利用椭圆小球藻硝酸还原酶缺失突变体为生物反应器表达兔防御素NP-1蛋白

三种酶解蛋白肽分别替代部分鱼粉对凡纳滨对虾幼虾生长、体组成和抗氧化性能的影响作者：鲍清华夏辉杨煜洁黄小容来源：《河北渔业》2024年第01期摘要：為研究使用低值动物酶解蛋白替代部分鱼粉对凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）生长、体组成和抗氧化性能的影响，以初始体重为（0.05±0.01）g的凡纳滨对虾为研究对象，进行为期8周的养殖试验，未替代鱼粉组为对照组，用5%的鱿鱼肽、鱼肽和鸡肽分别替代饲料中的鱼粉为替代组，配制4种等氮等脂饲料。

结果表明：鱿鱼肽组和鱼肽组与对照组相比特定生长率显著提高，而鸡肽组无显著差异，与对照组相比仅鱿鱼肽组粗蛋白含量显著增加，各替代组的粗脂肪含量均显著升高。

各替代组肝胰腺T-AOC活性均显著上升。

与对照组相比，鱿鱼肽组SOD、GSH-Px和CAT的活性均显著上升，而鱼肽和鸡肽组均未显著上升，各替代组血淋巴和肝胰腺中MDA含量均显著下降，鱿鱼肽组上调了Nrf2基因表达和HO-1基因表达，下调了Keap1基因表达。

综上所述，鱿鱼肽和鱼肽对凡纳滨对虾幼虾的生长性能都有着显著的促进作用，但在提高对虾的营养水平，促进抗氧化基因的表达，减少抗氧化过程对机体内细胞的损伤方面，鱿鱼肽效果更佳。

关键词：凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）；酶解蛋白；生长性能；抗氧化性能凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）是我国对虾主导养殖品种，养殖产量呈现逐年递增的趋势，2022年养殖产量达到209.87万t，比2021年增长了12.99%[1]。

随着凡纳滨对虾养殖规模的增加，对虾饲料需求量增加，鱼粉的需求量也随之飙升。

然而，鱼粉受海洋捕捞量、极端天气以及海洋环境等多方面因素的影响，出现了供求关系失衡的状况。

目前，寻求价格低廉、来源广泛、以及对生态环境没有负影响的鱼粉替代蛋白源已成为当务之急。

现阶段，利用低值动物蛋白酶解后的产品替代鱼粉成为解决鱼粉短缺问题极具经济价值的方式。

河南农业科学，2024，53（1）：12‑21Journal of Henan Agricultural Sciencesdoi:10.15933/ki.1004-3268.2024.01.002玉米逆境胁迫响应基因ZmTPR 1的表达和功能分析曹丽茹1，2，梁小菡1，2，马晨晨1，2，叶飞宇1，2，庞芸芸1，李伟亚1，2，张新1，2，鲁晓民1，2（1.河南省农业科学院粮食作物研究所，河南郑州450002；2.神农种业实验室，河南郑州450002）摘要：在前期干旱-复水处理玉米转录组测序基础上，发现了一个响应干旱胁迫的基因ZmTPR 1（Tetratricopeptide repeat 1），对该基因进行生物信息学分析，并探究其在不同组织及逆境胁迫下的表达模式，利用CRISPR-Cas9技术敲除拟南芥中的同源基因AtTPR 1，分析干旱胁迫条件下纯合突变体植株的表型和生理生化指标，初步探究该基因的功能，为培育抗旱玉米品种提供基因资源。

结果表明，ZmTPR 1基因位于玉米的第3号染色体，编码421个氨基酸，具有保守的卷曲螺旋结构域，可能参与玉米对植物激素、干旱等胁迫的响应。

ZmTPR 1基因在玉米各组织中均表达，在幼茎中的表达量最高；干旱、高温、盐和缺氮胁迫均可诱导ZmTPR 1基因的表达，干旱胁迫后表达量上调最明显；干旱胁迫后ZmTPR 1基因在抗旱玉米自交系郑36中的表达量均极显著高于敏旱玉米自交系B73。

敲除AtTPR 1基因后拟南芥抗旱能力下降，Attpr 1突变体在干旱胁迫下生长受到严重抑制，叶片萎蔫甚至干死，同时相对含水量、叶绿素含量、净光合速率及过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性极显著降低，丙二醛含量极显著升高。

综合来看，ZmTPR 1基因参与玉米对多种非生物胁迫的响应过程，并在响应干旱胁迫中发挥着重要的作用。

关键词：玉米；四肽重复蛋白；非生物胁迫；抗旱性；表达模式中图分类号：S513文献标志码：A文章编号：1004-3268（2024）01-0012-10收稿日期：2023-09-01基金项目：河南省农业科学院杰出青年科技基金项目（2022JQ02）；中央引导地方科技发展资金项目（Z20221343040）；神农种业实验室项目（SN01-2022-02）作者简介：曹丽茹（1988-），女，河南濮阳人，副研究员，博士，主要从事玉米逆境生理与分子生物学研究及种质创制和新品种选育工作。

