密度梯度离心与差速离心
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细胞分离常用方法细胞分离是生物学和医学研究中的基础技术之一,它可以将复杂的生物样品中的细胞分离出来,进而进行单细胞研究、细胞培养、细胞分析等进一步实验。
细胞分离的方法有很多种,可以根据研究目的和实验要求来选择合适的方法。
下面将介绍几种常用的细胞分离方法。
1.酶消化分离法:这种方法是通过使用特定的酶来消化组织或细胞间的连接物质,使细胞从组织中解离出来。
常用的酶有胰蛋白酶、胰酶、胶原酶、玉米胚胎蛋白酶等。
该方法适用于从组织中分离细胞,如从肝脏中分离肝细胞。
2.离心法:离心法是利用离心仪的离心力来分离细胞。
一般分为差速离心和密度梯度离心两种。
差速离心适用于分离不同大小和形状的细胞,如红细胞和白细胞的分离;而密度梯度离心适用于细胞的分子量和密度有明显差异的情况,如分离淋巴细胞、单核细胞等。
3.过滤法:过滤法是利用不同孔径的滤膜将样品中的细胞分离出来。
根据细胞大小的不同,可以选择不同孔径大小的滤膜,常见的有0.22μm的滤膜。
过滤法适用于细胞数目较多且大小相似的情况,如血液中的白细胞。
4.磁珠分离法:磁珠分离法是利用磁珠的特殊性质和磁场来分离细胞。
磁珠表面可以特异性地结合上其中一种特定分子,如抗体。
通过与标记有磁珠的抗体的结合,可以选择性地将含有特定表面标记的细胞分离出来。
这种方法可以用于对细胞表面标记的特异性分离,如肿瘤细胞的分离。
5.流式细胞术:流式细胞术是通过细胞在流动溶液中的特定速度和流体动力学效应来分离细胞。
这种方法需要将细胞样品悬浮在含有细胞染料的缓冲液中,经过专用的流式细胞术仪器进行分析。
根据细胞性状、大小和表面标记的不同,可以选择性地将不同细胞分离出来。
上述方法是几种常见的细胞分离方法,不同的方法适用于不同的细胞类型和实验要求。
除了上述方法外,还有其他一些特殊的细胞分离方法,如电泳法、免疫磁珠法等。
在选择细胞分离方法时,需要综合考虑细胞类型、实验目的和设备条件等因素,选择合适的分离方法。
差速离心㊁密度梯度离心㊁超滤离心技术在骨髓间充质干细胞外泌体提取中的应用对比观察罗靖莹ꎬ贺宏丽ꎬ郭阳ꎬ黄玮玮ꎬ黄晓波(电子科技大学附属医院/四川省人民医院ꎬ成都610072)㊀㊀摘要:目的㊀观察差速离心㊁密度梯度离心㊁超滤离心技术在骨髓间充质干细胞(BMSCs)外泌体提取中的应用ꎬ筛选外泌体最佳离心提取方法ꎮ方法㊀取BMSCs培养48h后收集细胞上清ꎬ平均分成A㊁B㊁C组ꎬ分别使用差速离心技术㊁密度梯度离心技术㊁超滤离心技术提取外泌体ꎻ记录各组外泌体提取时间ꎻ采用负染色技术观察各组外泌体形态ꎻ使用纳米颗粒跟踪分析仪测算各组外泌体浓度及大小ꎻ采用BCA法测定外泌体总蛋白浓度ꎻ采用Westernblotting法检测各组外泌体表面标志蛋白CD9㊁CD63㊁Alixꎮ将肺微血管内皮细胞(PMVECs)分成5组ꎬEC组上室加入PMVECs及培养基ꎻLPS组上室加入PMVECs及含LPS的培养基(构建内皮细胞损伤模型)ꎻA㊁B㊁C组上室加入方法同LPS组ꎬ下室分别加入A㊁B㊁C组外泌体ꎻ采用葡聚糖渗漏实验检测外泌体内皮细胞通透性(观察外泌体对内皮细胞的修复作用)ꎬ以内皮细胞通透指数表示ꎮ结果㊀A㊁B㊁C组的外泌体的提取时间分别为(180ʃ8)㊁(203ʃ10)㊁(40ʃ5)minꎬA㊁B组外泌体的提取时间与C组相比ꎬP均<0.05ꎮ各组外泌体均为大小不等的椭圆形或圆形的膜性结构ꎬ边界清晰ꎬ但仅A组外泌体可见到典型的杯状结构ꎮA㊁B㊁C组的外泌体浓度分别为(4.46ʃ0.38)ˑ108/mL㊁(5.11ʃ0.16)ˑ108/mL㊁(2.18ʃ0.17)ˑ108/mLꎬA㊁B组与C组外泌体浓度相比ꎬP均<0.05ꎮA㊁B㊁C组的外泌体大小均为20~100nmꎮA㊁B组外泌体总蛋白浓度及CD63㊁Alix的相对表达量均显著高于C组(P均<0.05)ꎮA㊁B㊁C㊁LPS㊁EC组的内皮细胞通透指数分别为2.17ʃ0.15㊁1.77ʃ0.32㊁2.37ʃ0.42㊁2.93ʃ0.15㊁1.00ʃ0.00ꎬA㊁B㊁C㊁LPS组的内皮细胞通透指数与EC组相比ꎬP均<0.05ꎻA㊁B组的内皮细胞通透指数与LPS组相比ꎬP均<0.05ꎮ结论㊀密度梯度离心技术虽耗时较长ꎬ但提取的外泌体纯度㊁浓度较高ꎬ对内皮细胞的修复作用较强ꎬ可以作为科研和临床研究的首选外泌体离心提取方法ꎮ㊀㊀关键词:外泌体ꎻ外泌体提取方法ꎻ差速离心技术ꎻ密度梯度离心技术ꎻ超滤离心技术ꎻ间充质干细胞ꎻ骨髓间充质干细胞ꎻ肺微血管内皮细胞㊀㊀doi:10.3969/j.issn.1002 ̄266X.2019.12.013㊀㊀中图分类号:R33㊀㊀文献标志码:A㊀㊀文章编号:1002 ̄266X(2019)12 ̄0048 ̄05基金项目:四川省医学科学院 四川省人民医院青年博士基金(2015BS07)ꎮ通信作者:黄晓波(E ̄mail:drhuangxb@163.com)[12]StolfAMꎬCardosoCCꎬAccoA.Effectsofsilymarinondiabetesmellituscomplications:areview[J].PhytotherResꎬ2017ꎬ31(3):366 ̄374.[13]VessalGꎬAkmaliMꎬNajafiPꎬetal.Silymarinandmilkthistleextractmaypreventtheprogressionofdiabeticnephropathyinstreptozotocin ̄induceddiabeticrats[J].RenFailꎬ2010ꎬ32(6):733 ̄739.[14]SheelaNꎬJoseMAꎬSathyamurthyDꎬetal.Effectofsilymarinonstreptozotocin ̄nicotinamide ̄inducedtype2diabeticnephropathyinrats[J].IranJKidneyDisꎬ2013ꎬ7(2):117 ̄123.[15]张红ꎬ章向成ꎬ朱大龙.炎性反应与糖尿病肾病[J].国际内分泌代谢杂志ꎬ2015ꎬ35(1):49 ̄52.[16]NguyenDꎬPingFꎬMuWꎬetal.Macrophageaccumulationinhu ̄manprogressivediabeticnephropathy[J].Nephrologyꎬ2010ꎬ11(3):226 ̄231.[17]郑寿焕ꎬ金光明ꎬ柳明洙.CD14启动子 ̄159位点基因多态性与糖尿病肾病的相关性研究[J].中华内分泌代谢杂志ꎬ2009ꎬ25(4):409 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̄04)84ComparisonofdifferentialcentrifugationꎬdensitygradientcentrifugationꎬandultrafiltrationofcentrifugationinextractionofexosomesfrombonemarrowmesenchymalstemcellsLUOJingyingꎬHEHongliꎬGUOYangꎬHUANGWeiweiꎬHUANGXiaobo(TheAffiliatedHospitalofUniversityofElectronicScienceandTechnology/SichuanProvincialPeople'sHospitalꎬChengdu610072ꎬChina)㊀㊀Abstract:Objective㊀Toobservetheapplicationofthedifferentialcentrifugationꎬdensitygradientcentrifugationandultrafiltrationofcentrifugationintheextractionofexosomesfrombonemarrowmesenchymalstemcells(BMSCs)ꎬandtofindouttheoptimalmethod.Methods㊀Afterculturingfor48hꎬthesupernatantsofBMSCswerecollectedanddividedintothegroupsAꎬBandC.Theexosomeswereextractedbydifferentialcentrifugationꎬdensitygradientcentrifugationꎬandul ̄trafiltrationcentrifugationꎬrespectively.Theextractiontimeofeachgroupwasrecorded.Themorphologyofexosomesineachgroupwasobservedbynegativestainingtechniqueꎻtheconcentrationandsizeofexosomesweremeasuredbynanopar ̄ticletrackinganalyzerꎻtheconcentrationoftotalproteinwasdeterminedbyBCAmethodꎻthesurfacemarkerproteinsCD9ꎬCD63ꎬAlixofexosomesweredetectedbyWesternblotting.Pulmonarymicrovascularendothelialcells(PMVECs)weredi ̄videdintofivegroups.PMVECsandmediumwereaddedtotheupperchamberoftheECgroup.PMVECsandLPS ̄contai ̄ningmediumwereaddedtotheupperchamberoftheLPSgroup(theendothelialcellinjurymodel)ꎻThesubstancesaddedtotheupperchamberofgroupsAꎬBandCwerethesameasthoseoftheLPSgroupꎬandthelowerchamberwasaddedwiththeexosomesꎬrespectively.Thepermeabilityofexosomeswasdetectedbydextranleakagetest(toobservetheeffectontherepairmentofendothelialcells).Results㊀TheextractiontimeofexosomesinthegroupsAꎬBandCwas(180ʃ8)ꎬ(203ʃ10)and(40ʃ5)minꎬrespectively.TheextractiontimeofexosomesinthegroupsAandBwassignificanthigherthanthatofthegroupC(P<0.05).TheexosomesofeachgroupwereellipticalorcircularmembranousstructuresofvaryingsizeswithclearboundariesꎬbutonlyinthegroupAꎬwefoundtypicalcup ̄likestructure.Theexosomeconcen ̄trationsinthegroupsAꎬBꎬandCwere(4.46ʃ0.38)ˑ108/mLꎬ(5.11ʃ0.16)ˑ108/mLꎬand(2.18ʃ0.17)ˑ108/mLꎬrespectivelyꎬwithstatisticallysignificantdifference(allP<0.05).Theexosomesofeachgroupwere20to100nminsize.ThetotalproteinconcentrationandtherelativeexpressionofCD63andAlixinthegroupsAandBweresignificantlyhigherthanthoseinthegroupC(allP<0.05).ThepermeabilityindexesofendothelialcellsinthegroupsAꎬBꎬCꎬLPSgroupandECgroupwere2.17ʃ0.15ꎬ1.77ʃ0.32ꎬ2.37ʃ0.42ꎬ2.93ʃ0.15ꎬand1.00ʃ0.00ꎬrespectivelyꎻsignifi ̄cantdifferencewasfoundinthepermeabilityofendothelialcellsbetweenthegroupECandgroupsAꎬBꎬCandLPS(allP<0.05)aswellasbetweenthegroupLPSandgroupsAandB(P<0.05).Conclusion㊀Ittakesalongertimeforden ̄sitygradientcentrifugationtechnologytoextracttheexosomesꎬbuttheextractedexosomeshavehigherpurityꎬconcentra ̄tionꎬandstrongerrepairingeffectonendothelialcells.Thereforeꎬdensitygradientcentrifugationtechnologycouldbeapre ̄ferredcentrifugalextractionmethodforscientificresearchandclinicalresearch.Keywords:exosomesꎻexosomesextractedmethodꎻdifferentialcentrifugationꎻdensitygradientcentrifugationꎻultra ̄filtrationcentrifugationꎻmesenchymalstemcellsꎻbonemarrowmesenchymalstemcellsꎻpulmonarymicrovascularendothe ̄lialcells㊀㊀间充质干细胞(MSCs)作为一种具有多向分化潜能的细胞ꎬ因其在再生医学领域和临床试验中对各种疾病的治疗效果受到广泛关注ꎮ骨髓间充质干细胞(BMSCs)常被作为细胞再生的理想供体细胞ꎬ主要的作用机制包括归巢㊁调节免疫㊁转分化及旁分泌[1~4]ꎮ外泌体是一种由脂质双分子层包裹的膜性囊泡ꎬ大小通常在20~100nmꎮ研究[5~9]显示ꎬ外泌体广泛存在于尿液㊁胸腹腔积液㊁乳汁㊁唾液等体液中ꎬ而且很多细胞可以分泌外泌体ꎬ如MSCs㊁血细胞㊁内皮细胞㊁神经细胞㊁肿瘤细胞等ꎻ外泌体内含有各种蛋白质㊁脂类和mRNA㊁miRNA㊁DNA片段等遗传物质ꎬ细胞间可以通过外泌体交换信息㊁相互作用ꎬ且免疫排斥风险较低ꎬ在各种病理状态及炎症反应中发挥着重要的作用ꎮ内皮细胞和上皮细胞受损是炎症反应中至关重要的环节ꎬ已证实MSCs可以通过外泌体修复受损的内皮细胞[10]ꎮ外泌体体积小且不稳定ꎬ因此如何快速有效地分离和提取外泌体是目前面临的主要挑战ꎮ分离和提取外泌体的方94法主要有离心法㊁免疫磁珠法㊁PEG沉淀法㊁试剂盒法等ꎬ其中常用的离心法主要有差速离心技术㊁密度梯度离心技术和超滤离心技术[11]ꎮ差速离心技术主要是依据粒子大小和密度设置不同的离心力ꎬ通过平衡沉降原理来分离外泌体ꎮ密度梯度离心技术通常采用蔗糖作为分离介质ꎬ与重水一起配置成1.1~1.19g/mL的密度垫ꎬ根据不同沉降系数物质在离心力作用下的分层分布ꎬ以此分离出外泌体[12]ꎮ超滤离心技术是在一定压力下使溶质通过不同孔径的滤膜ꎬ从而筛选出外泌体ꎮ2018年6月2日~2018年9月1日ꎬ本研究观察了差速离心㊁密度梯度离心㊁超滤离心技术在BMSCs外泌体提取中的应用ꎬ筛选外泌体最佳离心提取方法ꎮ1 