病理冰冻切片的制片流程
- 格式:docx
- 大小:10.84 KB
- 文档页数:1
全部试验步骤1取颖组织于4%多聚甲醛固定24 小时230%蔗糖脱水48 小时以上3-250C 包埋〔冰冻切片机内〕4冰冻切片冰冻切片步骤冰冻切片免疫组化染色步骤:冰冻切片4~8μm,室温放置30 分钟后,入4℃丙酮固定10 分钟,PBS 洗,5 分钟×3 次。
用3%过氧化氢孵育5~10 分钟,以消退内源性过氧化物酶的活性。
PBS 冲洗,5 分钟×2 次。
下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤。
(见我发的前面的帖子)你确定你是冰冻切片吗!冰冻切片不能用热修复啊!!以下是我的步骤:1冰冻切片室温放置30 分钟后,入4℃丙酮固定10 分钟,PBS 洗,5 分钟×3。
用3%过氧化氢孵育5~10 分钟,PBS 洗,5 分钟×2。
25~10%正常山羊血清〔PBS 稀释〕封闭,室温孵育10 分钟。
倾去血清,勿洗,滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液,37℃孵育1~2 小时或4℃过夜。
3PBS 冲洗,5 分钟×3 次。
4滴加滴加其次代生物素标记二抗工作液,37℃或室温孵育30 分钟。
PBS 冲洗,5 分钟×3 次。
5滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液,37℃或室温孵育10~30 分钟。
6PBS 冲洗,5 分钟×3 次。
7显色剂显色〔DAB〕。
8自来水充分冲洗,复染,封片。
冰冻切片免疫组化染色用的灭活内源性过氧化物酶,最好是用3%H2O2/甲醇溶液,室温20 分钟。
此配方不易产生脱片。
配制方法是在9ml 甲醇中加30%H2O2 1ml,混匀后使用,每次颖配制。
冰冻切片免疫组化染色步骤冰冻切片4~8mm,室温放置30 分钟后,入4℃丙酮固定10 分钟,PBS 洗,5 分钟×3。
用3%过氧化氢孵育5~10 分钟,消退内源性过氧化物酶的活性。
PBS 洗,5 分钟×2。
下接免疫组化染色操作步骤。
DAB 显色,显色时放置在白色纸上,观看显色程度以终止DAB 反响,最好把玻片置于显微镜上找到可能的阳性显色区域滴加DAB ,观看到阳性区和阴性区差异后终止,此时最 好有计时,以便于今后重复试验把握显色时间〔一般显色时间 2s-10min ,显色时间过长玻片两侧放置浸湿的卫生纸或棉球。
病理组织切片制作技术病理组织切片制作技术病理组织切片常用的制作方法有三种。
即石蜡切片法,冰冻切片法和火棉胶切片法。
以石蜡切片法为代表,切片的基本制作过程是:组织取材→固定→冲洗→脱水→透明→浸蜡→组织包埋→组织切片→展片附贴→切片脱蜡→染色→脱水→染片透明→封固。
以上基本过程是互相联系的,任何一环节出现问题,都将使整个切片制作归于失败。
因此应细致、耐心、认真负责,并事先做好计划安排。
一、取材采取病料,要刀剪锐利,剪切时不可挤压,扯拉病料,以防人为损伤。
切取的工具要清洁。
采取病料越新鲜越好,一般不超过死后24小时。
应选择病变部与可疑病变部切取,切取时要由表及里,有浅入深并包括周围正常组织一部分。
特殊病料应根据器官的结构特点切取。
管状,囊状和皮肤组织应注意垂直切取(横切)。
带有薄膜的组织,要防止切时薄膜分离和脱落。
切取组织块大小,以1.5×1.5×0.3厘米为宜,最厚不宜超过0.5厘米。
组织块病变一面应平整光滑,另一面可不平整,以便包埋时辨认。
切取后,放入事先准备好的装有固定液的磨口玻璃广口瓶中,并做好标记。
二、固定固定的目的是迅速将组织细胞杀死,使细胞中的蛋白质,糖,脂肪等凝固,从而保持与活组织相似的结构状态。
材料取下后,应迅速固定。
固定液数量应为病理组织块的5到20倍。
由于一般把组织块浸入固定液后数小时,固定液渗入组织液的深度只达2到3厘米。
因此,可以放置冰箱内固定,使组织内酶失去作用,细菌也能停止滋生。
最常用的固定液是10%的福尔马林溶液:使用时,用40%的甲醛饱和水溶液10毫升,加水90毫升配成。
三、冲洗固定后的组织块,应将固定液洗去。