2004 年 2 月The Chinese Journal of Process Engineering Feb. 2004 氮源对转基因小球藻异养生长及兔防御素表达的影响韩兴梅1，李元广1，魏晓东1，孙勇如2，王义琴2(1. 华东理工大学海洋生化工程研究所生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237；2. 中国科学院遗传与发育生物学研究所，北京 100101)摘要：在250 ml摇瓶中研究了氮源对转兔防御素(NP−1)基因小球藻的异养生长和NP−1表达的影响，结果表明，转NP−1基因小球藻异养培养的最适氮源为硝酸钾和酵母粉，二者的最佳浓度分别为0.9和9 g/L，藻细胞密度达5.11 g/L，是不添加硝酸钾时细胞密度的1.55倍，而NP−1表达量基本不变. 5 L生物反应器分批培养结果表明，转NP−1基因小球藻在含有硝酸钾和酵母粉两种混合氮源的培养基中培养时，硝酸钾被快速消耗而有机氮源充足，藻细胞内的叶绿素和蛋白质含量下降，但NP−1表达量基本不变.关键词：转基因小球藻；兔防御素；氮源；异养培养；表达中图分类号：Q949.2 文献标识码：A 文章编号：1009−606X(2004)01−0016−061 前言防御素是广泛分布于动植物及昆虫体内的一类抗菌肽，含量极少，却执行着重要的机体防御功能[1]. 目前，从生物界分离到的防御素已达30多种，其中以兔防御素(NP−1)的抗菌谱最广，它对很多革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌、被膜病毒和鼠肿瘤细胞，尤其是对幽门螺杆菌和艾滋病病毒有显著的毒杀作用[2]. 因此，NP−1在医药方面具有重要的应用价值.目前，通过化学合成法和直接提取法可获得防御素，但由于工艺路线复杂，成本极高，不具有应用价值[3]. 因此，通过基因工程方法生产防御素成为该领域的研究热点. Piers等[4]通过融合蛋白途径试图在细菌中表达人的防御素HNP−1，但得到的HNP−1没有生物学活性；徐志南等[5]通过融合蛋白途径在大肠杆菌中表达β−人防御素，但表达量很低且尚不知所表达的产物是否有活性. Chen等[6]用电激法将NP−1基因成功地导入小球藻细胞中，体外离体抑菌实验证明NP−1基因已稳定整合到小球藻基因组中，并进行了正确转录和表达，因此利用转NP−1基因小球藻有望规模化制备NP−1.转NP−1基因小球藻高密度高表达培养是规模化制备NP−1的关键技术之一. 众所周知，氮源是影响基因工程菌生长及外源蛋白表达的重要因素. 目前，氮源对小球藻异养生长的影响有较多的研究[7,8]，而有关氮源对转基因小球藻异养生长及外源基因产物表达的影响却未见报道. 本工作考察了氮源对转基因小球藻异养生长和NP−1表达的影响，为该转基因藻高密度高表达培养工艺优化奠定了基础.2 材料与方法2.1 材料藻种：转NP-1基因小球藻(Chlorella ellipsoidea)由中国科学院遗传与发育生物学研究所提供，收稿日期：2003−04−29，修回日期：2003−06−11基金项目：国家863计划海洋生物技术主题资助项目(编号：2002AA629110)作者简介：韩兴梅(1978−)，女，黑龙江省鸡西市人，硕士研究生，海洋生化工程专业；李元广，通讯联系人，E-mail :ygli@.具体构建方法参见文献[6]，NP-1基因是由Ubiquitin启动子控制，无需外界条件诱导.2.2 培养方法摇瓶培养于250 ml摇瓶中进行，接种量为0.05 g/L，装液量为100 ml，培养温度28o C，摇床转速140 r/min. 反应器培养于5 L生物反应器(上海保兴生物设备工程有限公司制造)中进行，装液量为3 L，培养温度28o C，转速200 r/min，通气量3 L/min.2.3 培养基所用3种培养基成份见表 1. 微量元素溶液配方为(g/L)：H3BO4 0.061, ZnSO4⋅7H2O 0.287, MnSO4⋅H2O 0.169, (NH4)6MoO24⋅4H2O 0.01235, CuSO4⋅5H2O 0.00249，水 1 L.表1 培养基组成Table 1 Composition of mediumComposition 1# medium 2# medium 3# mediumGlucose (g) 3 15 15Yeast extract (g) 3 9 9KNO3 (g) 0 0 0.9KH2PO4 (g) 0.025 0.1 0.1Ca(NO3)2 (g) 0.1 0.2 0.2MgSO4 (g) 0.025 0.05 0.05KCl (g) 0.012 0.06 0.06FeCl3 (g) 0.001 0.01 0.01Trace elements (ml) 0 1 12.4 分析方法生物量的测定：在一定范围内，藻细胞浓度C X(用细胞干重表示)与OD值呈线性关系，根据波长540 nm的光密度OD540，由标准曲线计算：C X(g/L)=0.431OD540−0.02 (R2=0.988).NP-1的测定[2]：外源蛋白NP−1为胞内产物，其含量采用抑菌圈法间接测定. 将一定细胞浓度的藻液离心，藻体用去离子水清洗3遍后，根据藻体湿重加入3倍体积的水进行超声破碎，使每次破碎液中藻细胞浓度相同. 将培养过夜的大肠杆菌均匀涂布于LB固体培养基上，待表面液体消失后，用无菌打孔器在培养基上做点样孔(孔径13 mm)，加入100 µl超声破碎后的藻液，在37o C 培养箱中培养12 h，测量抑菌圈的大小.葡萄糖的测定采用葡萄糖试剂盒(卫生部上海生物制品所)；NO3−的测定采用水杨酸比色法[9]；氨基氮的测定采用甲醛滴定法[10]；叶绿素的测定采用丙酮提取比色法[11].3 结果与讨论3.1 氮源种类对转基因藻生长的影响氮是蛋白质、核酸以及叶绿素的重要组成成份，因此氮源种类和浓度必然对藻细胞的生长和外源蛋白的表达产生影响. 小球藻能够利用包括硝酸盐、铵盐、尿素、氨基酸、酵母粉等多种形式的无机和有机氮源[12]，不同的藻种最适的氮源也不同. 因此首先考察氮源种类对转基因小球藻生长的影响.在不添加氮源的1#培养基中考察了硝酸钾、硝酸铵、氯化铵、硫酸铵、尿素、甘氨酸、酵母粉7种氮源(浓度均为3 g/L)对转NP−1基因小球藻生长的影响，结果见图1. 由图可见，在所用的7种氮源中，转NP−1基因小球藻的生长差别很大. 分别以氯化铵、硝酸铵、硫酸铵、甘氨酸为唯一氮源时，转基因藻几乎不能生长；以硝酸钾或尿素为氮源时，转NP−1基因小球藻生长缓慢，培养70 h，细胞密度仅从接种时的0.05 g/L增加到0.25 g/L左右，平均生长速率不足3 mg/h. 而以酵母粉为唯一氮源的转基因藻所得的生物量最高，培养到70 h 时，细胞密度已达1.12 g/L ，是硝酸钾和尿素的4.48倍. 由此可见当采用单一氮源培养转NP −1基因小球藻时，酵母粉是最佳氮源.204060800.00.20.40.60.81.01.2Time (h)C X (g /L )20406080100123456Time (h)C X (g /L )图1 不同氮源对异养培养转NP -1基因小球藻生长 图2 添加不同浓度的硝酸钾对转NP -1基因的影响 小球藻生长的影响Fig.1 Effects of different nitrogen sources on the growth Fig.2 Effect of initial KNO 3 conc. added on theof transgenic Chlorella with NP-1 gene growth of transgenic Chlorella with NP-1 gene3.2 混合氮源对藻细胞生长和NP-1表达的影响 3.2.1 添加硝酸钾的影响对碳源、氮源、无机盐进行单因素优化，得到2#培养基. 