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流式细胞术检测血小板功能及其临床应用

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流式细胞术及其应用(1)

流式细胞术及其应用(1)

血小板检测指标：
质膜糖蛋白：CD41/CD61（gpⅡb/Ⅲa）、
CD42b(GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ)
颗粒膜糖蛋白：CD62P、CD63、TSP。
活化：gpⅡb/Ⅲa复合物—活化早期标志物
CD62P—活化后期的表面标志
血小ห้องสมุดไป่ตู้抗体（PAIgG）。
网织血小板计数：常用染料为TO。
应用 血小板无力症诊断：
而现代流式细胞术，更是由于结合 了单克隆抗体技术、定量细胞化学和定 量荧光细胞化学的应用，使其在生物学、 临床医学、药物学等众多研究领域的应 用将会越来越广泛。
五、流式样品的制备中应注意的几个问题
㈠荧光素和抗体的选择
⒈荧光素的选择：现在国内引进的大多数流式 细胞仪只装有一个激光光源，即488nm光源，所以 我们在选择荧光素时要选择能被488nm激光激发的 荧光素，常用的荧光素有：
选择纯度高的抗体、用同型对照抗 体或双标记排除非特异荧光
在细胞生长状态良好时测试、避 免反复吹打
彻底消化、在用酒精固定细胞时 加入终浓度为1.5-3％的小牛血清
一、 流式细胞术的概念
流式细胞术（FCM）就是对在高速 流动的鞘液包括下的细胞、粒子进行分 析和分选的技术，这种细胞或粒子是经 过特异荧光标记的。其特点是测量速度 快，每秒钟能测数千个乃至上万个细胞， 且可进行多参数测量，另一特点是在分 析的同时可把具有指定特征的细胞分离 出来，这就是分选技术。
FCM(Flow Cytomytry 流式细胞术)
流式样品制备过程中常见的问题及解决对策
常见问题
原因
解决对策
细胞密度低 制备过程中细胞损失 增加离心时间、吸弃上清
非特异荧光强 碎片多
细胞聚集
荧光弱

流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)检测血小板功能及其临床应用

流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)检测血小板功能及其临床应用

流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）检测血小板功能及其临床应用血小板功能的检测包括测定血小板粘附、聚集和活化的能力。

