密度梯度区带离心和密度梯度离心

生物制药工艺学一、离心技术1. 制备超离心三种转子P3182. 制备超离心三种离心方法P3203. 沉降速度和沉降系数 P328 ①沉降速度：即在离心力作用下，物质粒子于单位时间内沿离心力方向移动的距离。

②沉降系数：即物质粒子在单位离心场中的沉降速度，量纲为秒。

一般所说沉降系数为S 20,w 。

4. 分析超离心的两种方法 P331 Svedberg 方程式：测分子量实质是用不同方法测其沉降速度。

原理测量量沉降速度法根据沉降速度测出沉降系数以推出分子量。

界面位移量与离心时间。

沉降平衡法特定平衡下,离心力与扩散力平衡，液面浓度为0，池底浓度为2c 。

任意两位移处的浓度。

5. 超离心的其他两种应用P334①对生物大分子的均一性估计；②生物分子形状、大小及水合度的判断。

二、膜分离技术1. 各向同性膜与各项异性膜P341①各向同性膜：厚度大，孔隙为圆柱体。

流速低，易堵塞。

②各向异性膜：1）正反两面结构不同：功能层是孔径一定、薄的“皮肤层”，支持层为孔隙大得多、更厚的海绵层；2）喇叭口滤膜，孔隙为圆台形。

2. 截留分子量P343分子量截留值是指阻留率达90%以上的最小被截留物质的分子量。

3. 浓差极化现象P346超滤是在外压作用下进行的。

外源压力迫使分子量较小的溶质通过薄膜，大分子被截留在膜表面，并逐渐形成浓度梯度，产生浓差极化现象。

✘害处：引起流速下降、影响膜的选择透过性。

✔解决方法：振动、搅拌、错流、切流等技术。

4. 五种微孔滤膜P3555. 三种测微孔滤膜孔径的方法P3566. 微孔滤膜的应用P361①mRNA的测定以及纯化：使用硝酸纤维膜吸附与mRNA配对的DNA单链，然后将放射性mRNA样品溶液过膜使目的mRNA与DNA单链配对结合。

最后洗涤游离RNA，并用胰核糖核酸酶处理除去残留RNA。

②环状DNA的纯化环状DNA链打开后，变为一条环状链和一条单链。

用硝酸纤维膜结合单链，而环状链过膜，即可纯化得到环状单链DNA。

超速离心技术超速离心技术是利用物质的沉降系数、浮力、质量等方面的差异，利用强大的离心力场，使样品中的混合物得以分离、浓缩、纯化和鉴定的技术。

离心技术现在已经成为分子生物学和生物化学研究中不可缺少的一项重要技术。

离心技术可分为制备型和分析型两类。

在生物学领域可以利用这种方法，分离提取各种细胞及其亚细胞物质，如细胞膜、细胞核、染色体、线粒体、叶绿体、溶酶体、核蛋白体等。

也可以鉴定蛋白质、酶及核酸的纯度。

处理的样品可多可少，少至0.2mL以下。

离心技术的范围相当广泛。

目前，利用这种技术分离各种亚细胞物质、酶、病毒、质粒及各种核酸。

因此，为分子生物学、生物化学和医学的发展，提供了有利的手段。

自从1926年瑞典物理学家Svedberg制成世界上第一台超速离心机（45000转/分）到现在已有快80年的历史，在这期间，离心机的发展是非常迅速的。

特别是在50年代以后发展的更快，例如，美国贝克曼（Beckman）公司和杜邦苏凡尔（Dupont Sorvall）公司，英国测量科学设备公司（MSE），日本的日立（HITACHI）公司以及德国的海吕斯（Heraeus）公司，都生产出各种离心机产品，如普通离心机、高速离心机和超速离心机。

从简单的低速高容量的制备离心机到用于精密分析的超速离心机，应有尽有。

美国贝克（Beckman）公司的超速离心机居世界领先地位，采用了大规模集成电路，计算机程序控制，分离-检测，全部实现自动化；最高转速可达13多万转/分钟，并配有各种型号的垂直转头、水平转头、固定角转头、区带转头、连续转头等，供用户选用，不但操作简单、节省时间，而且进一步提高了的分离效率。

此外，离心技术也有了很大的发展，有密度梯度离心技术和区带离心技术，为生物大分子的分离、纯化和鉴定提供了优越的手段。

虽然离心机的种类有多种，离心技术也多种多样，但是它们的工作原理基本相似。

在实际工作中用的最多的还是制备型离心。

本课程主要介绍制备型分离技术。

蛋白质的分离纯化方法根据分子大小不同进行分离纯化蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白质和小分子物质分开,并使蛋白质混合物也得到分离。