目前，在小球藻的异养培养中，硝酸钾被认为是一种较好的氮源[13−15]，但同时采用硝酸钾和有机氮源异养培养小球藻的研究未见报道. 因此，在2#培养基中添加不同浓度(0.1∼2.1 g/L)的硝酸钾，研究硝酸钾和酵母粉混合氮源对转基因小球藻生长和NP −1表达的影响. 对照(control)不含硝酸钾(即2#培养基).由图2可以看出，当细胞密度较低时，在2#培养基中添加硝酸钾与否不影响转NP -1基因小球藻的生长；从67 h 开始，添加不同浓度的硝酸钾对转基因藻的生长表现出明显的促进作用，细胞密度比对照有了明显的提高. 培养到96 h ，按照硝酸钾浓度由低到高的顺序对应的生物量分别为3.78, 4.86, 5.11, 5.28, 5.41, 5.21 g/L ，而对照只有3.29 g/L .由表2可见，当硝酸钾浓度在0.1∼0.9 g/L 时，抑菌圈直径变化较小，当硝酸钾浓度超过0.9 g/L 时，抑菌圈直径从21 mm 下降到17 mm 左右，这可能是因为高浓度的K +增加了藻细胞膜的通透性，而NP −1是分子量为3 kDa 的短肽，细胞膜通透性的增加可能导致胞内的部分NP −1外泄. 由于抑菌圈的大小反映胞内NP −1的表达量，随着K +浓度的增加，细胞膜的通透性逐渐加大，胞内外泄的NP −1量相应增加，因而抑菌圈直径也下降较大. 因此从转基因藻的细胞密度和NP −1表达量来看，硝酸钾的添加浓度以0.9 g/L 为宜. 在此浓度下，藻细胞的密度为对照的1.55倍，而抑菌圈直径(即NP −1的表达量)基本不变.表2 添加不同浓度的硝酸钾对转基因小球藻中NP-1表达量的影响Table 2 Effect of initial KNO 3 concentration on NP −1 expression in transgenic ChlorellaInitial KNO 3 concentration (g/L) 0 0.1 0.5 0.9 1.3 1.7 2.1 Antimicrobial diameter (mm) 21.9 22.2 21.5 21 17 17.9 17.93.2.2 初始酵母粉浓度的影响在2#培养基中添加0.9 g/L 硝酸钾，得到3#培养基. 由于前述研究发现酵母粉是转基因藻的最佳氮源，因此改变3#培养基中酵母粉浓度，考察其对转基因小球藻生长和NP −1表达量的影响.2040608010012345Time (h)C X (g /L )由图3可见，改变培养基中酵母粉浓度对转NP −1基因小球藻生长有很大影响. 1和3 g/L的酵母粉明显不利于小球藻的生长，培养96 h 的细胞密度仅分别为2.22和3.31 g/L. 当细胞密度较低时，其它几种氮源浓度对转基因藻生长影响不大；从72 h 开始，9 g/L 的酵母粉逐渐表现出对转NP −1基因小球藻生长的促进作用. 培养到84 h ，细胞密度已达5.03 g/L. 从抑菌圈直径变化看，酵母粉浓度对NP −1的表达量影响不大(表3). 由此可见，酵母粉浓度为9 g/L 适合转基因小球藻生长和NP −1表达.图3 初始酵母粉浓度对转NP -1基因小球藻生长的影响Fig.3 Effect of initial yeast extract conc. on the growthof transgenic Chlorella with NP-1 gene表3 不同浓度的酵母粉对转基因小球藻中NP-1表达量的影响Table 3 Effect of initial yeast extract concentration on NP-1 expression in transgenic ChlorellaInitial yeast extract conc. (g/L) 1 3 5 7 9 11Antimicrobial diameter (mm)22.4 21.9 21.7 20.1 21.4 20.53.3 转NP-1基因小球藻异养培养过程特征分析通过摇瓶培养研究确定了硝酸钾和酵母粉的最佳浓度(即3#培养基)，为了进一步考察转NP −1基因小球藻在含有硝酸钾和酵母粉两种混合氮源的3#培养基中异养培养时氮源的利用情况以及藻细胞生长、NP −1表达、蛋白质和叶绿素含量的变化特征，同时也为考察转NP −1基因小球藻在生物反应器中的培养情况，在5 L 生物反应器中利用3#培养基进行了转基因小球藻的分批异养培养，结果见图4~6.由图4可以看出，藻细胞经过一段延迟期后便快速生长，72 h 后藻细胞密度基本不再增加. 72 h 时的细胞密度达5 g/L ，培养液中的葡萄糖还有约4 g/L ，这表明碳源不是限制转NP −1基因小球藻生长的主要原因. 从培养基中氨基氮含量来看，有机氮源比较充足，氨基氮也不是限制转NP −1基因小球藻生长的原因. 从硝酸钾的消耗曲线可以看出，在延迟期硝酸钾浓度变化较小，但藻细胞进入指数生长期后，硝酸钾的消耗速率很快，48 h 时培养液中已基本不含硝酸钾，而此时的细胞密度仅为3.25 g/L ，这说明转NP −1基因小球藻在缺乏硝酸钾的条件下还会利用有机氮源继续生长约24 h. 由此可见，在培养过程中硝酸钾被快速消耗而有机氮源较充足.2468101214Time (h)C X a n d g l u c o s e c o n t e n t (g /L )0.00.51.01.52.0N H 2-N a n d K N O 3 c o n t e n t (g /L )NP −1是含33个氨基酸的短肽，分子量约为3 kDa ，因此藻体蛋白质含量的变化可能会影响NP −1的表达量. 由图5可见，随着培养过程不断进行，藻细胞中蛋白质含量缓慢下降，从36 h 时的48.54%下降到84 h 时的35.51%. 潘欣等[16]报道异养培养的小球藻蛋白质含量仅为细胞干重的23.67%，而转NP −1基因小球藻的蛋白质含量较高的原因可能是培养基中有机氮源图4 转NP -1基因小球藻在5 L 反应器中的分批异养培养Fig.4 Batch heterotrophic cultivation of transgenicChlorella with NP-1 gene in a 5 L bioreactor较充足之故. 