一般均用流水(自来水)冲洗12到24小时左右。
及时冲洗尚有停止固定的作用,防止固定过度,有利于制片染色。
冲洗时如不方便用流水冲洗,也可用较大容器盛装水浸洗,每隔相当时间换水一次。
整个浸洗时间比流水冲洗应稍长一些。
酒精固定的组织材料不需冲洗。
病理冰冻切片工作制度一、目的病理冰冻切片是病理科对临床送检组织进行快速诊断的重要技术之一。
本制度的建立旨在规范病理冰冻切片工作的操作流程,确保切片质量,提高诊断准确率,保证医疗安全。
二、适用范围本制度适用于病理科所有从事病理冰冻切片工作的医护人员。
三、工作流程1. 接收标本:病理科收到临床送检的组织标本后,应及时登记,并对标本进行核对,确保标本的完整性和准确性。
2. 取材:病理科医生根据临床申请单上的要求,选取适当的组织块进行切片。
组织块应尽量选取有代表性的部位,避免坏死、出血等影响诊断的因素。
3. 固定:将选取的组织块放入适当的固定液中,固定时间为1-2小时。
固定液的选择应根据组织类型和切片要求进行调整。
4. 切片:将固定后的组织块放入切片机中,调整切片厚度,进行切片。
切片过程中应保持切片机清洁,避免切片的污染。
5. 染色:将切好的切片放入染色剂中,根据染色剂的要求进行染色。
染色时间为1-2小时。
6. 脱水:将染色后的切片进行脱水处理,脱水时间为1-2小时。
7. 透明化:将脱水后的切片进行透明化处理,透明化时间为1-2小时。
8. 封片:将透明化后的切片放入封片机中,进行封片。
封片时应避免气泡的产生。
9. 诊断:病理科医生对切片进行镜下观察,并根据诊断结果填写病理报告。
10. 质控:病理科应定期进行质量控制,确保切片质量和诊断准确率。
四、工作规范1. 病理冰冻切片工作应由具有相关专业背景和经验的医护人员负责。
2. 病理科医生在进行切片前,应仔细阅读临床申请单,了解患者的病史和临床表现,以便更好地进行切片选择和诊断。
3. 病理冰冻切片应按照标准化操作流程进行,确保切片质量和诊断准确率。
4. 病理科医生在镜下观察切片时,应仔细观察组织的形态、结构、细胞学特征等,并根据诊断标准进行诊断。
5. 病理科医生在填写病理报告时,应准确、清晰地描述诊断结果,并提供相应的临床建议。
6. 病理科应定期对病理冰冻切片工作进行质量控制,包括切片质量检查、诊断准确率评估等,并对存在的问题进行及时改进。
冰冻切片制片实验步骤及注意事项冰冻切片(frozen section)是一种在低温条件下使组织快速冷却到一定硬度,然后进行切片的方法。
因其制作过程较石蜡切片快捷、简便,而多应用于手术中的快速病理诊断。
冰冻切片制片实验步骤1、组织固定:新鲜组织固定于4%多聚甲醛24h以上。
将组织从固定液取出在通风橱内用手术刀将目的部位组织修平整。
2、脱水:将修切好的组织放于15%的蔗糖溶液内4°冰箱脱水沉底后转入30%的蔗糖溶液内4°冰箱脱水沉底。
3、OCT包埋:将脱好水的组织取出用滤纸将表面水稍吸干后切面朝上放于包埋台上,组织周围滴上OCT包埋剂,将包埋台放在冰冻切片机的速冻台上速冻包埋,OCT变白变硬后即可进行切片。
4、切片:将包埋台固定于切片机上,先粗切将组织面修切平整后即可开始切片,切片厚°8-10μm。
将干净的载玻片平放于切出的组织片上方即可将组织贴于载玻片上。
-20°保存备用。
注意事项1、组织尽可能新鲜、骤冷愈快愈好,才能避免冰晶,常用的骤冷剂有:① CO2气(-78℃)② 丙酮干冰冷却的轻石油醚、乙烷和庚烷(-80℃)③ 液氮(-190℃)④ 液氮冷却的丙烷(-19℃)。
液氮适用于组织化学,较安全。
缺点:组织块易发生龟裂。
2、为防止水解酶和其他物质的移位、弥散,常用4℃、24小时的甲醛固定能很好地保存酶类。
但对许多脱氢酶和转移酶能灭活。
故不宜使用,低温,冷甲醛短时间固定(10分钟左右)固定,可显示琥珀酸脱氢酶。
3、电镜出现后,需要保存细胞的超微结构,以4%缓冲戊二醛(25%戊二醛16ml;0.1M二甲胂酸(pH7.)84ml;蔗糖8g)固定较好。
这些固定液主要用于水解酶,而不适于许多氧化还原酶和转移酶。
病理切片步骤流程
一、病理标本接收
1.标本登记
(1)标本信息登记
(2)核对患者信息