根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。

透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。

透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行分离。

超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程。

这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。

它们经常和盐析、盐溶方法联合使用,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。

由于超滤过程中,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小。

所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。

当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。

例如,在从大米渣中提取蛋白质的实验中,加入纤维素酶和α-淀粉酶进行预处理后,再用离心的方法将有用物质与分解掉的杂质进行初步分离[3]。

使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度(区带)离心。

常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。

可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度。

密度梯度离心曾用于纯化苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白,得到的产品纯度高但产量偏低。

蒋辰等[6]通过比较不同密度梯度介质的分离效果,利用溴化钠密度梯度得到了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。

凝胶过滤也称凝胶渗透层析,是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一。

凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外,随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外;反之,比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外。

实验室离心机常用的离心方法1.差速离心法：采用不同的离心速度和离心时间，使沉降速度不同的颗粒分步离心的方法，称为差速离心。

操作时，将含有两种不同颗粒的混悬液，以常速离心，使大的颗粒下沉，将上清液倾倒于另一离心管中，再加大离心力，离心一定时间，分离小的颗粒，反复多次分离，达到分离目的。

差速离心主要用于分离大小和密度差异较大的颗粒。

差速离心法的优点是：操作简单，离心后用倾倒法即可将上清液与沉淀分开，并可使用容量较大的角式转子。

2.密度梯度离心法：该法又分为速率区带离心法和等密度区带离心法。

样品在一定惰性梯度介质中进行离心沉淀或沉降平衡，在一定离心力下把颗粒分配到梯度液中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。

该法的优点是：具有很好的分辨率，分离效果好，可一次获得较纯颗粒;适用范围广，既能分离沉淀系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度的颗粒;颗粒不会积压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。

被离心的物质根据其沉降系数不同进行分离，同类物质则因分子大的沉降速度快于分子小的物质从而得到分离。

密度梯度的制备可采用梯混合器，也可将不同浓度的蔗糖溶液，小心地一层层加入离心管中，越靠管底，浓度越高，形成阶梯梯度。

在密度梯度离心过程中，区带的位置和宽度随离心时间的不同而改变。

随离心时间的加长，区带会因颗粒扩散而越来越宽。

3.分析性超速离心法：分析型超速离心机主要由一个椭圆形的转子、一套真空系统和一套光学系统所组成。

该转子通过一个柔性的轴连接成一个高速的驱动装置，此轴可使转子在旋转时形成自己的轴。

转子在一个冷冻的真空腔中旋转，其容纳两个小室：分析室和配衡室。

分析室的容量一般为1mL，呈扇形排列在转子中，其工作原理与一个普通水平转子相同。

分析室有上下两个平面的石英窗，离心机中装有的光学系统可保证在整个离心期间都能观察小室中正在沉降的物质，可以通过对紫外光的吸收或折射率的不同对沉降物进行监测。

密度梯度离心法density gradient centrifugation method，为得到必要的浓度梯度，可采用浓氯化铯溶液，也可以采用蔗糖等一些小分子溶液，预先在分离超离心机的样品地内制备出密度梯度，在其上面再加上一层少量的大分子溶液后，离心，大分子就形成层状而沉降。

不连续密度蔗糖梯度离心液一般可以采用优级纯的蔗糖用超纯水配制成百分比浓度分别为16.1%、37.4%、45%的蔗糖溶液，从离心管底部逐层向上铺设。

也有用8层Feicoll梯度离心,即在14mL离心管中由下至上从84％到35％Feicoll液，按7％递减，各加1．0mL，形成7层Feicoll 梯度。

连续密度蔗糖梯度离心液则需要用专用仪器配制。

密度梯度离心又称速率—区带离心,沉降系数较接近的物质分离的方法；原理：不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。

介质梯度应预先形成，介质的最大密度要小于所有样品颗粒的密度。

常用的有蔗糖、甘油；密度梯度液的制备用梯度混合器，形成由管口到管底逐步升高的密度梯度；操作：离心前将样品小心铺放在密度梯度溶液表面，离心形成区带。

离心后不同大小、不同形状、有一定沉降系数差异的颗粒在密度梯度液中形成若干条界面清楚的不连续区带；可用来分离核酸、蛋白质、核糖体亚基及其它成分〔1〕亦称平衡密度梯度离心法。