从图5还可看出，在培养过程中虽然藻细胞的蛋白质含量下降，藻细胞中NP −1的表达量(抑菌圈直径)并没有表现出相应的下降趋势，这说明NP −1的表达量并不是与藻体的蛋白质含量呈简单的正相关关系.20304050607080903035404550P r o t e i n c o n t e n t (%)Time (h)2021222324A n t i m i c r o b i a l d i a m e t e r (m m )02040608010203040Time (h)C h l o r o p h y l l c o n c e n t r a t i o n (m g /L )8121620C h l o r o p h y l l c o n t e n t (m g /g )图5 转NP -1基因小球藻在分批培养过程中 图6 转NP -1基因小球藻在培养过程中叶绿素蛋白质含量的变化 含量的变化Fig.5 Protein content during batch culture of Fig.6 Chlorophyll content during batch culture oftransgenic Chlorella with NP-1 gene transgenic Chlorella with NP-1 gene由图6可以看出，随着细胞密度的增加，单位体积的叶绿素含量也不断增加，最高含量可达41.09 mg/L ；而单位藻体的叶绿素含量却呈下降趋势，从接种时的19.8 mg/g 到培养82 h 时的8.3 mg/g ，但下降速率并不相同. 0∼12 h 下降较快，对应的硝酸钾浓度却只减少了0.05 g/L ；12 h 后单位藻体的叶绿素含量下降较慢，36 h 之内将0.68 g/L 的硝酸钾消耗完. 这表明在混合氮源共存的情况下，硝酸钾消耗越快，藻体的叶绿素含量下降越慢，转基因小球藻可能将所利用的硝酸钾合成叶绿素而储存在叶绿体中；48 h 后培养基中已不含硝酸钾，单位藻体的叶绿素含量基本不变，这可能是由于酵母粉为转基因藻提供充足的氮源用以合成叶绿素所致. 刘学铭等[14]认为在硝酸钾供给充足的情况下，叶绿素的含量不会减少. 本文的结果表明，在硝酸钾仍然存在的条件下，单位藻体的叶绿素含量却不断下降. 这种现象的出现可能是由于小球藻在以硝酸钾为唯一氮源和以硝酸钾、酵母粉这两种混合氮源进行异养培养时，在利用氮源合成叶绿素的机制上有所差异.4 结 论采用单一氮源异养培养转NP −1基因小球藻时，最适氮源为酵母粉. 在含有酵母粉的培养基中添加硝酸钾有利于转基因藻的生长，但硝酸钾浓度超过0.9 g/L 时会抑制NP −1的表达. 转NP −1基因小球藻异养培养的最适氮源为硝酸钾和酵母粉，二者的最佳浓度分别为0.9和9 g/L. 转NP −1基因小球藻在含有硝酸钾和酵母粉两种混合氮源的培养基中培养时，硝酸钾被快速消耗而有机氮源较充足，藻细胞内的叶绿素和蛋白质含量会下降，但NP −1表达量基本不变.参考文献：[1] 陈颖，葛毅强，张利明. 哺乳动物防御素的研究进展及其应用 [J]. 生物化学与生物物理进展, 2001, 28(1): 17−21. [2] 王义琴，陈颖，白琴华，等. 以小球藻为载体生产兔防御素的研究 [J]. 高技术通讯, 2001, 11(9): 1−5. [3] Hancock R W, Robert L. Cationic Peptides: A New Source of Antibiotics [J]. Tibtech, 1998, 16: 82−88.[4] Piers K L, Brown M H, Hancock Robert E W. Recombinant DNA Procedures for Producing Small Antimicrobial CationicPeptides in Bacteria [J]. Gene, 1993, 134: 7−13.[5] 徐志南，彭力，方向明，等. β−人防御素−2在大肠杆菌中的重组表达及优化 [J]. 精细与专用化学品, 2002, (增刊):39−42.[6] Chen Y, Wang Y Q, Sun Y R, et al. Highly Efficient Expression of Rabbit Neutrophil Peptide-1 Gene in Chlorella ellipsoideaCells [J]. Curr. Genet., 2001, 39: 365−370.[7] Shi X M, Zhang X W, Chen F. Heterotrophic Production of Biomass and Lutein by Chlorella protothecoides on V ariousNitrogen Sources [J]. Enzyme Microb. Technol., 2000,27: 312−318.[8] 刘学铭，梁世中. 谷氨酸对异养培养小球藻生长的影响 [J]. 氨基酸与生物资源, 1999, 21(1): 1−3.[9] Hecht U, Mohr H. Factors Controlling Nitrate and Ammonium Accumulation in Mmustard (Sinapis alba) Seedlings [J]. 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Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China) Abstract: The influence of nitrogen sources on the heterotrophic growth of transgenic Chlorella and rabbit defensin (NP-1) expression in a 250 ml flask was investigated. The results showed that KNO3 and yeast extract were the optimal nitrogen sources for the heterotrophic culture of transgenic Chlorella with NP-1 gene. Dry weight cell density of transgenic Chlorella was improved from3.29 g/L to 5.11 g/L and NP-1 expression capability kept unchanged as the concentration of KNO3 and yeast extract were 0.9 g/L and 9 g/L respectively. Batch culture of transgenic Chlorella with NP-1 gene in a 5 L bioreactor with the optimized medium was conducted and the process characteristics were also analyzed. It was found that KNO3 was consumed quickly and organic nitrogen was enough in the medium, and chlorophyll and protein contents of transgenic Chlorella decreased while NP-1 expression capability kept unchanged.Key words: transgenic Chlorella; rabbit defensin; nitrogen source; heterotrophic culture; expression。