然而，在血小板相关疾病的诊断中，检测血小板功能的方法常常是有争议的。

这通常是由于方法本身的原因造成的［1］，譬如，静脉阻滞、抗凝剂选择、离心，甚至标本处理不当等因素，都可导致医源性血小板激活，影响临床诊断的价值。

这就要求建立一种灵敏、精确、快速、简便，最好可用于临床常规检测血小板功能测定方法。

关键词：血小板临床应用流式细胞术血小板功能的检测包括测定血小板粘附、聚集和活化的能力。

然而，在血小板相关疾病的诊断中，检测血小板功能的方法常常是有争议的。

这通常是由于方法本身的原因造成的［1］，譬如，静脉阻滞、抗凝剂选择、离心，甚至标本处理不当等因素，都可导致医源性血小板激活，影响临床诊断的价值。

这就要求建立一种灵敏、精确、快速、简便，最好可用于临床常规检测血小板功能测定方法。

由于血小板的活化程度可由血小板膜糖蛋白表达水平的高低来判断，近年来，文献报道利用流式细胞术，特别是全血法流式细胞术，检测血小板膜糖蛋白的表达［2］。

该技术能灵敏、特异地检测血液中活化血小板，并评价其功能。

现就全血法流式细胞术检测血小板功能的方法及临床应用现状和潜力进行综述。

一、全血法流式细胞术1.方法学：流式细胞仪能快速测定大量个体细胞的特性。

样品中欲分析的细胞预先进行荧光标记，然后由压缩氮经硅管送达标本室，再以5 000～10 000个细胞/秒的速率逐个射入光敏感区。

在适当波长的激发光作用下，被特殊染色的细胞发射出一定量的荧光脉冲讯号。

探测器收集每个细胞的荧光讯号和光散射，然后传入计算机进行分析。

传统的流式细胞术检测血小板膜糖蛋白的表达，常用的样本是经洗涤的血小板或富含血小板的血浆。

由于血小板极易活化激惹，样本经离心、洗涤等步骤，容易人为地导致体外血小板激活，影响临床诊断价值。

为此，Shatti等［2］引入了全血法流式细胞术。

各类血小板功能检测的临床意义

各类血小板功能检测的临床意义

显微镜计数法
通过人工显微镜观察血液样本，计数血小板数 量。
其他方法
如流式细胞术、电镜技术等，用于特殊情况下或进一步研究。
血小板计数检测的临床意义
诊断出血性疾病
血小板计数是诊断出血性疾病的 重要指标，如特发性血小板减少 性紫癜、血栓性疾病等。
监测抗凝治疗
对于接受抗凝治疗的患者，定期 检测血小板计数有助于评估治疗 效果和调整治疗方案。
通过检测血小板表面的活化标记物， 了解血小板活性状态。
血小板功能检测的临床应用
诊断血栓性疾病
通过对血小板功能的检测，有助于诊 断血栓性疾病，如动脉粥样硬化、心 肌梗死、脑卒中等。
评估心血管疾病风险
通过检测血小板功能，可以评估个体 发生心血管疾病的风险，为预防和治 疗提供依据。监测抗血小板药物治疗效果来自血小板活化检测的临床意义
诊断血栓性疾病
01
血小板活化是血栓形成的关键步骤，通过检测血小板活化程度
有助于诊断血栓性疾病，如心肌梗死、脑梗死等。
评估抗血小板治疗效果
02
对于接受抗血小板治疗的患者，检测血小板活化程度有助于评
估治疗效果，指导治疗方案调整。
预测心血管事件风险
03
血小板活化程度与心血管事件风险密切相关，通过检测血小板
活化程度有助于预测患者发生心血管事件的风险。
血小板活化检测的注意事项
01
02
03
标本采集和处理
采集血液标本时应避免过 度挤压和抗凝剂不足，防 止血小板活化和聚集。
检测方法选择
不同检测方法对血小板活 化的敏感性和特异性存在 差异，应根据具体情况选 择合适的检测方法。
结果解读
结合患者临床表现和其他 检查结果综合分析血小板 活化检测结果，避免误诊 和漏诊。

流式细胞术在血小板检测中的应用于方法介绍

流式细胞术在血小板检测中的应用于方法介绍

47
Flow Cytometry
June 2000
血小板的活化、荧光染色与流式细胞仪分析
前言 血小板活化试验，对于血小板功能、心血管疾病的研究，有重要意义。使用流式细 胞仪进行多参数分析，可以特异灵敏地检测血小板表面标记，了解血小板的活化状态和 反应性，并同时获得更多关于血小板的信息。在疾病监测、抗血小板治疗病人的筛选及 治疗监测、预测并发症等方面有良好的应用前景。 使用推荐的三色流式分析方法检测血小板活化的优点是： 检测血小板的反应性。 了解血小板活化进程。血小板先发生膜糖蛋白变化，然后是胞浆内颗粒释放到 血小板外。 同时检测多种血小板表面标志。 高度灵敏。 直接检测血小板的多种标志。 使用全血，标本量少。 操作简便快捷，将血小板人工激活减至最低。
51
Flow Cytometry
June 2000
附：BDIS 血小板活化试剂
BD 抗体： CD PAC-1 CD62P CD61 Isotype 1 CaliBRITE 3 Ig Subclass IgM IgG1 IgG1 Form FITC PE PerCP PE Unlabeled,FITC,PE,PerCP Catalog No. 340507 348107 340506 340013 340486 Tests 50 100 50 25g 25
流式细胞仪检测全血中血小板功能状态 全血中血小板更接近生理状态 操作简便，减少由于操作造成的血小板状态改变（如血小板活化试验） 同时检测血小板的多个标志物，结合 FSC 和 SSC，评估多个参数，进行定量分析 多采用血小板特异抗体 CD41 或 CD61 画门，找出血小板，避免杂质碎片的干扰 检测血小板亚群灵敏度高 用血量少 无放射性污染

