实验七 酵母菌的形态观察及微生物的显微直接计数法

实验7酵母菌的形态观察、大小测定和直接计数一、实验目的酵母菌的形态及出芽生殖，学习区分酵母菌死活细胞的实验方法；学习并掌握用测微尺测定微生物大小和使用血球计数板进行微生物计数的方法。

二、实验原理1.酵母菌形态观察酵母菌个体较大，常规涂片方法可能损伤细胞，因此用美蓝染液水浸片法观察其出芽生殖。

美蓝染液的氧化形式蓝色，还原形式无色。

活细胞由于新陈代谢，细胞内还原性物质还原美蓝而呈现无色，死细胞或代谢能力弱的细胞不能将美蓝还原呈现蓝色。

2.细胞大小测量微生物大小的测定需借助测微尺：目镜测微尺和镜台测微尺。

镜台测微尺用于矫正目镜测微尺，总长1mm，分100个小格，每小格10μm。

目镜测微尺是一块可放入目镜的圆形玻片，有50小格和100小格2种。

由于不同显微镜或不同的目镜和物镜组合放大倍数不同，目镜测微尺每小格代表的实际长度也不一样。

因此，用目镜测微尺测量微生物大小时，必须先用镜台测微尺进行校正，以求出该显微镜在一定放大倍数的目镜和物镜下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度，然后根据微生物细胞相当于目镜测微尺的格数，计算出细胞的实际大小。

3.细胞计数血细胞计数板，大格1.0mm，体积0.1m3。

三、步骤1.酵母菌观察1)在载玻片中央加一滴0.05%吕氏碱性美蓝染色液，用滴管取1滴酵母菌菌液于染液中，混合均匀。

2)加盖玻片。

3)将制片放置约3min后镜检，先用低倍镜然后用高倍镜观察酵母菌的形态和出芽情况，并根据颜色区别死、活细胞。

4)染色约0.5h后再次进行观察，观察死细胞数量是否增加。

5)形态记录，计算0.5h后酵母菌的死亡率。

2.细胞大小测量1)装目镜测微尺：把目镜上的透镜旋下，将目镜测微尺刻度朝下放在目镜镜筒内的格板上，然后旋上目镜透镜，再将目镜插入镜筒内。

2)校正目镜测微尺：将镜台测微尺刻度面朝上放在显微镜载物台上。

校正：先用低倍镜观察，将镜台测微尺有刻度的部分移至视野中央，调节焦距，当清晰地看到镜台测微尺的刻度后，转动目镜使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度平行。

酵母菌的形态观察及死活鉴别与显微直接计数法酵母菌的形态观察及死活鉴别与显微镜直接计数法I 酵母菌的形态观察及死活鉴别一、目的要求观察酵母菌的细胞形态及出芽生殖方式，学习区分酵母菌死活细胞的实验方法。

二、基本原理酵母菌是多形的、不运动的单细胞微生物，细胞核与细胞质已有明显的分化，菌体比细菌大。

繁殖方式也较复杂，无性繁殖主要是出芽生殖，仅裂殖酵母属是以分裂方式繁殖；有性繁殖是通过接合产生子囊孢子。

本实验通过用美蓝染色制成水浸片来观察生活的酵母形态和出芽生殖方式。

美蓝是一种无毒性染料，它的氧化型是蓝色的，而还原型是无色的。

用它采对酵母细胞进行染色。

活细胞内由于新陈代谢作用而具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化型变为无色的还原型，所以酵母活细胞染色后无色。