2.标本处理
(1)标本初步处理
(2)定位需要切片的部位
二、标本固定
1.选择固定液
(1)根据标本类型选择固定液
(2)浸泡标本使其固定
2.固定时间
(1)确定固定时间
(2)控制固定时间以保证标本质量
三、组织脱水
1.醇度递增
(1)逐步使用不同浓度醇溶液脱水
(2)保证组织彻底脱水
2.渗透剂处理
(1)使用透明剂处理标本(2)保证标本透明度
四、组织包埋
1.包埋模具准备
(1)准备标本包埋模具
(2)注入包埋剂
2.标本定位
(1)将处理好的组织放入模具(2)调整标本位置
五、切片制作
1.切片机设置
(1)设置切片机参数
(2)切割标本制作薄片
2.切片染色
(1)染色处理
(2)固定染色结果
六、镜检与诊断
1.镜下检查
(1)镜检准备
(2)医生进行镜检
2.病理诊断
(1)根据切片结果进行诊断(2)生成病理报告。
划重点!冰冻切片流程和注意事项都在这了!快快get起来~冰冻切片定义冰冻切片是指新鲜组织不经过任何固定、脱水、透明等处理,不需要石蜡包埋,直接在冰冻切片机上进行切片的一种方法。
冰冻切片特点:操作简单,耗时短,对组织抗原损伤小,对环境污染小。
冰冻切片流程(10-15min内即可完成):取材→包埋(<30s)→冷冻(1-3min)→切片(2-5min)→固定(10-15s)→染色(4-5min)→封片(<1min)1、取材(1)新鲜组织取材不能遇水,如果组织自身带水较多,可用滤纸吸干(目的是为了防止冰晶空洞等现象在切片过程中产生);(2)取材的工具也要保持干燥,取材时所取的范围应尽量避开出血坏死区域及脂肪区域;(3)取材组织大小要合适,厚度尽量在3mm,最多不要超过5mm(组织过大切片时阻力加大,易产生刀痕和褶皱)。
2、包埋(1)包埋机一般使用OTC或普通胶水,OTC包埋剂质感细腻,对刀片损伤小,有利于切片;(2)包埋时要将包埋剂涂抹均匀,确定好组织的包埋方向,例如管腔、皮肤、囊壁等要竖立包埋;(3)包埋体积较小的组织,可以先挤压少许的包埋剂形成一个平台,再放入小组织进行包埋。
3、冰冻温度与时间(1)冰冻温度与时间是冰冻切片的关键步骤,要根据组织的类型和大小来调节;(2)冰冻温度过低,会造成组织过硬,切片碎裂;温度过高会造成组织硬度不够,难以切片;(3)不同组织冰冻切片适宜温度:4、切片(1)在组织和包埋剂冷冻到发白后即可开始切片;(2)切片时右手摇动手轮要力道均匀、柔和、缓慢,切片厚度控制在5um左右,左手持毛笔在切片形成时轻按住组织边缘,使其不发生卷曲;(3)将切片展平粘贴在干净的载玻片上,应立即放入固定液中固定,如果固定不及时,会发生细胞退变,切片中细胞核模糊不清呈雾状。
5、染色流程:固定(95%乙醇)→苏木素→水洗→盐酸乙醇分化(0.5~1%)→水洗→温水返蓝→伊红→梯度酒精→二甲苯透明→封片6、注意事项(1)纤维及结缔丰富的组织,应顺着纤维纹理切片,否则容易崩裂;(2)较硬较脆的组织应尽量切的薄一些;(3)选择合适的固定液(95%乙醇、甲醛、甲醇、丙酮),且固定液要保持新鲜,及时更换固定液;(4)组织尽量快速冷冻,组织间隙的自由水易冷冻凝结形成冰晶,组织冷冻越缓慢,冰晶形成的数量越多,体积越大。
术中快速冰冻切片的规范及程序1.冰冻切片的制备1.1打开照明开关,打开冰冻切片机的玻璃箱盖。
1.2选择冻头,在冻头滴上冰冻切片机包埋剂适当。
1.3 待组织完全冷冻后,将冻头移到切片刀口的冻口内,扭紧冻头,进行切片,切片时有节奏的来回推动摇手柄,切得完整且较薄的切片(厚度8-9um),即可贴在玻璃片上。
1.4 将切好的片子用95%的乙醇固定,然后进行染色、封片、镜检(同石蜡切片H-E染色步骤)。
1.5工作完毕后将冻头上组织取出,放回送检的标本袋内,用10%的中性甲醛固定液固定。
1.6清扫切冰冻切片机箱,将冻头擦干后放回冰冻切片机内。
1.7关好冰冻切片机的玻璃箱盖,关闭照明电源。
2.冰冻切片机须24h开机,长假或节假日前检查切片机箱内的结冻情况,必要时关机,化霜,清洁冰冻切片机。
3.注意事项3.1 制作冷冻切片所需的试剂和设备等应处于随时可供使用状态。
3.2 切取的组织块大小适宜(厚度<2mm),并尽快置于冷冻组织切片机上制备切片。