FCM(流式细胞术检测)原理及临床应用

FCM(流式细胞术检测)原理及临床应用
流式细胞术的概念
流式细胞术(flow cytometry FCM)是利用流式细 胞仪对单个生物颗粒(红细胞、白细胞、各类组织细 胞、血小板、微生物等)以及人工合成微球的物理和 生物学特性进行多参数定量分析，并能对特定细胞 群体加以分选的分析技术。
FCM的工作原理
流式细胞仪组成：
1.液流系统 2.光学系统 3.数据处理系统
双标记或多标记分析：目前使用的流式细胞仪 能用一个激光束激发检测三色甚至四色荧光信 号。检测时需注意荧光补偿。
常用免疫荧光染料组合
荧光染料 FITC+PE
激发波长 （nm）
488
发射波长（nm） 525、575
颜色 绿色、橙色
FITC+PeCy5
488
525、675
绿色、红色
FITC+ECD
488
实体瘤以多倍体居多；
G0 期：DNA 合成静止期 G1 期：DNA 合成前期 S 期： DNA 合成期 G2 期：DNA 合成后期 M 期： 细胞分裂期
DNA 倍体 2N 2N
2N-4N 4N 4N
DNA非2倍体出现是鉴别良性与恶性肿瘤的特异性指 标:
良性肿瘤和正常组织良性增生不出现DNA非2倍体细 胞而恶性肿瘤常可出现异倍体细胞；
过去认为 FCM测定残存白血病细胞不可靠， 因为现用的 McAb不能鉴别正常血细胞与白血 病细胞。虽然至今尚未发现白血病细胞特异抗 原，但近来有人提出根据白血病细胞的以下特 征， FCM检测的敏感度可明显提高
白血病细胞的某些抗原表达量明显高于相应 的正常血细胞
如小儿ALL，其CDl0+细胞的荧光强度可 高达3-4个对数值，而其 CD45则为弱阳性或 阴性。
525、625

流式细胞术与三种活化血小板检测方法的比较

流式细胞术与三种活化血小板检测方法的比较
2. 在血样放置 1 h及 2 h后 ,同样用 3 种方法对正常组 和脑梗死组的活化血小板 ( CD62p , CD63)的表达情况进行 检测 ,结果 (表 3, 4) 。
表 3 血样放置 1 h及 2 h后正常组和脑梗死组活化
血小板 CD62p的表达情况 ( % , x ±s)
组别 例数 正常组 30 脑梗死组 30
表 2 3种方法检测正常组和脑梗死组采血半小时内
血小板 CD63的表达 ( % , x ±s)
组别 正常组 脑梗死组
例数 30 30
内固定法 传统血浆法 2192 ±1121 3134 ±1162 7169 ±2112 8151 ±3101
全血法 3120 ±1129 8133 ±3121
从表 2可以看出 , 3 种方法测得的 CD63 结果脑梗死组 均显著高于正常组 ( P均 < 0101) ;组内比较得到 ,内固定法 所得 CD63结果要显著低于传统血浆法和全血法 ( P 均 < 0105) ,而后两者之间差异无统计学意义 ( P > 0105) 。
5 王建中 ,孙芾 ,王淑娟 ,等. 流式细胞术检测活化血小板. 中华医 学杂志 , 1994, 17: 2322235.
6 尚明谦 ,郭述苏 ,陈同慧 ,等. 脑梗死患者血小板膜糖蛋白 CD41, CD62P, CD63的监测. 中风与神经疾病杂志 , 1997, 14: 11213. (收稿日期 : 2005205228) (本文编辑 :袁桂清 )
一 、对象和方法 11对象 : (1)正常组 30名 (男 18名 ,女 12名 )平均年龄 43岁 。均为体检合格 ,抽血前至少两周未用过任何药物的 健康者 。 (2)脑梗死组 30 名 (男 20 名 ,女 10 名 )平均年龄 62岁 。所有病例均为首诊患者 ,均经 CT和 MR I显像证实 , 诊断时症状 、体征已持续 5 h以上 。 ( 3)血标本采集在患者 入院后 ,未经任何治疗立即抽取 。 21试 剂 : ( 1 ) 抗 体 : CD62P2F ITC, CD632PE, IgG12F ITC, IgG12PE均购自法国 Immunotech公司 。 ( 2)仪器 : EP ICS2XL 型流式细胞仪 ,美国 Coulter公司 。 31方法 : (1)标本采集及处理 :空腹取血 ,第一管做其他 检查 ,第二管采集于 116 m l 血于含 3%多聚甲醛 ( PFA )和 318%枸橼酸钠的负压抗凝管 ( PFA 的终浓度为 1% )及普通 的 1∶4枸橼酸钠抗凝管中 。 ( 2 )富血小板血浆 ( PRP)的制 备 :将抗凝全血以 1 000 r/m in离心 5 m in,可得 PRP。 (3)内 固定法 :将上述固定抗凝管中的全血分离出 PRP,取 200 μl PRP,用磷酸盐缓冲液 ( PBS)洗涤后 ,加 015 m l PBS重悬 ,取 20μl标本和 10μl荧光标记单抗混合室温孵育 20 m in后 , 用 PBS洗涤一次后 ,加入 015 m l PBS重悬 ,上机分析 。 ( 4) 传统血浆法 :将普通 1 ∶4枸橼酸钠抗凝全血分离出 PRP,取 200μl PRP,加入等量 2% PFA固定 20 m in后 ,洗涤 ,重悬 ,标 记同内固定法 。 (5)全血法 :参考文献 [ 3 ]。取普通 1 ∶4 枸 橼酸钠抗凝全血 5μl加入 10μl荧光标记单抗 ,室温孵育 20 m in后 ,加入 1% PFA固定 20 m in,洗涤一次后 ,用 PBS重悬 , 上机分析 。 (6)流式细胞仪分析 : 以 Flowcheck荧光微球检 查仪器光路 、流路 ,调整颜色补偿 ,测定标本 。3种方法均用 CD41 / sslog散点图设门 ,流速控制在 100 ～200 s,每份标本 测定 5 000～10 000个血小板 。