材料与方法1.1㊀细胞㊁试剂及仪器㊀BMSCs㊁肺微血管内皮细胞(PMVECs)购自美国sciencell公司ꎬDMEM/F12培养基㊁胎牛血清(FBS)购自美国Gibco公司ꎬ抗CD9㊁CD63㊁Alix㊁GAPDH购自R&D公司ꎬ山羊抗兔IgG ̄HRP㊁山羊抗鼠IgG ̄HRP购自美国Abcam公司ꎬBCA蛋白试剂盒购自凯基公司ꎬ透射电子显微镜购自Philips公司ꎬ细胞恒温培养箱购自美国Thermo公司ꎬ超速离心机购自Beckman公司ꎬ荧光酶标仪购自美国Thermo公司ꎮ1.2㊀细胞培养㊁分组及外泌体的提取㊀BMSCs㊁PMVECs分别在37ħ㊁5%CO2细胞培养箱中ꎬ用含有10%胎牛血清(FBS)和5%双抗的DMEM/F12培养基进行培养ꎮ取第4~5代BMSCs培养至60%~70%融合时ꎬ更换为无血清培养基ꎬ继续培养48h后收集细胞上清360mLꎬ平均分成A㊁B㊁C组ꎬ每组120mLꎬ分别使用差速离心技术㊁密度梯度离心技术㊁超滤离心技术提取外泌体ꎮ记录各组外泌体提取时间ꎮ①差速离心技术提取外泌体ꎮ取A组细胞上清以3000ˑg离心20minꎬ去除细胞碎片和大分子物质ꎬ在4ħ条件下100000ˑg离心60minꎬ弃上清ꎬ加入4ħ的PBS重悬ꎬ然后在4ħ条件下100000ˑg离心60minꎬ将沉淀物用200μL预冷的PBS重悬ꎬ用0.22μm滤过膜过滤ꎬ即得BMSCs外泌体ꎮ②密度梯度离心技术提取外泌体ꎮ取B组细胞上清以300ˑg离心10minꎬ去除细胞碎片和大分子物质ꎬ10000ˑg离心30minꎬ去除微泡ꎬ延离心管壁缓慢加入4mL30%蔗糖溶液ꎬ形成一单层ꎬ在4ħ条件下100000ˑg离心90minꎬ弃上清ꎬ将蔗糖层重悬于PBS中ꎬ再在4ħ条件下100000ˑg离心90minꎬ将获得的沉淀物重悬于200μL预冷的PBS中ꎬ即得BMSCs外泌体ꎮ③超滤离心技术提取外泌体ꎮ在超滤离心管中加入PBS缓冲液ꎬ室温条件下3000ˑg离心15minꎬ去除甘油和其他保存剂ꎻ取C组细胞上清以17000ˑg离心15minꎬ然后加入超滤离心管中以3000ˑg离心30minꎬ用200μLPBS重悬超滤膜上的沉淀物ꎬ即得BMSCs外泌体ꎮ1.3㊀A㊁B㊁C组外泌体形态观察㊀采用负染色技术ꎮ向载样铜网上分别加入提取的A㊁B㊁C组外泌体混悬液20μLꎬ室温静置3min后用滤纸吸干液体ꎬ再加入30μL的3%磷钨酸溶液负染5minꎬ滤纸吸干㊁晾干ꎬ透射电镜下观察各组外泌体形态ꎮ1.4㊀A㊁B㊁C组外泌体浓度及大小测算㊀取A㊁B㊁C组外泌体悬液100μL稀释于2mLPBS内ꎬ使用纳米颗粒跟踪分析仪(Nanosight)测算各组外泌体浓度ꎬ并根据每个粒子的布朗运动与斯托克斯 ̄爱因斯坦(Stokes ̄Einstein)方程测算各组外泌体大小ꎮ1.5㊀A㊁B㊁C组外泌体总蛋白及表面标志蛋白CD9㊁CD63㊁Alix的检测㊀①采用BCA法测定A㊁B㊁C组外泌体总蛋白浓度ꎮ②采用Westernblotting法检测A㊁B㊁C组外泌体表面标志蛋白CD9㊁CD63㊁Alixꎮ取A㊁B㊁C组外泌体悬液100μLꎬ加入RIPA裂解液于冰上裂解10minꎬ使用超声破碎外泌体后于4ħ条件下15000ˑg离心10minꎬ制得各组外泌体蛋白样本ꎮ取各组外泌体蛋白样本与上样缓冲液混合煮沸5min使蛋白变性ꎬ然后进行SDS ̄PAGE电泳ꎬ半干时转至PVDF膜上ꎬ用5%脱脂奶粉封闭ꎬ加入一抗ꎬ4ħ过夜ꎬTBST清洗3次ꎬ加入相应二抗ꎬ室温孵育1hꎬTBST清洗3次ꎬ以GAPDH为内参ꎬECL化学发光系统检测各组外泌体表面标志蛋白CD9㊁CD63㊁Alix灰度值ꎬ计算各组外泌体表面标志蛋白CD9㊁CD63㊁Alix的相对表达量ꎮ外泌体表面标志蛋白的相对表达量=外泌体表面标志蛋白灰度值/GAPDH灰度值ꎮ1.6㊀外泌体内皮细胞通透性检测㊀采用100ng/mL的脂多糖(LPS)干预PMVECs6h构建内皮细胞损伤模型ꎮ采用Transwell小室进行葡聚糖渗漏实验ꎮ将PMVECs分成5组ꎬEC组上室加入1ˑ105个PMVECs以及100μL完全培养基ꎻLPS组上室加入1ˑ105个PMVECs以及100μL含100ng/mLLPS的完全培养基ꎻA㊁B㊁C组上室加入方法05同LPS组ꎬ下室分别加入A㊁B㊁C组外泌体100μgꎬ用不含酚红㊁血清的培养基重悬至400μLꎮ各组上室弃上清ꎬ加入不含酚红㊁血清的培养基配制的FITC ̄葡聚糖(40kDaꎬ0.5mg/mL)100μLꎬ下室加入等浓度无FITC标记的葡聚糖100μLꎬ37ħ㊁5%CO2㊁避光条件下培养40minꎬ吸取上㊁下室液体各100uLꎬ在激发光波长490/485nm㊁发射光波长525/530nm处ꎬ采用荧光酶标仪检测荧光强度ꎬ计算内皮细胞通透系数ꎮ内皮细胞通透系数=([A]/t)ˑ(1/A)ˑ(v/[L])ꎮ其中[A]为下室荧光强度ꎻt为时间ꎬ单位为sꎻA为滤过面积ꎬ单位为cm2ꎻv为下室液体量ꎻ[L]为上室荧光强度ꎮ各组外泌体内皮细胞通透性以各组内皮细胞通透指数表示ꎮ各组内皮细胞通透指数=各组内皮细胞通透系数/EC组内皮细胞通透系数ꎮ1.7㊀统计学方法㊀采用SPSS20.0统计软件ꎮ计量资料以 xʃs表示ꎬ比较用单因素方差分析ꎮP<0.05为差异有统计学意义ꎮ2㊀结果2.1㊀A㊁B㊁C组外泌体提取时间比较㊀A㊁B㊁C组的外泌体的提取时间分别为(180ʃ8)㊁(203ʃ10)㊁(40ʃ5)minꎬA㊁B组外泌体的提取时间与C组相比ꎬP均<0.05ꎻA组外泌体的提取时间与B组相比ꎬP>0.05ꎮ2.2㊀A㊁B㊁C组外泌体形态比较㊀如图1所示ꎬ各组外泌体均为大小不等的椭圆形或圆形的膜性结构ꎬ边界清晰ꎬ但仅A组外泌体可见到典型的杯状结构ꎮ图1㊀透射电镜下各组外泌体形态2.3㊀A㊁B㊁C组外泌体浓度及大小比较㊀A㊁B㊁C组的外泌体浓度分别为(4.46ʃ0.38)ˑ108/mL㊁(5.11ʃ0.16)ˑ108/mL㊁(2.18ʃ0.17)ˑ108/mLꎬA㊁B组与C组外泌体浓度相比ꎬP均<0.05ꎻA组与B组外泌体浓度相比ꎬP>0.05ꎮA㊁B㊁C组的外泌体大小均为20~100nmꎮ2.4㊀A㊁B㊁C组外泌体总蛋白浓度及表面标志蛋白CD9㊁CD63㊁Alix的表达比较㊀如表1所示ꎬA㊁B组外泌体总蛋白浓度及CD63㊁Alix的相对表达量均显著高于C组(P均<0.05)ꎮ表1㊀A㊁B㊁C组外泌体表面标志蛋白CD9㊁CD63㊁Alix的表达比较( xʃs)组别总蛋白(μg/mL)CD9CD63AlixA组331.33ʃ24.17﹡6.47ʃ1.0718.47ʃ0.83﹡26.73ʃ0.76﹡B组350.06ʃ30.74﹡7.40ʃ0.5626.30ʃ0.82﹡37.70ʃ2.65﹡C组198.42ʃ18.965.53ʃ1.199.75ʃ0.4418.13ʃ1.27㊀㊀注:与C组相比ꎬ﹡P<0.05ꎮ2.5㊀A㊁B㊁C㊁LPS㊁EC组内皮细胞通透指数比较㊀A㊁B㊁C㊁LPS㊁EC组内皮细胞通透指数分别为2.17ʃ0.15㊁1.77ʃ0.32㊁2.37ʃ0.42㊁2.93ʃ0.15㊁1.00ʃ0.00ꎬA㊁B㊁C㊁LPS组的内皮细胞通透指数与EC组相比ꎬP均<0.05ꎻa㊁b组的内皮细胞通透指数与LPS组相比ꎬP均<0.05ꎻ其余各组间相比ꎬP均>0.05ꎮ3㊀讨论㊀㊀BMSCs是成体干细胞的一种ꎬ具有高度自我更新能力和多向分化潜能ꎬ且具有免疫调节作用ꎬ是组织工程学中