3.3 调节冷冻程度,试切合合适时便迅速切片。
冷冻不足无法切片,冷冻过度切片易碎。
3.4 冷冻切片固定液95%乙醇50ml4.单体标本的冰冻制片应在15min内完成。
术中快速冰冻诊断的规范及程序1.临床医师在术前向患者或近亲属告知术中快速病理诊断的局限性,签署术中快速病理诊断知情同意书。
2.从标本接收到发出报告的时间,应在病理申请单上注明。
3.有条件的由两位中/高级称职的病理医师共同签署快速活检的病理诊断意见。
对于病变疑难、手术切除范围广泛和会严重致残的手术中快速活检,应由两位高级称职的病理医师共同签署会诊意见。
主检病理医师签名的字迹应能辨认。
4.快速活检诊断意见一般在收到送检标本后30min内发出;同一时间段内相继收到的多例患者标本或是同一例患者的多次标本,其发出报告的时间依次类推。
对于疑难病变,可酌情延时报告。
5.对于难以即时快速诊断的病变(例如病变不典型、交界性肿瘤病变或送检组织不足以明确诊断等),主检病理医师应向手术医师说明情况,恰如其分地签发病理诊断意见或告知需要等待常规石蜡切片进一步明确病理诊断。
冷冻切片操作指南在医学、生物学和食品科学等领域中,冷冻切片是一种重要的技术,用于将样品冷冻固化后,切割成薄片以供进一步观察和研究。
本文将为读者提供一份冷冻切片操作指南,介绍冷冻切片的基本原理、实验室操作步骤和注意事项。
一、冷冻切片的基本原理冷冻切片是将样品通过快速冷冻技术使其迅速固化,然后使用切片机或显微切片机将固化的样品切割成薄片。
冷冻切片的目的是保留样品的形态和结构,避免切片过程中的伤害和变形。
冷冻切片一般适用于需要保留细胞和组织结构的实验。
二、实验室操作步骤1. 样品准备:将待切割的样品准备好,可以是细胞、组织或食物等。
样品处理过程中需要注意保持样品的完整性和活性。
2. 冷冻固化:将样品放置在冷冻剂中,例如液氮或冷冻盒中的冰水混合物中,进行快速冷冻固化。
冷冻时间需要根据不同样品的特性进行优化,一般在几分钟至数小时之间。
3. 选用切片仪器:根据实验需求,选择合适的切片仪器,可以是手动的切片机或半自动/全自动的显微切片机。
4. 切片调整:根据实验需求,调整切片仪器的切割参数,例如切片厚度和速度等。
通常,薄片的厚度在几微米至数十微米之间。
5. 切片过程:将冷冻固化的样品放置在切片仪器的切片台上,固定好,并且调整好切割参数。
使用手动或电动操作切片仪器,将样品切割成所需的薄片。
6. 切片收集:将切割好的薄片收集起来,可以使用切片刷或显微镊子等工具进行操作。
注意保持薄片的完整性和干燥,避免受到污染和损坏。
7. 切片处理:根据实验需求,进行切片的进一步处理,例如染色、免疫组化等。
三、注意事项1. 样品处理过程中需要注意保持样品的完整性和活性,避免样品受到损伤和变性。
在样品处理过程中,可以使用缓冲液或甘油等物质进行保护。
2. 冷冻固化的时间和温度需要根据不同样品的特性进行优化。
过长或过短的冷冻时间都可能导致样品质量下降。
3. 在选择切片仪器时,需要根据实验需求和预算等因素进行权衡。
手动切片机相对便宜,但操作较为繁琐;半自动/全自动的显微切片机操作更为方便,但价格较高。
病理冰冻切片的制片流程The process of making pathological frozen sections is a crucial part of diagnosing diseases in medicine. 病理冰冻切片制作的流程是医学诊断疾病的关键部分。
It involves several steps that require precision, care, and expertise. 这涉及到几个步骤,需要精确、细心和专业知识。
First, the tissue sample is obtained from the patient during a surgical procedure. 首先,在手术过程中从患者身上取得组织样本。
This sample is then immediately frozen to preserve its cellular structure. 这个样本随后立即冷冻以保护其细胞结构。