现代流式细胞术的临床应用与发展


１２ 感染及 其 治疗 效果 观 察 由于 Ｔ淋 巴细 胞 在 ．
人体免疫系统中承担着重要的功能， 因此 ， 当感染发 生时， Ｔ淋 巴细胞各亚群的变化往往 能很敏感地反
映感染的状态与程度。例如， 人类获得性免疫缺陷 病毒（ Ｖ） ＨＩ 主要侵袭 Ｃ ４ Ｄ Ｔ细胞而导致 Ｃ ４ 巴 Ｄ 淋 细胞减少 ， Ｉ ／ Ｄ 淋 巴细胞 比值 下降， Ｃ） Ｃ ８ ４ 甚至可降
其分选出来， 以便于进一步培养与研究。目前， 该技
术 已经广泛用于基础研究与临床应用， 在免疫学、 遗 传学、 血液学 、 肿瘤学等领域内发挥着重要作用。 １ 细胞免疫学中的应用
１１ 淋 巴细胞亚群分析 在免疫应答过程中， ． 末梢 血淋巴细胞发育成 为功能不同的亚群， 各亚群的数 量和功能发生异常 时， 就能导致机体免疫紊乱并产 生病理变化。Ｆ Ｍ 通过荧光抗原抗体检测技术对 Ｃ 种或几种淋巴细胞表面抗原进行检测， 从而进行 细胞分类及亚群分析。同时计算 出它们相互间的比
具有更好的单色性与激发效率， 因而大大提 高了检 测灵敏度 ， 同时将 固定的标本台改为流动的单细胞 悬液， 用计算机进行数据处理， 因而大大提高了检测 速度与统计精确性， 而且从同一个细胞 中可以同时 测得多种参数， 为生物 医学与临床检验学发 展提供
Ｃ４ Ｄ 细胞数增 加， Ｄ ／ Ｄ Ｃ ４Ｃ ８比值升高。当病毒 （ 如 乙肝病毒 、Ｂ病毒和 巨细胞包涵体病毒 ） Ｅ 感染发 生 时， Ｄ Ｔ细胞增多， Ｃ ８ Ｃ８ 对 Ｄ 细胞 的测定有助于对
感染的诊断和对治疗效果的动态观察。 目前 ， Ｃ Ｆ Ｍ 用的各种单克隆抗体试剂 已经发 展了百余种 ， 可对 各种血细胞和组织细胞的表型进行测定分析 。 １３ 其 它免疫 功 能性 疾 病 分 析・ 系统 性 红 斑 狼 疮 ．