常用的种子细胞ꎬ其对临床上常见的急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征㊁心肌梗死㊁糖尿病㊁肝肾功能衰竭等多种疾病的治疗效果受到了广泛的关注ꎮ随着研究的深入进展ꎬ研究人员发现MSCs主要是通过旁分泌机制进行组织器官的保护[13]ꎮ胞外囊泡(EV)被认为是细胞间信息交流和物质传递的新机制[14]ꎮ根据粒径大小和分泌机制的不同ꎬEV可分为100~1000nm的微泡(MV)和20~100nm的外泌体ꎮ研究[15]显示ꎬ外泌体易获取㊁易储存ꎬ无致瘤性ꎬ在再生医学㊁器官移植㊁疾病诊断和药物传递等方面发挥了不可或缺的作用ꎬ但目前并无标准的分离提取技15术ꎬ如何提高浓度㊁保证纯度㊁维持活性㊁节约时间ꎬ是目前临床亟需解决的问题ꎮ㊀㊀本研究首先采用差速离心技术㊁密度梯度离心技术和超滤离心技术提取BMSCs外泌体ꎬ随后对分离提取的外泌体进行了比较ꎮ各组外泌体提取时间对比显示ꎬ超滤离心技术提取外泌体用时最少ꎻ通过透射电镜和Nanosight观察到ꎬ3种方法均可以分离出大小不等的椭圆形或圆形的膜性结构ꎬ大小在20~100nmꎻ通过BCA蛋白定量法和NTA公式计算出ꎬ密度梯度离心技术提取的外泌体总蛋白和外泌体浓度最高ꎬ差速离心技术其次ꎬ超滤离心技术最低ꎻ3种方法提取的外泌体均可表达特异性表面标志物CD9㊁CD63㊁Alixꎬ差速离心技术和密度梯度离心技术CD63和Alix的表达明显高于超滤离心技术ꎬ说明超滤离心技术分离出来的外泌体浓度和纯度均较低ꎮ㊀㊀PMVECs既是急性肺损伤时的受害者ꎬ也是启动者ꎬ在急性呼吸窘迫综合征(ARDS)发生时ꎬPM ̄VECs的通透性显著升高ꎮ本研究通过LPS干预PMVECs构建了内皮细胞损伤模型ꎬ观察各离心技术提取的外泌体对受损内皮细胞的修复作用ꎬ结果显示ꎬ与LPS组相比ꎬA㊁B组外泌体内皮细胞通透指数显著下降ꎬ说明差速离心技术和密度梯度离心技术提取的外泌体具有更强的内皮细胞修复能力ꎬ可能与差速离心技术和密度梯度离心技术提取的外泌体浓度和纯度更高有关ꎬ但后期仍需研究更多的内皮细胞功能实验验证ꎮ㊀㊀差速离心技术步骤简单ꎬ产物纯度高ꎮ但差速离心技术也有一定的缺点ꎬ反复的离心提纯过程会造成外泌体丢失及影响囊膜的完整性ꎬ且易形成聚合物[16]ꎻ密度梯度离心技术提取产物更纯ꎬ且不影响外泌体的活性ꎬ但是准备工作繁琐ꎬ程序复杂且耗时长ꎮ超滤离心技术过程简单㊁速度快ꎬ但可能存在杂蛋白污染ꎬ部分外泌体也可能黏附于滤膜上导致产物损失以及活性丧失[17]ꎮ㊀㊀综上所述ꎬ密度梯度离心技术虽耗时较长ꎬ但提取的外泌体纯度㊁浓度较高ꎬ对内皮细胞的修复作用较强ꎬ可以作为科研和临床研究的首选外泌体离心提取方法ꎮ参考文献:[1]EsrefogluM.Roleofstemcellsinrepairofliverinjury:experi ̄mentalandclinicalbenefitoftransferredstemcellsonliverfailure[J].WorldJGastroenterolꎬ2013ꎬ19(40):6757 ̄6773. 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离心方法和原理差速离心主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。
起始的离心速度较低,让较大的颗粒沉降到管底,小的颗粒仍然悬浮在上清液中。
收集沉淀,改用较高的离心速度离心悬浮液,将较小的颗粒沉降,以此类推,达到分离不同大小颗粒的目的。
密度梯度离心(density gradient centrifugation)用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度,将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部,通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。