The next step involves slicing the frozen tissue sample into very thin sections for examination under a microscope. 下一步涉及将冷冻组织样本切割成非常薄的切片,以便在显微镜下进行检查。
The final step includes staining the tissue to highlight specific cellular components or structures to aid in diagnosis. 最后一步包括染色组织,以突出特定的细胞成分或结构,以帮助诊断。
The process of making pathological frozen sections requires a high level of skill and precision from the medical professionals involved. 制作病理冰冻切片的过程需要从事其中的医学专业人员具有高水平的技能和精确度。
冰冻切片技术1:实验原理:利用物理降温的方法将新鲜组织标本冷冻产生一定的硬度进行切片,与石蜡切片相比,冷冻切片不需要脱水处理。
因此制片速度快,是术中进行快速病理争端的良好方法。
2:实验步骤:①取材:从新鲜的小鼠中剖取肝、肺、心、胰腺、肾等组织器官至载玻片上②冷冻前将恒温冷冻切片机的速冻住头温度和箱内温度调至-20--15℃,将组织器官移到涂了一层耦合剂的组织支承器冻面上,用镊子压平,再挤上一层耦合剂覆盖标本。
放至冰冻机中降温处理③标本冷冻后将组织支承器固定在切片机的机头上,调整机头的位置使其正好位于切片刀的后方。
④以粗修的方式粗修到暴露标本的最大平面,用毛笔清除机头、组织支承器及刀片上的组织碎屑。
⑤确认切片的厚度,一般为4到5vm不等,根据组织的不同可适当调整切片的厚薄。
⑥放下放卷板使其位置恰好与刀片的刀刃完全平行并略突出刀刃⑦以转动大轮推进的方式进行切片,良好的切片将在放卷板的下方形成一张完整平坦无褶的薄片,若切片略有弯曲,可用毛笔轻轻展平。
⑧打开放卷板,将标记好的载玻片平稳的轻压组织,使其平整的吸附到载玻片上。
⑨将切好的标本薄片迅速放入95%的乙醇固定液中进行3min的固定,再经过1min的流水冲洗,进入染色程序⑩按照:苏木素(1min)→流水冲洗(3min)→伊红染液(30s)→流水冲洗(1s)→85%乙醇→95%乙醇(10s)→无水乙醇①(30s)→无水乙醇②(1min)→二甲苯①(1min)→二甲苯②(1min)①将染色完成的标本使用树胶与盖玻片进行封片操作②将标本放到显微镜下,观察拍照记录10×、40×的镜下观3:实验结果:在镜下可观察到小鼠的肝细胞,细胞核被染成蓝色,胞质及细胞间隙被染成淡红色,同时可见大多数细胞中脂肪将细胞核挤到细胞一侧。
4:结果分析及讨论:①切片前先预调好厚度,提前准备好要使用的工具。
②切片时,观察窗不可打开过大,预防温度升高影响切片③在每一次切片之后都应该要注意清理碎屑,以防污染④严格把握染色时间,避免因染色时间太短或太长而影响实验观察5:思考题:①什么时候做冰冻切片:1:在手术:进行中,突然发现病人的病变原及诊断,判断病变是否为肿瘤2:判断肿瘤的良恶性2:了解淋巴结是否有转移的肿瘤细胞,或者转移的程度,以利于确定是否需要彻底扫除淋巴结或者其他的治疗措施。
病理制片技术――冷冻切片的制作一、概述冷冻切片是利用物理降温的方法将新鲜的组织标本冷冻使其产生一定的硬度进行切片的技术方法。
与石蜡切片相比,由于冷冻切片不需脱水包埋因此制片速度快,是为手术进行中的临床医师提供病理诊断的良好方法。
此外由于冷冻切片的标本是未经固定的新鲜组织,因此冷冻切片也是脂肪染色、酶组织化学染色以及某些免疫组织化学染色和原位分子杂交的理想制片方法。
冷冻切片的不足是组织细胞的形态略逊于石蜡切片。
二、冷冻切片的制作方法利用氯乙烷喷洒、二氧化碳喷射、半导体制冷的方法均可制作普通的冷冻切片,用于术中的病理诊断。
恒冷箱冷冻切片机可以制作适用于各种目地的冷冻切片,是目前最为常用的理想冷冻切片制片方式。
1.冷冻切片的技术操作方法(1)将恒冷箱冷冻切片机的速冻头和箱内温度调整到适宜的切温度,一般情况下为一18~一25℃。
(2)在标本冷冻托上涂布一层冷冻包埋剂一OCT,然后将取材后新鲜标本安放在标本冷冻托上并用OCT覆盖标本。
(3)标本冷冻完成后将标本托固定在切片机的机头上,调整机头位置使其恰好位于切片刀的后方。
(4)使用粗切削方式进行标本的粗切削至暴露标本的最大平面,使用自动推进方式连续切削2~3刀后用毛笔清除机头、标本托及切片刀上的组织碎屑。
(5)调整并确认切片的厚度,一般为4~8 um,染脂肪和神经组织应控制在12~25 u m。
(6)放下防卷板使防卷板的位置恰好与切片刀的刀刃完全平行并略突出于刀刃。
(7)以自动推进的方式进行切片,良好的切片将在防卷板的下方形成一张完整平整的薄片,如切片略有弯曲可用小毛笔轻轻展平切片。
(8)打开防卷板,用载玻片平稳地轻压切片使其平整地吸附到载玻片上。
三、冷冻切片的染色切好的冷冻切片立即投入丙酮中进行固定,一般固定1~2 min即可进行染色,用于免疫组化染色的冷冻切片应在切片略干时即刻投入冷甲醇中固定10~15 rmin然后进行相应的组织化学染色程序。
1.冷冻切片的HE染色程序。
冰冻切片的原理、流程和注意事项1冰冻切片的原理冰冻切片是指新鲜组织不经过任何固定、脱水、透明等处理,不需要石蜡包埋,直接在低温恒冷切片机冷冻后马上进行切片的一种方法。
冰冻切片具有操作简单、对环境污染小和对组织抗原损伤小的特点。
又因制作时间和材料有限,保证高质量的冰冻切片非常重要,直接影响病理诊断的正确率。
2冰冻切片的操作流程整体流程:送检和取材要求:•送检标本及时新鲜,组织无需固定,不能遇水,防止冰晶空洞等现象在切片过程中产生•取材的器械要保持干燥,取材时所取的范围应尽量避开出血坏死区域及脂肪区域•所取组织块大小应合适。
组织过大切片时阻力加大,难免产生刀痕及褶皱,加大了制片的难度包埋:•包埋剂一般使用OCT或普通胶水•包埋时将包埋剂涂抹均匀,并根据组织情况和医生的要求确定包埋方向,如管腔、皮肤、囊壁等要立埋•组织体积较小,可先挤入少许胶在包埋托上形成一个”平台“,再放入小组织进行包埋冰冻温度与时间:冰冻的温度与时间时制作冰冻切片的关键因素,需要根据组织的种类、厚度和大小来调节。
如果温度过低,会造成组织过硬、切片破碎;温度过高会造成组织硬度不够,难以切片切片和染色:•在组织和包埋机冻到发白后可以开始切片•是否使用防卷板可根据操作者的习惯,如使用防卷板,一般将其调整到与切片呈5度夹角•切片时右手摇轮转要力道均匀、柔和、缓慢,切片厚度掌握在5微米,左手持毛笔在切片形成时按住组织边缘,使其不发生卷曲•将切片展平粘贴在结晶载玻片上后,应当立即放入固定液中加以固定,如固定不及时,会发生细胞蜕变,切片中细胞核显示不清,呈”云雾状“表现冰冻切片HE染色流程:3冰冻切片的注意事项1. 组织取材要规范冰冻切片的组织要尽可能新鲜,不触碰谁,取材要及时,动作要迅速。
2.取材大小要厚薄适中在确保渠道主要病变的前提下,尽量避开钙化、坏死、脂肪等。
3. 保持取材台面和器材的干净,防止污染4. 组织表示及编号要明确5. 切片固定要及时制片过程要求快速冷冻、快速切片、快速固定。
冰冻切片制备的主要步骤冰冻切片制备是一种常用的生物学和医学实验技术,用于在冷冻状态下快速切割组织样本,并进行随后的病理学诊断或研究。
以下是冰冻切片制备的主要步骤:一、准备样本在进行冰冻切片制备之前,需要准备好待检测的组织样本。
这些样本可以来自各种来源,如手术切除、活检、尸检等。
样本应该尽快放入适当的冷冻介质中,如OCT包埋剂,以保持其冷冻状态。
二、冷冻将准备好的样本放入冷冻切片机中,通常是一个恒温的金属块。
这个金属块被冷却到低于-20℃的低温,确保样本快速冷冻。
在这个过程中,需要特别注意不要让冷冻过度或不足,因为这会影响切片的品质。
三、切片使用冷冻切片机将冷冻好的样本切成薄片。
切片的厚度通常在5-10微米之间,以确保切片能够清楚地显示组织的结构和特征。
这个过程需要熟练的技术员操作,以保证切片的完整性和均匀性。
四、固定刚切好的切片非常容易受到热和湿气的影响,因此需要迅速固定。
通常使用甲醇或乙醇作为固定剂,将切片固定在载玻片上。
这一步可以防止切片在接下来的步骤中滑落或移动。
五、染色固定好的切片需要进行染色以更好地显示其结构和特征。
最常用的染色方法是hematoxylin and eosin (H&E)染色。
这一步可以在染色机中完成,也可以手工操作。
染色完成后,切片会被冲洗干净并彻底干燥。
六、观察和诊断最后一步是将制备好的切片放在显微镜下观察,并进行病理学诊断。
此时,病理学家可以根据切片的特征对疾病进行分类和分级,或者对手术切缘进行评估。
以上就是冰冻切片制备的主要步骤。
需要注意的是,每个步骤都需要严格的操作规程和技术要求,以保证制备出的切片能够准确地反映组织的结构和特征。
冰冻切片实验步骤冰冻切片是一种常用的实验技术,用于研究生物样品的结构和功能。
在冰冻切片实验中,样品必须被快速冻结并制成非常薄的切片,以保持样品的原始结构和形态。
以下是一个冰冻切片实验的一般步骤,供参考。
1.准备工作:-准备所需的实验材料和设备,包括动物或细胞样品、细胞培养基、PBS缓冲液、冷冻剂(如液氮或干冰)、冷冻切片机、切片刀片、切片贴片和载玻片等。
-充分冷却冷冻切片机,并确保切片刀片处于锋利和清洁状态。
-确保实验环境卫生干净,并且操作台面上没有其他杂物和细菌。
2.过度冷冻:-在离心管或培养皿中收集样品,如组织块或细胞团。
-将样品迅速置于冷冻剂中,以快速冷冻样品。
在制备过程中,样品冷冻的速度非常重要,可以使用冰浴或液氮使样品迅速冷冻。
3.制备冷冻样品:-将冷冻固态样品放入冷冻切片机的样品夹内,确保样品与夹具接触良好。
-调整切片刀片的角度和位置,以确保薄片的切割。
-使用冷冻切片机制备冷冻样品,比如用于大脑切片的考尔密斯键切片机。
4.切片过程:-打开冷冻切片机的刀片和样品夹,以容纳载玻片。
-将切片刀片横跨切片机的切片口,并确保刀刃与样品夹接触。
-使用微调装置,轻轻地将切片刀片向下移动,以制备样品切片。
可以根据需要调整切片的厚度。
5.取样和处理:-将切制好的样品轻轻地使用毛刷或细针取下,并将其浸泡在PBS缓冲液或其他处理液中进行进一步处理。
-根据实验需求,可以进行染色、免疫标记和显微镜检查等处理。
6.制备切片贴片和载玻片:-取出切片贴片并将其浸泡在PBS缓冲液中,让其变湿。
-使用镊子或其他工具将处理好的样品放在切片贴片上,然后轻轻地将切片贴片放在载玻片上。
确保样品均匀分布在切片贴片上,并避免形成气泡。
7.干燥和封装:-将切片贴片从PBS缓冲液中取出,用纸巾或吸水纸轻轻地吸去多余的液体。
-将载玻片置于干燥盒中,确保切片在常温下彻底干燥。
-使用合适的密封胶将载玻片封装,以防止切片的氧化和损坏。
总结:冰冻切片实验是一种常用的技术,用于研究生物样品的结构和功能。
术中冰冻病理流程及注意事项下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成,希望大家下载以后,能够帮助大家解决实际的问题。
文档下载后可定制随意修改,请根据实际需要进行相应的调整和使用,谢谢!并且,本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料,如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等,如想了解不同资料格式和写法,敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by theeditor. I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copy excerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!一、术中冰冻病理流程1. 术前准备(1)与手术室医护人员沟通,确保术中冰冻病理设备的正常运行和耗材的准备。
冰冻切片制片程序:
一般形态解剖
常用固定液固定12-24小时抽气10-20
材料水或70%酒精洗几次 5 %阿拉伯胶
抽气10-20‘抽气10-20