流式细胞术原理及临床应用-PPT文档


FCM检测白血病微小残留病变(MRD):
MRD 是 白 血 病 复 发 的 主 要 根 源 ， FCM 的 高 特 异性和敏感性可以在患者缓解期检测是否有残 留病变细胞，早期探测MRD，以免复发
FCM在临床肿瘤学中的应用
1.血液标本的检查 ● 肿瘤患者的免疫功能检查 ● 肿瘤患者的粘附分子检查：在肿瘤的浸润与转
细胞凋亡的生物学意义
胚胎形成、肌体正常发 育、衰老和损伤细胞的清 除以及肿瘤的发生、发展 和转归等都与细胞凋亡有 关。
生物医学的研究热点
FCM在血栓性疾与止血中应用
由于活化血小板是血栓的主要
成分之一，血小板活化程度的增 高与疾病的发生发展有关。 利用 流式细胞仪可检测血小板活化指 标，了解血小板状态和活化进程 。 巨血小板 血小板无力症 网织血 小板
肿瘤细胞耐药性
MDR是由多药耐药基因编码的P糖蛋白（P-gp） 亲脂化合物，包括多种抗癌药物和荧光染料的跨膜性 排出泵。当淋巴细胞出现MDR阳性细胞时，患者对 化疗药物开始出现耐
细胞凋亡是由基因控制的细胞自主的有序 的死亡。它涉及一系列基因的激活、表达以及调 控等的作用；是为更好地适应生存环境而主动争 取的一种死亡过程。 坏死（necrosis）：坏死是细胞受到强烈理化或 生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程。表 现为细胞胀大，胞膜破裂，细胞内容物外溢，核 变化较慢，DNA 降解不充分，引起局部严重的 炎症反应
可用流式细胞仪分析的标本
外周血、骨髓、癌组织、癌旁组织、各种体液 （尿、脑脊液、胸腹水、肺泡灌洗液等）
单细胞生物、特殊处理的植物细胞、某些非细胞 粒子、可溶性分子
流式细胞仪的基本功能
•细胞表型分析：包括细胞膜、胞浆内蛋白表达及核膜成份分析 •DNA含量及细胞周期分析、细胞凋亡检测 •目标细胞分选 •自身免疫性疾病相关HLA抗原分析、自身抗体的检测 •流式蛋白定量技术：血浆中各种细胞因子的含量

流式细胞术临床应用

流式细胞术的临床应用一、在肿瘤学中的应用这是FCM在临床医学中应用最早的一个领域。

首先需要把实体瘤组织解聚、分散制备成单细胞悬液，用荧光染料(碘化吡啶PI)染色后对细胞的DNA含量进行分析，PI可以与细胞内DNA和RNA结合，采用RNA抑制剂将RNA消化后，通过流式细胞术检测到的与DNA结合的PI的荧光强度直接反映了细胞内DNA含量的多少。

由于细胞周期各时相的DNA含量不同，通常正常细胞的G1 / GO期具有二倍体细胞的DNA含量((2 N)，而G2/ M期具有四倍体细胞的DNA含量((4 N)，而S期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。

因此，通过流式细胞术PI 染色法对细胞内DNA含量进行检测时，可以将细胞周期各时相区分为G1 / GO 期，S期和G2/ M期，并可通过特殊软件计算各时相的百分率，DNA含量直接代表细胞的倍体状态，非倍体细胞与肿瘤恶性程度有关。

1、发现癌前病变，协助肿瘤早期诊断人体正常组织发生癌变要经过一个由量变到质变的漫长过程，而癌前细胞即处于量变过程中向癌细胞转化阶段。

人体正常的体细胞均具有比较稳定的DNA二倍体含量。

当人体发生癌变或具有恶性潜能的癌前病变时，在其发生、发展过程中可伴随细胞DNA含量的异常改变，FCM可精确定量DNA含量的改变，作为诊断癌前病变发展至癌变中的一个有价值的标志，能对癌前病变的性质及发展趋势作出估价，有助于癌变的早期诊断。

有资料证实，癌前病变的癌变发生率与细胞不典型增生程度有密切关系，增生程度越重，癌变发生率越高。

随着细胞不典型增生程度的加重，DNA非整倍体出现率增高，这是癌变的一个重要标志。

2、在肿瘤的诊断、预后判断和治疗中的作用FCM在肿瘤诊断中的重要作用已经被认可，DNA非整倍体细胞峰的存在可为肿瘤诊断提供有力的依据，FCM分析病理细胞具有速度快、信息量大，敏感度高等优点，已被用在常规工作中。