而死细胞或代谢缓慢的老细胞因无还原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。

因此，用美蓝水浸片不仅可观察酵母的形态，还可以区分死、活细胞。

三、器材酿酒酵母（Saccharomyces cerevissiae）；0.1％吕氏碱性美蓝染液，革兰氏染色用的碘液；显微镜，载玻片，盖玻片等。

四、操作步骤（美蓝浸片观察）(1)在载玻片中央加一滴0.1％吕氏碱性美蓝染液，液滴不可过多或过少，以免盖上盖玻片时，溢出或留有气泡。

然后按无菌操作法取在豆芽汁琼脂斜面上培养48小时的酿酒酵母少许，放在吕氏碱性美蓝染液中，使菌体与染液均匀混合。

(2)用镊子夹盖玻片一块，小心地盖在液滴上。

盖片时应注意，不能将盖玻片平放下去，应先将盖玻片的一边与液滴接触；然后将整个盖玻片慢慢放下，这样可以避免产生气泡。

(3)将制好的水浸片放置3分钟后镜检。

先用低倍镜观察，然后换用高倍镜观察酿酒酵母的形态和出芽情况，同时可以根据是否染上颜色来区别死、活细胞。

五、实验报告(1) 绘图说明你所观察到的酵母菌的形态特征。

II 显微镜直接计数法一、目的要求1．明确显微镜计数的原理。

2．学习使用血球计数板进行微生物计数的方法。

实验一：酵母菌大小测定一、实验器材1、菌种：酵母菌液体培养物2、仪器和其他物品目镜测微尺，镜台测微尺，普通光学显微镜，擦镜纸，载玻片，滴管等。

二、实验目的及要求1、学习并掌握使用显微测微尺测定微生物大小的方法。

2、掌握对不同形态细菌大小测定的分类学基本要求，增强对微生物细胞大小的感性认识。

三、基本原理微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。

微生物大小测定需借助测微尺---目镜测微尺和镜台测微尺，两者配合使用。

镜台测微尺是一个在特制载玻片中央封固的标准刻尺，其尺度总长为1mm，精确分为10个大格，每个大格又分为10个小格，共100个小格，每个小格10μm。

镜台测微尺并不直接用来测量细胞的大小，而是用于校正目镜测微尺每格地相对长度。

目镜测微尺是一块可放入接目镜内的圆形小玻片，其中央有精确的等分刻度，一般有等分为50小格和100小格两种。

测量时，需将其放在接目镜中的隔板上，用以测量经显微镜放大后的细胞物像。

由于不同显微镜或不同的目镜和物镜组合放大倍数不同，目镜测微尺每小格在不同条件下所代表的实际长度也不一样。

因此，用目镜测微尺测量微生物大小时，必须先用镜台测微尺进行校正，以求该显微镜在一定放大倍数的目镜和物镜下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。

然后根据微生物细胞相当于目镜测微尺的格数，即可计算出细胞实际大小。

四、操作步骤1、装目镜测微尺(换目镜)把目镜上的透镜旋下，将目镜测微尺刻度朝上放在目镜镜筒内的格板上，然后旋上目镜透镜，再将目镜插入镜筒内。

※双目显微镜的左目镜通常配有屈光度调节环，不能被取下，因此使用双目显微镜时目镜测微尺一般都安装在右目镜中。

2、校正目镜测微尺（1）放镜台测微尺将镜台测微尺刻度面朝上放在显微镜载物台上。

（2）校正先用低倍镜观察，将镜台测微尺有刻度的部分移至视野中央，调节焦距，当清晰地看到镜台测微尺的刻度后，转动目镜使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度平行。