10%阿拉伯胶10%甘油(用二甲基亚砜代替)20%阿拉伯胶(明
临时片胶)包埋把材料固定于固着器切片溶胶选片
永久片
染色脱水透明,封片
阿拉伯胶的配制:
称取20g阿拉伯胶(明胶)+80ml水,加热溶解高压,15分钟可配成20%浓度明胶,
切片:
开机声响停止后按下左边第一个按钮预热安装冷冻架及刀片固定
按下左边的红按钮预冷刀片等冷冻架布满霜后将固定材料的壁上涂上胶水将包埋有材料的明胶切成小块,贴到壁上放正后,按下左起第三个白按钮,使其迅速降温冻结,等整下材料冻结变白后,将温度调到-10℃(旋转白色旋钮),将刀移到适当位置,固定,开始切片(刚开始,将厚度调大,切到材料后,将厚度调到20-25µm), 如材料移到头,可将右侧手柄放到最下后,摇左侧手柄使其退后,切完后,按下左起第四个白按钮不放,使材料迅速解冻后取下材料,继续做下一个材料,或关掉冷冻刀按钮及开关清扫冷冻架,取下刀并抹上机油。
冰冻切片组织的制备:固定将组织置于4%多聚甲醛固定液中,4℃摇床过夜。
漂洗将固定后的标本用1X PBS漂洗三次,每次15分钟。
脱水将组织置于30%蔗糖溶液中,4℃摇床过夜。
第二天观察是否脱水完全,判断的标准是,当管竖直时,组织是否沉到蔗糖溶液的底部,若组织已完全沉降到蔗糖溶液的底部,平放或震荡后仍能沉降,则可判断组织已脱水完全。
包埋将组织倒入培养皿中,用眼科刀将脑和脊髓根据切片切面的需要在不同的部位切开,并做好头尾端的标记。
之后将组织置于包埋盒中,用滤纸吸干组织周围多余的蔗糖溶液,滴加OCT(optimal cutting temperature compound)到包埋盒中,用移液枪头小心的将组织周围的O.C.T混匀,切忌起气泡,静止10分钟,以防切片时脱片。
重新取一个包埋盒,将组织移入到包埋盒中,倒入OCT,再次用移液枪头将组织与O.C.T 混匀,将组织按切片需要方向摆放于包埋盒的底部,迅速置于干冰与酒精的混合物中。
在包埋盒上做好标记,用保鲜膜和锡纸包好后放入-80℃冰箱贮藏待切。
切片:切片前先将切片机的箱体温度及刀头温度均设为-20℃,把包埋盒从-80℃冰箱取出置于切片机中平衡半小时左右。
之后将包埋块用O.C.T固定在样品托上,然后将样品托固定在样品头上,调整合适的位置,以使样品与刀头处于平行位置。
手动切片。
用细毛笔将切片均匀整齐地平铺在明胶包被的载玻片上,室温下晾片30min-1h后进行免疫组化染色。
冰冻切片的快速染色法冰冻切片附贴于载玻片后,立即放入恒冷箱中的固定液固定1分钟后即可染色。
以往,为了防止切片脱落,当切片附贴于载玻片后,即用电吹风吹干后再固定。
根据实验对比认为这种做法欠妥未经固定的切片,强热作用后,蛋白发生变性,核内含有的物质由于热的作用融合在一起,染色后镜下分辨不出核内的各种物质。
冰冻切片附贴于载玻片后,立即放入恒冷箱中的固定液固定,这样可以使切片中细胞内各种物质都在没有任何变化的情况下被固定起来,核染色质清晰,核仁明显,其他物质都完好保存。
病理冰冻切片的制片流程:
①取材,未能固定的组织取材,不能太大太厚,厚者冰冻费时,大者难以切完整,好为24×24×2mm。
②取出组织支承器,放平摆好组织,周边滴上包埋剂,速放于冷冻台上,冰冻。
小组织的应先取一支承器,滴上包埋剂让其冷冻,形成一个小台后,再放上细小组织,滴上包埋剂。
③将冷冻好的组织块,夹紧于切片机持承器上,启动粗进退键,转动旋钮,将组织修平。
④调好欲切的厚度,根据不同的组织而定,原则上是细胞密集的薄切,纤维多细胞稀的可稍为厚切,一般在5~10um间。
⑤调好防卷板。
制作冰冻切片,关键在于防卷板的调节上,这就要求操作者要细心,准确地将其调较好,调校至适当的位置。
切片时,切出的切片能在时间顺利地通过刀防卷板间的通道,平整地躺在持刀器的铁板上。
这时便可掀起防卷板,取一载玻片,将其附贴上即可。
⑥应视不同的组织选择不同的冷冻度。
冷冻箱中冷冻度的高低,主要根据不同的组织而定,不能一概而论。
如:切未经固定的脑组织,肝组织和**结时,冷冻箱中的温度不能调太低,在-10--15℃左右,切甲状腺、脾、肾、肌肉等组织时,可调在-15~20℃左右,切带脂肪的组织时,应调至-25℃左右,切含大量的脂肪时,应调至-30℃。