肿瘤细胞DNA倍体分析对病人预后的判断有重要作用，异倍体肿瘤恶性病变的复发率高、转移率高、死亡率也高，而二倍体及近二倍体肿瘤的预后则较好。

流式细胞术在成熟淋巴细胞肿瘤诊断中的应用

流式细胞术在成熟淋巴细胞肿瘤诊 断中的应用
01 引言
03 参考内容
目录
02 实验方法
引言
流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种在医学领域中广泛应用的技术， 具有高效、快速、敏感等优点。它通过将细胞悬浮在流水中，并利用特定的抗体 对细胞进行标记，从而对细胞进行种类、功能等方面的分析和检测。在淋巴细胞 肿瘤诊断中，流式细胞术能够通过对成熟淋巴细胞的表面标志物进行检测，为临 床提供更准确、更快速的诊断结果。
参考内容三
流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种在液流中快速检测细胞特性的 技术。它已经成为免疫学研究中的重要工具，并被广泛应用于免疫细胞的分型、 功能和活性测量。
1、细胞分型：流式细胞术可以用来对免疫细胞进行精细的分型。通过使用 不同的抗体标记，可以识别和区分各种类型的淋巴细胞，如T细胞、B细胞、NK细 胞等。同时，对于细胞亚群的识别和计数，流式细胞术也具有高灵敏度和高精度 性。
4、疾病诊断：流式细胞术在免疫学中的应用也扩展到了临床诊断。例如， 流式细胞术可以用来检测自身免疫疾病、癌症和感染等疾病中的异常免疫反应。
5、疫苗开发：流式细胞术可以帮助科学家们研究免疫反应的机制，从而为 疫苗开发提供重要的信息。例如，通过流式细胞术，科学家们可以跟踪疫苗接种 后免疫细胞的反应，以便优化疫苗设计和接种方案。
1、免疫分型：流式细胞术能够通过对细胞表面抗原的检测，对淋巴细胞、 白血病、骨髓瘤等免疫相关疾病进行分型和诊断。例如，通过检测T细胞亚群的 分布和功能，可以对自身免疫性疾病、感染性疾病等进行诊断和鉴别诊断。
2、感染诊断：流式细胞术能够快速准确地检测病毒、细菌和其他微生物等 感染引起的特异性免疫反应。例如，通过检测抗原特异性抗体水平，可以快速诊 断流感、肺炎等感染性疾病。
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由于血小板的活化程度可由血小板 酶作外源激动剂时 ,为防止血小板聚集
膜糖蛋白表达水平的高低来判断 ,近年 并形成纤维蛋白凝块 ,可在全血标本中
来 ,文献报道利用流式细胞术 ,特别是全 加 入 四 肽 化 合 物 Gly2Pro2Arg2Pro
血法流式细胞术 ,检测血小板膜糖蛋白 ( GPRP) [3] 。固定这一步若不干扰单抗
它仅在血小板活化时才因构象变化而显 活化血小板检测的一些代表性单抗 。
21 血小板缺陷性疾病 :全血法流式
露出来 。因此 ,使用这个表位的荧光单 抗 ,我们能更精确地在更早阶段检测到
三 、诊断学意义及临床应用
细胞术提供了一个简单 、迅速的方法来
利用全血法流式细胞术检测上述血 诊断血小板膜糖蛋白缺陷性疾病 ,如巨
号 。探测器收集每个细胞的荧光讯号和 的百分率 。阳性血小板百分率法与荧光
光散射 ,然后传入计算机进行分析 。 传统的流式细胞术检测血小板膜糖
蛋白的表达 ,常用的样本是经洗涤的血 小板或富含血小板的血浆 。由于血小板 极易活化激惹 , 样本经离心 、洗涤等步 骤 ,容易人为地导致体外血小板激活 ,影 响临床诊断价值 。为此 ,Shatti 等[2] 引入 了全血法流式细胞术 。该技术能使用全 血样本测定循环中血小板的活化状态以 及血小板对激活剂的功能应答 。
抽血抗凝 →稀释 →生物素化的检测
板相关疾病的诊断中 ,检测血小板功能 用单克隆抗体 (单抗) →激动剂或缓冲液
的方法常常是有争议的 。这通常是由于 →固定 (1 %多聚甲醛) →FITC 标记的鉴
方法本身的原因造成的[1] ,譬如 ,静脉阻 别用单抗 →PE2卵白素 →稀释 。
滞 、抗凝剂选择 、离心 ,甚至标本处理不