酵母菌的计数方法酵母菌是一类单细胞真菌，广泛存在于自然界中。

酵母菌在食品加工、工业生产、科研等领域中具有重要应用价值。

酵母菌的计数方法主要分为直接计数和间接计数两种。

直接计数方法包括显微镜计数法、染色计数法和自动计数法；间接计数方法包括背景数法和平板计数法。

下面将详细介绍这些方法。

显微镜计数法是一种常用的酵母菌计数方法。

首先，将样品制成适当的稀释液，然后使用显微镜进行观察和计数。

计数时需要使用显微镜和计数室，通过观察样品中的酵母菌数量来进行计数。

这种方法的优点是简单易行，可以直接观察酵母菌的形态和数量，缺点是操作比较繁琐，计数的准确性受到操作者的经验和技术水平的影响。

染色计数法是一种通过给酵母菌样品染色来进行计数的方法。

将样品制成薄片，然后使用染色剂对酵母菌进行染色，待染色剂干燥后使用显微镜进行观察和计数。

染色计数法的优点是能够清晰地看到染色的酵母菌，并且可以和其他微生物区分开来，缺点是染色过程中可能会对酵母菌的数量和形态产生影响。

自动计数法是一种利用自动计数器对酵母菌样品进行计数的方法。

这种方法利用仪器的精确性和高效性，可以快速准确地计数大量的酵母菌。

自动计数法的优点是快速准确，可以自动化地进行大批量计数，缺点是设备价格较高，操作相对复杂。

背景数法是一种通过计算样品的背景数来估算酵母菌数量的方法。

首先选择一个不含酵母菌的标准培养基样品作为背景数，然后将待测样品和背景数进行对比，从而估算出酵母菌的数量。

背景数法的优点是简单易行，无需特殊设备，缺点是只能粗略估计酵母菌的数量，对于低浓度的样品计数效果不佳。

平板计数法是一种通过在培养基上进行传统菌落计数的方法。

首先将样品制成适当的稀释液，然后在固体培养基上均匀涂布样品，培养一段时间后在培养基上出现的菌落进行计数。

平板计数法的优点是简单易行，可以较为准确地计数酵母菌，缺点是需要一定的培养时间，且对于不同种类的酵母菌可能存在选择性生长的问题。

综上所述，酵母菌的计数方法有多种，每种方法都有其特点和适用范围。

微生物学实验开课时间： 2015 年3 月20 日实验名称：功能微生物的形态观察（三）酵母菌的形态观察、大小测定和直接计数1.实验记录（包括实验现象和原始记录）1）观察酵母菌形态。

①取一干净的载玻片，滴一滴蒸馏水，轻轻挑取老师准备好的酵母菌适量，蘸于蒸馏水上制成水玻片，盖上盖玻片，直接在显微镜下观察②先在10倍镜下找到酵母菌，然后40倍镜拍照下图为酵母菌的形态（放大倍数：15×40）2）酵母菌的大小测定①将盒子里的镜台测微尺置于载物台上，注意刻度朝上，分别在4、10、40倍下数出它与目镜测微尺的重合格数，完成目镜测微尺的校正②记录观察到的酵母菌大小，主要数酵母菌的长与宽所占的格数，注意尽量找大小不同，范围较大的酵母菌10个③酵母菌的数量计数取清洁无油的血细胞计数板，盖上盖玻片，将酵母菌液摇匀，在盖玻片边缘滴几小滴，注意让菌液自行渗入计数室内，静置5min，在40倍镜下计数，选取9宫格中央的小室，计数如下（只数上边和左边的酵母菌）A室注：上面的图片均摄于2015 年4月10 日。

2.结果与分析1）酵母菌在显微镜下要比细菌大得多，不具有鞭毛，明显有细胞核，在显微镜下形成一个明亮的光圈2）校正目镜测微尺后，根据公式：目镜测微尺每格长度（um）=两重和线间镜台测微尺格数*10/两重合线间目镜测微尺格数，计算出每格长度分别是4倍（25）、10倍（10）、40倍（2.5），即酵母菌大小计算每格为2.5um因此菌体大小范围为（4.8—9.5）×（5.3-11.8）um3）酵母菌的计数结果如下图3.结论1）酵母菌的形态特征：对比细菌，酵母菌要大得多，并且酵母菌细胞核而细菌只有拟核，有些细菌还有鞭毛而酵母菌没有，呈椭圆状2）酵母菌的大小：酵母菌的大小经实验得出，大概范围为（4.8—9.5）×（5.3-11.8）um3）酵母菌数量：本实验中酵母菌的数量大致为7.9×108 个/ml4.思考题1）当接目镜不变，目镜测微尺也不变，只改变接物镜，目镜测微尺每格所量的镜台上物体的实际长度是否相同？为什么？答：不同，物镜成实像于目镜前方，标尺即位于物镜所成实像的位置（在对好焦后），目镜成虚像于明视距离，所以物镜倍数增大以后，原来占一个单位长度的实像现在会占不同的单位，即测微尺每格所代表的长度不同2）结合你的实验体会，总结哪些因素会造成血细胞计数板的计数误差，应如避免？答：1.活细胞和死细胞不易分开，数出来的是活死细胞的总和2.细胞溶液必须均匀，再用之前要震荡均匀，否则细胞沉在试管底部，容易出现误差应该避免操作误差，实验时每次使用细胞溶液都要震荡均匀5.认识与体会1）熟练操作显微镜，并可以在观察时计数2）掌握了血细胞计数法的使用3）了解了酵母菌一般的大小和形态特征。