江苏省盐城市、南京市2024届高三第一次模拟考试生物试卷学校：___________姓名：___________班级：___________考号：___________一、单选题1．叶绿素a（C55H72O5N4Mg）头部和尾部分别具有亲水性和亲脂性。

下列相关叙述正确的是( )A.叶绿素a的尾部主要嵌在叶绿体的内膜中B.镁元素在植物体内主要以叶绿素a等化合物的形式存在C.常用无水乙醇作层析液分离出绿叶中的叶绿素aD.叶绿素a呈蓝绿色，合成时需要光照和适宜温度2．SREBP前体由S蛋白协助从内质网转运到高尔基体，经酶切后产生具有转录调节活性的结构域，随后转运到细胞核激活胆固醇合成相关基因的表达。

白桦醋醇能特异性结合S蛋白并抑制其活化。

下列相关叙述错误．．的是( )A.胆固醇不溶于水，在人体内参与血液中脂质的运输B.SREBP前体常以囊泡形式从内质网转运到高尔基体加工C.S蛋白可以调节胆固醇合成酶基因在细胞核内的转录D.白桦醋醇能抑制胆固醇合成并降低血液中胆固醇含量3．下列有关实验的叙述正确的是( )A.双缩脲试剂鉴定高温处理后的淀粉酶时出现紫色现象，说明淀粉酶没有失活B.溴麝香草酚蓝溶液是酸碱指示剂，该溶液中CO2含量增高时将由蓝变为黄绿色C.洋葱鳞片叶外表皮细胞质壁分离及复原过程中，水分子主要通过自由扩散进出细胞D.利用向日葵舌状花花冠的表皮细胞观察胞质环流，发现叶绿体按一定方向移动4．下列关于遗传规律研究的叙述正确的是( )A.自然状态下豌豆自花传粉进行自交，玉米等异花传粉植物可进行自由交配B.两种玉米杂交产生的F1出现两种性状且分离比为3：1，则可验证分离定律C.基因型为YyRr的豌豆产生的雌雄配子随机结合，体现自由组合定律的实质D.性状分离比的模拟实验中两桶内小球总数可不同，抓取小球统计后需放入新桶5．下列关于生物进化的叙述正确的是( )A.突变和基因重组为生物进化提供原材料，是生物进化的根本来源B.种群基因频率的变化决定了种群进化方向，也决定了群落演替方向C.遗传平衡种群世代间的基因频率不会发生改变，基因库也不会发生改变D.蓝细菌改变了早期地球的大气成分进而促进了好氧生物的发展，属于协同进化6．下列关于基因表达调控的相关叙述正确的是( )A.DNA甲基化通过改变互补碱基之间的氢键数目和配对方式影响基因转录B.构成染色体的组蛋白若发生乙酰化或甲基化修饰都能激活相应基因表达C.一些非编码微RNA具有组织特异性和时序性，只在特定的组织或发育阶段调控基因表达D.同卵双胞胎表型差异与蜂王和雄蜂表型差异均属于表观遗传现象7．原发性醛固酮增多症（PA）是继发性高血压的常见原因。

HEREDITAS (Beijing) 2011年5月, 33(5): 512―519 ISSN 0253-9772 综 述收稿日期: 2010−11−01; 修回日期: 2011−01−27基金项目:转基因生物新品种培育重大专项(编号：2008ZX08002-001)资助作者简介:付蓝宝, 硕士研究生, 专业方向：生物化学与分子生物学。

E-mail: fulanbao@通讯作者:刘伟华, 博士, 研究员, 研究方向：小麦分子遗传与基因工程。

E-mail: liuwh@DOI: 10.3724/SP.J.1005.2011.00512防御素的生物学特性及其抗病基因工程付蓝宝1, 2, 于嘉林1, 刘伟华21. 中国农业大学农业生物技术国家重点实验室, 北京 100193;2. 中国农业科学院作物科学研究所, 农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程, 北京 100081摘要: 防御素是一种富含半胱氨酸的小分子多肽, 对细菌等微生物具有广谱抗性, 且作用机制特殊。

迄今为止,国内外在防御素方面进行了大量的研究, 已经从各类生物体中分离出不同种类的防御素, 并在基因工程和医药 领域呈现广泛的应用前景。

文章对防御素的分类、生物学特性, 包括哺乳动物α-、β-、θ-防御素、昆虫以及植物防御素的分子结构及抗菌活性进行了综述, 阐述了防御素的膜作用及与细胞内复合物结合的作用机制。