用超离心机对小分子物质溶液，长时间加一个离心力场达到沉降平衡，在沉降池内从液面到底部出现一定的密度梯度。

若在该溶液里加入少量大分子溶液，则溶液内比溶剂密度大的部分就产生大分子沉降，比溶剂密度小的部分就会上浮，最后在重力和浮力平衡的位置，集聚形成大分子带状物。

利用这种现象，测定核酸或蛋白质等的浮游密度，或根据其差别进行分析的一种沉降平衡法。

自1958年米西尔逊（M．Meselson），斯塔尔（F．W．Stahl），维诺格拉德（J．Vinograd）成功地分离了〔15N〕DNA和〔14N〕DNA 以来，该法取得许多成果。

离心技术在生物科学，特别是在生物化学和分子生物学研究领域，已得到十分广泛的应用，每个生物化学和分子生物学实验室都要装备多种型式的离心机。

离心技术主要用于各种生物样品的分离和制备，生物样品悬浮液在高速旋转下，由于巨大的离心力作用，使悬浮的微小颗粒（细胞器、生物大分子的沉淀等）以一定的速度沉降，从而与溶液得以分离，而沉降速度取决于颗粒的质量、大小和密度。

基本原理当一个粒子（生物大分子或细胞器）在高速旋转下受到离心力作用时，此离心力“F”由下式定义，即：F = m•a = m•ω2 ra —粒子旋转的加速度，m —沉降粒子的有效质量，ω—粒子旋转的角速度，r—粒子的旋转半径( cm )。

通常离心力常用地球引力的倍数来表示，因而称为相对离心力“RCF ”。

或者用数字乘“g”来表示，例如25000×g，则表示相对离心力为25000。

相对离心力是指在离心场中，作用于颗粒的离心力相当于地球重力的倍数，单位是重力加速度“g”（980cm/sec2），此时“RCF”相对离心力可用下式计算：∴RCF = 1.119×10－5×(rpm)2 r( rpm —revolutions per minute每分钟转数，r/min )由上式可见，只要给出旋转半径r，则RCF和rpm之间可以相互换算。

但是由于转头的形状及结构的差异，使每台离心机的离心管，从管口至管底的各点与旋转轴之间的距离是不一样的，所以在计算是规定旋转半径均用平均半径“ra v”代替：ra v=( r min＋rmax) / 2一般情况下，低速离心时常以转速“rpm”来表示，高速离心时则以“g”表示。

计算颗粒的相对离心力时，应注意离心管与旋转轴中心的距离“r”不同，即沉降颗粒在离心管中所处位置不同，则所受离心力也不同。

因此在报告超离心条件时，通常总是用地心引力的倍数“×g”代替每分钟转数“rpm”，因为它可以真实地反映颗粒在离心管内不同位置的离心力及其动态变化。

试验室离心机离心方法试验室离心机操作规程试验室离心机分别方法不一，适用场合也不尽相同。

目前主流的离心分别方法紧要是差速离心法和区带离心法，其实在试验室离心技术制备超离心法一文中有提及两种离心方法，今日笔者对这两种方法的原理及应用介绍进试验室离心机分别方法不一，适用场合也不尽相同。

目前主流的离心分别方法紧要是差速离心法和区带离心法，其实在试验室离心技术制备超离心法一文中有提及两种离心方法，今日笔者对这两种方法的原理及应用介绍进行补充和完善。