一、实验目的1. 认识酵母菌的形态结构，了解其基本特征。

2. 掌握酵母菌的观察方法，包括制片、染色、显微镜观察等。

3. 学习酵母菌的繁殖方式，如出芽生殖和有性生殖。

二、实验原理酵母菌是一种单细胞真菌，具有典型的真菌特征。

在显微镜下观察，酵母菌呈卵圆形、圆形或椭圆形，细胞壁厚，细胞核明显，细胞质内有液泡和细胞器。

酵母菌的繁殖方式包括出芽生殖和有性生殖，其中出芽生殖是最常见的繁殖方式。

三、实验器材1. 酵母菌培养物2. 显微镜3. 载玻片、盖玻片4. 接种针5. 美蓝染液、中性红染液、碘液6. 无菌水、生理盐水7. 酒精灯、镊子、滴管四、实验步骤1. 制片（1）用接种针挑取少量酵母菌培养物，置于载玻片上。

（2）用无菌水将酵母菌稀释至适宜浓度。

（3）将稀释后的酵母菌滴在载玻片上，盖上盖玻片。

2. 染色（1）将制片放在染色缸中，用滴管加入适量的美蓝染液。

（2）将染色缸放入酒精灯上加热，使染液沸腾，持续约5分钟。

（3）染色结束后，用滴管加入适量的无菌水，冲洗掉多余的染液。

3. 显微镜观察（1）将染色后的制片放在显微镜下观察。

（2）先低倍镜观察酵母菌的整体形态，如大小、形状、颜色等。

（3）再换用高倍镜观察酵母菌的细胞核、液泡、细胞壁等结构。

4. 酵母菌繁殖方式观察（1）观察酵母菌的出芽生殖过程，记录芽的产生、生长、分离等情况。

（2）观察酵母菌的有性生殖过程，如接合、子囊孢子的形成等。

五、实验结果与分析1. 酵母菌的形态观察结果显示，酵母菌呈卵圆形、圆形或椭圆形，细胞壁厚，细胞核明显，细胞质内有液泡和细胞器。

2. 酵母菌的繁殖方式（1）出芽生殖：观察到酵母菌在细胞的一端产生芽，芽逐渐增大，最终与母细胞分离，形成独立的菌体。

（2）有性生殖：观察到酵母菌通过接合产生子囊孢子，子囊孢子在适宜条件下萌发，形成新的酵母菌。

六、实验结论1. 通过本次实验，我们成功观察到了酵母菌的形态结构，了解了其基本特征。

2. 掌握了酵母菌的观察方法，包括制片、染色、显微镜观察等。

微生物的显微计数法；放线菌、酵母菌、霉菌的形态观察微生物的显微计数法一、实验目的了解血球计数板的构造和使用方法；掌握使用血球计数板进行微生物计数的方法。

二、实验原理血球计数板上有由四条平行槽构成的三个平台，中间的平台较宽，其中间又被一短槽隔成两半，每边平台上面各刻有一个方格网，即为此计数板的计数室。

计数室的长宽各为1 mm，中间平台下陷0.1mm，故盖上盖玻片后计数室的容积为0.1mm3。

用血球计数板计数微生物细胞的数量，就是先测定若干个方格中的微生物细胞的数量。

再换算成每ml菌液中微生物细胞数量。

三、实验仪器、材料和用具实验用具：载玻片、盖片、滴管、擦镜纸、洗瓶；实验仪器：生物显微镜、血球计数板、手动计数器；菌种：啤酒酵母。

四、实验步骤1.稀释将啤酒酵母菌悬液进行适当稀释，菌液如不浓，可不必稀释；2.镜检计数室：在加样前，先对计数板的计数室进行镜检，若有污物则需清洗；3.加样品在清洁干燥的血球计数板上盖上盖玻片。

用细口滴管吸取振荡均匀的啤酒酵母菌稀释液，对准盖玻片边缘，轻挤滴头，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自行进入计数室，让计数室刚好充满菌液。

注意不可有气泡，每次吸液前都要振荡均匀！4.显微镜计数将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜(X40)观察。

静置1分钟后进行计数。

在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数5.显微镜计数方法样品稀释度要求每中格内有l0～20个菌体为宜。

（1）16X25型计数板：取左上，右上，左下，右下四个中格(共4个中格，l00个小格)内的细胞逐一进行计数。

（2）25X16型计数板：除取左上，右上，左下，右下四个中格外，还需加数中央的一个中格(共5个大格，80个小格)内的细胞。

计数时，遇到中格线上的酵母菌时，一般只计此中格的上方及右方线上的细胞，而且只计胞体一半以上在线内的细胞。

如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作两个菌体计数。