总结和归纳了防御素基因的分离、表达研究进展及动、植物防御素基因在抗病基因工程领域的应用, 并对防御素在未来的生物制药和植物抗病基因工程方面的应用前景进行了展望。

关键词: 防御素; 抗病; 基因工程Biological characteristics of defensin and its disease-resistance genetic engineeringFU Lan-Bao 1, 2, YU Jia-Lin 1, LIU Wei-Hua 21. The State Key Laboratory for Agro-biotechnology , China Agricultural University , Beijing 100193, China ;2. National Key Facilities for Crop Gene Resources and Genetic Improvement/Institute of Crop Sciences , Chinese Academy of Agricultural Sciences , Beijing 100081, ChinaAbstract: Defensin is a kind of cysteine-rich small peptide, which has a broad spectrum of resistance to bacteria with a special resistance mechanism. So far, a large number of studies on defensins have been reported, and the different types of defensins have been isolated from various organisms. A broad prospect of application on defensins has been displayed both in genetic engineering and medicine field. This article reviewed the classification and the biological characteristics of defensins, including mammalian α-, β-, θ-defensins, insect defensins, and plant defensins. The molecular structures, antibacterial activities, and antibacterial mechanisms of these definsins were summarized. The two mechanisms of de-fensin, including independent membrane mechanism and targeting of intracellular compounds by defensins, are ex-pounded. This paper also summarized the researches on isolation and expression of defensin genes and disease resistance genetic engineering of mammal and plant defensins. A prospect of the future applications of defensin both in biophar-maceutical sciences and plant disease resistance genetic engineering was discussed.Keywords: defensin; disease resistance; genetic engineering第5期付蓝宝等:防御素的生物学特性及其抗病基因工程5131 防御素的种类及生物学特性生物在病原体侵染时, 自身会产生一系列的拮抗物质, 以阻止病害的传播和病原微生物的进一步侵染, 这种系统被称为防御系统。

专题20 实验与探究2023年高考真题一、单选题1．（2023·北京·统考高考真题）研究者检测了长期注射吗啡的小鼠和注射生理盐水的小鼠伤口愈合情况，结果如图。

由图可以得出的结论是（）A．吗啡减缓伤口愈合B．阿片受体促进伤口愈合C．生理条件下体内也有吗啡产生D．阿片受体与吗啡成瘾有关二、综合题2．（2023·北京·统考高考真题）为了研究城市人工光照对节肢动物群落的影响，研究者在城市森林边缘进行了延长光照时间的实验（此实验中人工光源对植物的影响可以忽略；实验期间，天气等环境因素基本稳定）。

实验持续15天：1～5天，无人工光照；6～10天，每日黄昏后和次日太阳升起前人为增加光照时间；11～15天，无人工光照。

在此期间，每日黄昏前特定时间段，通过多个调查点的装置捕获节肢动物，按食性将其归入三种生态功能团，即植食动物（如蛾类幼虫）、肉食动物（如蜘蛛）和腐食动物（如蚂蚁），结果如图。

(1)动物捕获量直接反映动物的活跃程度。

本研究说明人为增加光照时间会影响节肢动物的活跃程度，依据是：与1～5、11～15天相比，______________。

(2)光是生态系统中的非生物成分。

在本研究中，人工光照最可能作为___________对节肢动物产生影响，从而在生态系统中发挥作用。

(3)增加人工光照会对生物群落结构产生多方面的影响，如：肉食动物在黄昏前活动加强，有限的食物资源导致___________加剧；群落空间结构在___________两个维度发生改变。

(4)有人认为本实验只需进行10天研究即可，没有必要收集11～15天的数据。

相比于10天方案，15天方案除了增加对照组数量以降低随机因素影响外，另一个主要优点是________________。

(5)城市是人类构筑的大型聚集地，在进行城市小型绿地生态景观设计时应__________。

A．不仅满足市民的审美需求，还需考虑对其他生物的影响B．设置严密围栏，防止动物进入和植物扩散C．以整体和平衡的观点进行设计，追求生态系统的可持续发展D．选择长时间景观照明光源时，以有利于植物生长作为唯一标准3．（2023·北京·统考高考真题）自然界中不同微生物之间存在着复杂的相互作用。

磁性纳米颗粒介导的椭圆小球藻转化体系的建立作者：曹苏珊薛静陈绪清王倩楠张秀海安贤惠来源：《江苏农业学报》2020年第02期摘要：旨在利用磁性納米颗粒作为载体构建小球藻的新型转化方法，由于纳米载体技术已经被成功地应用于动、植物的遗传转化中，其主要优势是相对于传统转化技术更加便捷、高效。

本研究首先利用磁性纳米颗粒吸附含有增强型绿色荧光蛋白基因（EGFP）的质粒载体pYBA1132，形成纳米颗粒-基因复合物，通过磁场作用对椭圆小球藻原生质体进行转化，进而观察EGFP基因在椭圆小球藻中的瞬时表达情况。

结果表明，对椭圆小球藻细胞进行酶解处理并形成半原生质体/原生质体后，磁性纳米颗粒可以介导外源EGFP基因转入小球藻中，并能够进行瞬时表达，产生绿色荧光。

关键词：磁性纳米颗粒;增强型绿色荧光蛋白基因（EGFP）;转化;瞬时表达中图分类号：Q785文献标识码：A文章编号：1000-4440（2020）02-0306-06Abstract：Using magnetic nanoparticles as carriers， a new transformation method of Chlorella ellipsoidea was constructed. Nanocarrier technology has been successfully applied to genetic transformation of animals and plants， which is more convenient and efficient than traditional transformation technologies. In this study， magnetic nanoparticles were used to absorb plasmid vector pYBA1132 containing enhanced green fluorescent protein gene （EGFP）， and the nanoparticles-gene complexes were formed. In addition， the protoplasts of Chlorella ellipsoidea were transformed by magnetic force， and the transient expression of EGFP in Chlorella ellipsoidea was observed. After the formation of semi-protoplasts/protoplasts in Chlorella ellipsoidea cells by enzymolysis treatment， the magnetic nanoparticles mediated the transfer of exogenous EGFP gene into Chlorella ellipsoidea， and green fluorescence was detected after transient expression.Key words：magnetic nanoparticles;enhanced green fluorescent protein gene（EGFP）;transformation;transient expression小球藻（Chlorella）作为单细胞真核微藻，是一种重要的微藻资源。