此外 ,做一次检测仅需 2μl 血液 ,这 一点 ,尤其适合于新生儿和血小板减少 性疾病患者 。本法不使用同位素 ,没有 放射性污染 。
全血 法 流 式 细 胞 术 也 存 在 不 足 之 处 。譬如 ,流式细胞仪价格高昂 ,检测费 用高 ,仪器操作复杂 。为了避免体外活 化 ,血样需在 45 分钟内处理 ,不能久置 。 另外 ,流式细胞仪仅检测循环中的血小 板功能 ,而β2TG、PF4 和 TXA2 的检测还 能反映血管壁上血小板的活化和新近被 清除的血小板 。虽然存在着这些不足 , 但本法仍是血小板功能检测的突破性进 展。
·182 ·
中华医学检验杂志 1999 年 5 月第 22 卷第 3 期 Chin J Med Lab Sci , May1999 , Vol 22 , No. 3
·讲座·
流式细胞术检测血小板功能及其临床应用
李珉珉
血小板功能的检测包括测定血小板
全血流式细胞术样本制备步骤为 :
粘附 、聚集和活化的能力 。然而 ,在血小
·183 ·
二 、全血中活化血小板的检测
表 1 血小板膜上主要的糖蛋白及其功能
11 血小板特异性膜糖蛋白 :本法检 测血小板功能 ,首先要对全血中的血小 板进行特异性荧光标记 ,将血小板与血 样中其他血细胞区分开来 。针对血小板 表面特异性膜糖蛋白制备的单抗 ,使血 小板特异性标记成为可能 。血小板膜糖 蛋白已被深入研究[7] ,表 1 显示了血小 板膜上主要的糖蛋白及其功能 。在这些 膜糖蛋白中 ,仅在血小板膜表面表达主 要有 GP Ⅰb , GP Ⅱb , GP Ⅲa 等有限的几 种[8] 。根据这些特异性糖蛋白制备的荧 光单抗 ,能在全血中特异性地识别血小
患者循环中有活化的血小板 ,血小板活 力也增强 。冠状窦血液的检测表明 ,冠 状血管成形术会导致血小板活化 。如果
物先 天 缺 陷 , 导 致 血 小 板 聚 集 功 能 障 碍[15] 。用全血法流式细胞术分析这些 分子标志物有助于血小板缺陷性疾病 ,
也是有意义的 。
血流恢复后有高水平的活化血小板 ,血
抗 ,一旦弄清这一线性关系 ,并知道荧光 单抗上荧光素与抗体的摩尔比 ,就能利 用流式细胞仪定量分析该抗体结合位点 的绝对数目 。目前有一些商品试剂盒能 定量测 定 结 合 到 单 个 细 胞 上 的 抗 体 数 目 ,但乏见用于血小板的报道 。
21 优缺点 :与常规血小板功能测定 法比 ,全血法流式细胞术有许多优点 。
识别的膜糖蛋白
GPIV GP Ⅱb/ Ⅲa 和 GP Ⅱb GP Ⅰ GP Ⅰ GP Ⅲa P2selectin 或 GMP140 GP53
血小板颗粒膜上的糖蛋白 。血小板被激
活时 ,其颗粒膜与质膜发生融合 ,颗粒膜
31 单抗的选择 :与血小板有关的 CD 依赖性糖尿病 ,子痫前期 ,外周血管疾病
蛋白 ,如 CD62 、CD63 ,在质膜上表达 ,成 单 抗 有 CD9 , CD31 , CD36 , CD41a2b , 等均可测出血小板活力增加和 (或) 循环
一 、全血法流式细胞术
单抗的 荧 光 试 剂 可 在 FITC、PE、PE2CY5
11 方法学 :流式细胞仪能快速测定 3 种荧光染料中任选 。
大量个体细胞的特性 。样品中欲分析的
样本随后用流式细胞仪检测 。通过
细胞预先进行荧光标记 ,然后由压缩氮 荧光极性和特异性光散射鉴别出血小板 经硅管送达标本室 ,再以 5 000～10 000 后 ,检测 5 000～10 000 个血小板表面的 个细胞/ 秒的速率逐个射入光敏感区 。 特异性荧光讯号 。检测结果可用两种方 在适当波长的激发光作用下 ,被特殊染 法表示 。一种是平均颗粒荧光强度 ,另 色的细胞发射出一定量的荧光脉冲讯 一种是特异性荧光抗体结合阳性血小板
活化血小板的分子标志 。第三类是出现 明心肌缺血与血小板活化有关 。全血法 去了分离巨大血小板的步骤 ,使检测更
在活化血小板上能与血小板表面受体相 流式细胞术检测表明心绞痛和心肌梗塞 简便 、精确 。后者由于 GP Ⅱb/ Ⅲa 复合
