i o f i l m e x o p o l ys a c c h a r i d e so f P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a ,P s l ,P e l ,a n d a l g i n a t e ,c a n e a c h b e 62714期穆政融等:树鼩源碳青霉烯耐药性铜绿假单胞菌的分离鉴定及生物学特性研究e x p l o i t e df o r a n t i b i o t i c a d j u v a n t e f f e c t s i n c y s t i cf i b r o s i sl u ng 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·综述·碳青霉烯类抗生素的研究进展谢奇恩林福林庞素秋（解放军第１８０医院药学科泉州３６２０００）摘要：目的：促进临床对碳青霉烯类抗生素的合理应用。

方法:参考国内外文献，对7种碳青霉烯类抗生素的构效特点、药理特点、临床应用等进行阐述，分析比较7个品种之间的不同特点。

结果:本类抗生素具有抗菌谱广、抗菌活性强和对β-内酰胺酶高度稳定的特点，经临床验证其疗效确切。

结论:碳青霉烯类抗生素是临床治疗严重的混合性感染和对付耐药菌株的有力武器。

关键词：碳青霉烯类抗生素药理作用临床应用中图分类号：Ｒ９６２文献标识码：Ｂ文章编号：１６７２－８３５１（２０１１）０２－００５１－０４Pharmacology and Clinical Application of CarbopenemsXie Qi-en Lin Fu-lin Pang Sy-qiu（Dept.of Pharmacy，180th Hospital of PLA，Quanzhou362000，China）Abstract：Objective：To promote clinical rational use of carbopenems.Methods:With the pertinent literature both home and abroad as reference，the differences among7agents of carbopenems were discussed regarding formulation and efficacy，pharmacology，and clinical application.Results:Carbopenems antibiotics were characterized by broad antibacterial spectrum，strong antimicrobial activ－ity and strong stability toβ-lactamase，and which showed good efficacy in the clinic.Conclusions:Carbopenems are powerful weapons in the management of mixed infection drug resistant strains.Key words：Carbopenems Pharmacology Clinical application碳青霉烯类抗生素（Carbopenems）是一类抗菌谱最广、抗菌活性最强的非典型β-内酰胺类抗生素，因其具有对β-内酰胺酶稳定以及毒性低等特点，已经成为治疗严重细菌感染最主要的抗菌药物之一。