[19]中华人民共和国国家知识产权局[12]发明专利申请公布说明书[11]公开号CN 101457233A [43]公开日2009年6月17日[21]申请号200710179383.3[22]申请日2007.12.12[21]申请号200710179383.3[71]申请人中国科学院遗传与发育生物学研究所地址100101北京市朝阳区大屯路917大楼[72]发明人胡赞民 安洋 赵世民 孙勇如 尹维波陈宇红 胡军 张丽华 [74]专利代理机构中科专利商标代理有限责任公司代理人王旭[51]Int.CI.C12N 15/79 (2006.01)C12N 1/13 (2006.01)C12N 15/53 (2006.01)A23L 1/337 (2006.01)权利要求书 2 页 说明书 26 页 附图 7 页[54]发明名称构建小球藻表达载体、转化小球藻和破壁小球藻的方法[57]摘要本发明利用Ubiquitin启动子和Ω增强子为启动元件，利用硝酸还原酶基因NR构建了适于在小球藻硝酸还原酶缺失突变体中表达外源基因的表达载体。

以椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)硝酸还原酶缺失突变体为受体，采用一种经济、简便的小球藻PEG转化的方法将目的基因转入该突变体中。

优化了转基因小球藻破壁技术，表达的外源基因具有正常的生物活性，并在无抗生素的培养基中稳定遗传。

本发明的结果可应用于采用基因工程技术以椭圆小球藻硝酸还原酶突变体为载体，高效、安全的表达常规的基因工程表达系统(如大肠杆菌和酵母)不适合表达的外源基因。

200710179383.3权 利 要 求 书第1/2页 1.一种用于小球藻硝酸还原酶基因缺失突变体中表达外源基因的表达载体，其是通过将SEQ ID NO：6的NR基因，SEQ ID NO：1的Ubiquitin 启动子和SEQ ID NO：5的Ω序列依次首尾连接克隆入载体质粒的多克隆位点中而获得，其中所述载体质粒适于在小球藻硝酸还原酶基因缺失突变体中表达外源基因。

异养小球藻ARTP诱变育种试验研究作者：***来源：《食品安全导刊·下》2024年第07期摘要：对异养小球藻进行常压室温等离子体（Atmospheric and Room Temperature Plasma，ARTP）诱变确定最佳诱变条件，在最佳诱变条件下筛选突变株，并开展突变株的摇瓶培养再验证试验、遗传稳定性试验、50 L发酵罐试验。

结果表明，异养小球藻的最佳致死时间为50 s；得到6株突变株，且其细胞数多于出发菌株、质量浓度明显高于出发菌株；突变性能可以稳定遗传，突变株可提前24 h到达发酵终点，发酵液中油脂产量高于出发菌株。

关键词：异养小球藻；常压室温等离子体；诱变育种Abstract： The mutation of Heterotrophic Chlorella using atmospheric and room temperature plasma method was performed to determine the optimal mutagenesis conditions， the mutant strains were screened under the optimal mutagenesis conditions， and the mutant strains were re-verified by shaking flask culture test， genetic stability test and 50 L fermenter test. The results showed that the optimal lethal time of Heterotrophic chlorella was 50 s. Six mutant strains were obtained， and their cell number and mass concentration were significantly higher than that of the original strain. The mutant strain could reach the end of fermentation 24 h in advance， and the oil yield in fermentation liquor was higher than that of the original strain.Keywords： Heterotrophic chlorella; atmospheric and room temperature plasma; mutation breeding能源问题与环境问题是当今世界面临的重大难题。

酶解小球藻蛋白制备多肽的工艺研究钟秋平，林美芳，戴梓茹，李慧林【摘要】以钦州湾小球藻为原料，通过单因素和正交试验探讨酶解法制备多肽的最佳工艺。

实验结果表明：酶解小球藻蛋白制备多肽的最佳工艺条件为：pH 6.5，酶解温度30℃，酶解时间20 min，料液比1∶100 g/mL。

此时多肽得率为15.538%±0.2%。

【期刊名称】食品研究与开发【年(卷),期】2014(000)006【总页数】3【关键词】小球藻；多肽；酶解小球藻（Chlorella spp.）是一类普生性单细胞绿藻，属于绿藻门（Chlorophyta），绿藻纲（Chlorophyceae），绿藻目（Chlorococcales），卵囊藻科（Oocystaceae），小球藻属（Chlorella pyrenoidosa）[1-2]。

通常蛋白质含量较高（55%～67%），有较多的糖类（15%～10%），并含有具有生物活性的藻多糖、植物生长因子、（Chlorella Growth Factors，CGF）、糖蛋白、糖脂蛋白、膳食纤维等[3]。

利用酶解法制备生物活性肽，不仅可以提高蛋白质的溶解性，降低小球藻中的不良腥味等负面影响，而且营养成分缺失少，蛋白质水解产生的肽具有易消化吸收和一些蛋白质无法比拟的物理化学特性，因而酶解法成了微藻功能成分的研究、保健食品的开发的一个新热点[4]。

山西医科大学证实小球藻具有降低动物血铅和肝铅蓄积的作用，日本等国的动物和临床试验证实小球藻还具有一定的降血压、防便秘、提高机体免疫力等作用[5]，近年来的研究发现，人类摄取蛋白质经消化酶作用后，并非主要以氨基酸的形式吸收，而是以肽的形式吸收。

目前已有从大豆、玉米、鱼、和其他微藻蛋白的水解物中成功提取具有生理活性的多肽的报道[6]，但对富含蛋白质的小球藻加工制备生物活性多肽的工艺相关的报道还较少。

在前期有关研究的基础上，本研究以钦州港小球藻为原料，对酶解工艺中的多个影响因素进行研究，优化确定小球藻蛋白制备多肽的工艺参数，这对于充分开发利用小球藻中的蛋白质资源、多肽的生理活性研究以及进一步开发功能食品具有重要意义。