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结合的一些抗原 ,包括纤维蛋白原 , Xa 因子 和 thrombospondin 等 。这 些 抗 原 在 血小板表面的出现和消失在临床检测上
功能 粘附 粘附 粘附 聚集 粘附 粘附 凝血酶底物 粘附 血小板2粒细胞 相互作用
注 :vWF 血管性假血友病因子 ;Fb 纤维蛋白原 ; Fn 纤维粘连蛋白 ;Vn 体外粘连蛋 ;LRG 富 含亮氨酸家族
板 ,仅给血小板做上荧光标记 。
表 2 活化血小板 CD 单抗简介
21 活化血小板的标志物 :活化血小 板与静息血小板相比 ,其质膜糖蛋白常 发生显著的变化 ,这些变化的糖蛋白便 成为活化血小板的检测标志物 。
全血法流式细胞术也是一种免疫学 方法 ,活化血小板表面能通过免疫方法 检测的标志物可分为三类[9] : 第一类是
CD 单抗 CD36 CD41 CD42a CD42b CD61 CD62 CD63
代表性单抗
5F1 ,CIMeg1 ,ESIVC7 PAC1 ,7E3 ,PBM614 FMC25 ,BL2H6 , GR2P PHN89 ,AN51 , GN287 Y215 ,CLB2thromb/ 1 CLB2thromb/ 6 ,RUU2SP1. 18. 1 RUU2SP2128 ,CLB2gran/ 12
信号的放大倍数无关 ,且可以检测受损 伤部位血小板亚群的变化 。如果检测的 是血小板表面某抗原的总量 ,则荧光强 度法更为适合 。譬如 ,在活化状态下 ,血 小板表面 GPIb2IX2V 复合物含量比静息 时低 ,但降低的幅度小 ,通常还不足以报 告阴性结果[4] ,这时用荧光强度法就比 阳性血小板百分率法更合适 。
为活化血小板的分子标志 。第二类是血 CD42a2d , CD61 , CD62 , CD63 , CD107a2b 中存在活化血小板 ,而早产儿的血小板
小板质 膜 表 面 变 化 的 糖 蛋 白 表 位 。如 等 。活化血小板的检测需选择针对活化 对凝血酶 、二磷酸腺苷 (ADP) 、TXA2 的体 GP Ⅱb/ Ⅲa ( CD41/ 61) 的 PAC1 表位[10] , 血小板标志物的 CD 单抗 。表 2 列举了 外激活能力降低 。
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中华医学检验杂志 1999 年 5 月第 22 卷第 3 期 Chin J Med Lab Sci , May1999 , Vol 22 , No. 3
11 血栓性疾病 :动脉粥样硬化前期 血小板沉积 ,导致心肌梗塞和中风 。抗 血小板药能降低心肌缺血的发生率 ,证
大血小板综合征 ,血小板无力症等 。前 者是由于 GPIb2IX 复合物先天缺陷所致 的血小板形态巨大 ,功能异常的出血性 疾病[14] 。巨大血小板从全血中分离很 困难 。本法能特异性地识别血小板 ,省
的表达[2] 。该技术能灵敏 、特异地检测 的结合 ,生物素化的检测用单抗也可以
血液中活化血小板 ,并评价其功能 。现 在固定后加入 。血小板鉴别用单抗可在
就全血法流式细胞术检测血小板功能的 针对血小板特异性膜糖蛋白 GP Ⅰb , GP
方法及临床应用现状和潜力进行综述 。 Ⅱb , GP Ⅲa 的单抗中任选一种 。标记这
血小板的活化 。另外 , GPIV (CD36) 虽然 在静息血小板上也表达 ,但活化血小板 上 表 达 量 更 高[9] ; GPIb2IX2V 复 合 物 (CD42) 则相反 ,与静息血小板相比 ,活化 血小板上表达量显著降低[7] 。它们都是
小板标志物 ,在许多血小板相关疾病的 诊断上有重要的临床应用价值 。
膜糖蛋白 GP Ⅰa/ Ⅱa GP Ⅰc/ Ⅱa GP Ⅰc/ Ⅱa GP Ⅱb/ Ⅲa Vn 受体 GP Ⅰb/ Ⅸ
GPV GPIV GP53
GMP140
基因家族 整合素 (B1) 整合素 (B1) 整合素 (B1) 整合素 (B3) 整合素 (B3) LRG LRG