1. 差速离心法：很多具有生物活性的生物大分子和亚细胞器是不稳定的，需要低温高速离心，常用的是差速离心法。

通过离心后倒出上清液和沉淀分开，把分别出来的上清液再增大转速离心，分别出第二部分沉淀，这样不断增大转速，逐级分别出所需要的物质。

利用这种方法可以有效地分别大小上差别较大的颗粒，但不能分别大小相像的颗粒，而且所分别出来的组分往往是不均一的，杂有其他种类的颗粒。

2.区带离心法：其中又可以分为两种：速率区带离心和等密度速率区带离心。

1）速率区带离心法：这是将小量悬液放在一平缓的密度梯度液上，用此梯度液来稳定颗粒的沉降。

由于离心，颗粒离开起始区带而移动，移动的速度是由颗粒的大小、形状和它们所受试验室离心机的离心力来决议的。

离心一段时间历，各种颖粒将依照它们的相对速度移动而各个分开，成为一系列区带。

用这种方法我们可以将沉降速度差为20%或者更大的颗粒。

2）等密度区带离心法：这是将要分别的颗粒悬液放至密度梯度液上，或者实际上将颗粒溶于制作梯度的溶液中。

通过离心，颗粒或者上浮或者下沉，达到与它们本身密度相同的液体处在这里它们没有重量，不管离心多长时间，它们再也不移动了。

这些颗粒可成为一系列区带，每种颗粒在它本身的密度区。

所以，这是一种利用颗粒浮密度的大小分别颗粒大小的方法。

使用的介质通常是氯化铯（Cscl）和硫酸铯（Cs2SO4）。

前者适合于DNA分别，后者适合于RNA分别。

差速离心,速度区带离心,密度梯度离心离心分离是一种常见的分离技术，它基于物质之间的物理属性差异，将混合液体或悬浮物分离成不同的组分。

离心分离可以根据分离速度的不同分为差速离心、速度区带离心和密度梯度离心三种方式。

1. 差速离心差速离心是一种迅速和有效的离心分离方法，它可以通过离心机旋转加速获得足够的离心力，从而分离出不同密度、不同大小、不同化学成分的混合物。

差速离心的分离原理是利用分子量和分子形状不同的物质在离心力作用下趋向不同的方向进行分离。

差速离心常被应用于实验室规模的研究，以分离组织、细胞、剪切力敏感蛋白质和多肽等。

2. 速度区带离心速度区带离心也称为漏斗离心或连续流离心。

它是一种借助高速旋转离心机和漏斗边缘速度不同的离心介质实现分离的方法。

速度区带离心的分离原理是利用离心机旋转时的径向力和切向力相互作用产生的离心力，在一个狭窄的速度区域内对样品进行分离。

速度区带离心分离效率高，可以分离出比差速离心更小的粒子。

常被应用于分离DNA、 RNA、病毒和细胞等生物样品。

3. 密度梯度离心密度梯度离心是一种以离心介质密度梯度作为分离样品的基础，通过离心机旋转达到不同密度的物质在不同离心力作用下沉降速度不同的离心分离方法。

密度梯度离心可用于区分不同大小和密度的生物组分和非生物组分，并经常用于表征单元的结构和组成，如肌肉和细胞骨架的微丝和中间纤维。

它也是提取和纯化生物化学分子和颗粒的有效方法，如蛋白质、 RNA、 DNA、病毒、叶绿体等。

以上三种离心分离技术各有优缺点，选择合适的离心分离方法应在考虑分离效率、分离效果、操作简便性、样品数量、实验条件等方面综合考虑。

在离心分离过程中，还需要注意离心机设备的选择、用量以及分离后的后续处理，才能发挥最大效益。

超速离心技术超速离心技术是利用物质的沉降系数、浮力、质量等方面的差异，利用强大的离心力场，使样品中的混合物得以分离、浓缩、纯化和鉴定的技术。

离心技术现在已经成为分子生物学和生物化学研究中不可缺少的一项重要技术。

离心技术可分为制备型和分析型两类。

在生物学领域可以利用这种方法，分离提取各种细胞及其亚细胞物质,如细胞膜、细胞核、染色体、线粒体、叶绿体、溶酶体、核蛋白体等。

也可以鉴定蛋白质、酶及核酸的纯度。

处理的样品可多可少，少至0.2mL以下。

离心技术的范围相当广泛.目前，利用这种技术分离各种亚细胞物质、酶、病毒、质粒及各种核酸.因此，为分子生物学、生物化学和医学的发展，提供了有利的手段。

自从1926年瑞典物理学家Svedberg制成世界上第一台超速离心机(45000转/分）到现在已有快80年的历史，在这期间,离心机的发展是非常迅速的.特别是在50年代以后发展的更快，例如，美国贝克曼（Beckman）公司和杜邦苏凡尔（Dupont Sorvall）公司，英国测量科学设备公司（MSE），日本的日立（HITACHI）公司以及德国的海吕斯（Heraeus)公司,都生产出各种离心机产品,如普通离心机、高速离心机和超速离心机.从简单的低速高容量的制备离心机到用于精密分析的超速离心机，应有尽有。

美国贝克(Beckman）公司的超速离心机居世界领先地位，采用了大规模集成电路，计算机程序控制,分离-检测,全部实现自动化;最高转速可达13多万转/分钟，并配有各种型号的垂直转头、水平转头、固定角转头、区带转头、连续转头等，供用户选用，不但操作简单、节省时间，而且进一步提高了的分离效率。

此外，离心技术也有了很大的发展，有密度梯度离心技术和区带离心技术，为生物大分子的分离、纯化和鉴定提供了优越的手段。

虽然离心机的种类有多种，离心技术也多种多样，但是它们的工作原理基本相似。

在实际工作中用的最多的还是制备型离心。

本课程主要介绍制备型分离技术。