藻胆蛋白ApcE缺失突变体的自催化重组研究藻胆蛋白ApcE缺失突变体的自催化重组研究采用聚合酶链式反应(PCR)扩增出Anabaena.sp PCC7120别藻蓝蛋白ApcE(1-240)的一系列缺失突变体基因: apcE(14-240)、apcE(25-240)、apcE(63-240)、apcE(85-240)、apcE(121-240)、apcE(133-240)、apcE(187-240),在大肠杆菌中高效表达分别获得相对应的缺失突变体蛋白.对上述脱辅基蛋白与藻蓝胆素(PCB)的体外自催化重组进行了研究.结果表明:在含有4 mol/L尿素的磷酸钾缓冲体系中,ApcE(25-240)脱辅基蛋白可与藻蓝胆素体外重组实现共价连接,获得的色素蛋白质具有最大吸收峰(λmax＝656 nm)和荧光发射峰(λmax ＝670 nm),其余6个缺失突变体蛋白仅能与藻蓝胆素非共价连接,不能发生自催化重组.该结果为进一步研究连接多肽ApcE的结构和功能提供了信息,具有重要意义.作者：刁红丽甘春晖周明赵开弘 DIAO Hong-li GAN Chun-hui ZHOU Ming ZHAO Kai-hong 作者单位：刁红丽,DIAO Hong-li(华中科技大学生命科学与技术学院,武汉,430074;武汉理工大学资源与环境工程学院,武汉,430070)甘春晖,周明,GAN Chun-hui,ZHOU Ming(华中科技大学环境科学与工程学院,武汉,430074)赵开弘,ZHAO Kai-hong(华中科技大学生命科学与技术学院,武汉,430074;华中科技大学环境科学与工程学院,武汉,430074) 刊名：武汉理工大学学报ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF WUHAN UNIVERSITY OF TECHNOLOGY 年，卷(期)：2006 28(10) 分类号：Q754 关键词：藻胆体藻蓝胆素 ApcE 缺失突变体体外重组自催化连接。

通过农杆菌介导法将兔防御素NP-1基因导入毛白杨
(P.tomentosa)
赵世民;祖国诚;刘根齐;黄敏仁;徐金相;孙勇如
【期刊名称】《遗传学报：英文版》
【年(卷),期】1999(26)6
【摘要】采用叶盘法将兔防御素NP－1基因导入毛白杨后，经PCR分析、Southern杂交检测与筛选获得了转基因植株。

并经体外抑菌实验表明，转NP－1基因毛白杨植株组织提取物对某些微生物的生长具有明显的抑制作用。

【总页数】4页(P711-714)
【关键词】防御素基因;叶盘法;毛白杨;转基因植株;兔
【作者】赵世民;祖国诚;刘根齐;黄敏仁;徐金相;孙勇如
【作者单位】中国科学院遗传研究所;南京林业大学
【正文语种】中文
【中图分类】S792.117;Q785
【相关文献】
1.利用花粉管通道法将兔防御素NP-1基因导入小麦的研究 [J], 周春江;葛荣朝;赵宝存;黄占景;沈银柱;何聪芬
2.利用农杆菌介导法将PVA-CP基因导入马铃薯品种东农303的研究 [J], 于凤丽;卢翠华;李文斌;石瑛;邬震坤;梁彦涛
3.兔防御素基因NP-1的克隆及其在大肠杆菌中的表达 [J], 秦晓玉;彭章华;董晓;苗
向阳;罗庆苗
4.利用农杆菌介导法将抗虫基因和高赖氨酸蛋白基因导入超级杂交水稻亲本材料1826中 [J], 孔维文;邓仲香;王倩;唐克轩
5.由根癌农杆菌介导向毛白杨导入激素合成基因建立遗传转化系统 [J], 温尚昆;董春海;尹承佾
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集胞藻转抗菌肽基因及硝酸还原酶缺失突变载体构建的研究的开题报告题目：集胞藻转抗菌肽基因及硝酸还原酶缺失突变载体构建的研究研究背景及意义：集胞藻是一种单细胞真核生物，具有广泛的应用价值。

集胞藻发生突变可以产生多种有用的代谢产物，例如抗菌肽和硝酸还原酶等。

抗菌肽是一种具有广谱杀菌作用的肽类分子，对多种细菌和真菌具有杀菌作用，并且不易产生耐药性。

硝酸还原酶是一种重要的代谢酶，参与氧化还原反应和能量代谢等多种生理过程。

通过构建集胞藻转抗菌肽基因和硝酸还原酶缺失突变载体，可以实现对集胞藻的遗传改造和代谢调控，进而生产出更多的有用代谢产物。

此外，研究集胞藻在代谢途径调控方面的机制，也可以为后续相关领域的研究提供理论基础。

研究内容及方法：本研究主要分为以下两个方面：1.构建集胞藻转抗菌肽基因载体：利用分子生物学技术对目的基因进行克隆和重组，构建可稳定遗传的抗菌肽基因表达载体。

并采用转染技术将该载体导入到集胞藻中，通过检测抑菌试验和质谱分析等方法验证藻细胞生产出抗菌肽的效果。

2.构建集胞藻硝酸还原酶缺失突变载体：通过定点突变和重组技术，在集胞藻基因组中实现硝酸还原酶基因的突变，利用质谱技术检测集胞藻代谢产物中硝酸还原酶含量的变化，研究集胞藻硝酸还原途径的代谢调控，并分析突变对集胞藻生长及代谢的影响。

研究预期结果：通过上述研究，预期可以构建稳定的集胞藻抗菌肽基因表达载体和硝酸还原酶缺失突变载体，实现集胞藻对抗菌肽和硝酸还原酶途径的代谢调控。

该研究为后续集胞藻生理代谢途径的调控和利用提供基础，并且有望为生物技术领域提供具有潜力的生物资源。