这类分离又可分为速度沉降和等密度沉降平衡两种。
密度梯度离心常用的介质为氯化铯,蔗糖和多聚蔗糖。
分离活细胞的介质要求:1)能产生密度梯度,且密度高时,粘度不高;2)PH中性或易调为中性;3)浓度大时渗透压不大;4)对细胞无毒。
密度梯度离心原理不同颗粒之间存在沉降系数差时,在一定离心力作用下,颗粒各自以一定速度沉降,在密度梯度不同区域上形成区带的方法。
密度梯度离心法density gradient centrifugation method〔1〕亦称平衡密度梯度离心法。
用超离心机对小分子物质溶液,长时间加一个离心力场达到沉降平衡,在沉降池内从液面到底部出现一定的密度梯度。
若在该溶液里加入少量大分子溶液,则溶液内比溶剂密度大的部分就产生大分子沉降,比溶剂密度小的部分就会上浮,最后在重力和浮力平衡的位置,集聚形成大分子带状物。
利用这种现象,测定核酸或蛋白质等的浮游密度,或根据其差别进行分析的一种沉降平衡法。
自1958年米西尔逊(M.Meselson),斯塔尔(F.W.Stahl),维诺格拉德(J.Vinograd)成功地分离了〔15N〕DNA和〔14N〕DNA以来,该法取得许多成果。
为得到必要的浓度梯度,多采用浓氯化铯溶液,所以有时也使用氯化铯浓度梯度离心法这个名称,还可采用氯化铷、溴化铯等溶液。
通常利用分析超离心机,但在将细胞颗粒成分进行分离等以纯化为目的的情况,利用密度差,使用分离超离心机,采用预先制备好的蔗糖等的密度梯度。
高中课本中涉及离心技术比较离心技术:是利用旋转运动产生的离心力,根据物质的沉降系数或浮力密度的差别进行物质的分析、分离、浓缩和提纯的一种技术。
功能:Ø分离、纯化样品;Ø对已纯化的样品进行结构和性质的分析。
主要分两种类型:制备性离心技术和分析性离心技术一、制备性离心技术:是以分离纯化生化物质、细胞、亚细胞粒子为目的离心技术。
1、差速离心法(差速沉降离心法)Cellhomogenate细胞匀浆pelletcontains颗粒包含nucleicytoskeletons细胞骨架mitochondriallysosomes peroxisomes线粒体溶酶体过氧化物酶体microsomessmall vesicles 微粒小囊泡ribosomesviruses large macromolecules核糖体病毒大分子fractionation高中课本涉及的细胞器的获取分离通过差速离心法获得。
2、密度梯度离心法(密度梯度区带离心法)此法可以用于DNA复制分离、病毒颗粒的分离等。
二、分析性超速离心技术:与制备性超速离心不同的是:分析性超速离心主要是为了研究生物大分子的沉降特性和结构,而不是专门收集某一特定组份。
因此它使用了特殊的转子和检测手段,以便连续监视物质在一个离心场中的沉降过程。
分析性超速离心的应用:⒈测定生物大分子的相对分子重量测定相对分子重量主要有三种方法:沉降速度、沉降平衡和接近沉降平衡。
其中应用最广的是沉降速度,超速离心在高速中进行,这个速度使得任意分布的粒子通过溶剂从旋转的中心辐射地向外移动,在清除了粒子的那部分溶剂和尚含有沉降物的那部分溶剂之间形成一个明显的界面,该界面随时间的移动而移动,这就是粒子沉降速度的一个指标,然后用照相记录,即可求出粒子的沉降系数。
⒉生物大分子的纯度估计静分析性超速离心已广泛地应用于研究DNA 制剂、病毒和蛋白质的纯度。
用沉降速度的技术来分析沉降界面是测定制剂均质性的最常用方法之一,出现单一清晰的界面一般认为是均质的,如有杂质则在主峰的一侧或二侧出现小峰。
差速离心法和密度梯度离心法的区别教学问题:高中生物必修1中研究细胞器的分离方法是差速离心法,必修2中研究DNA复制方式——半保留复制的方法是密度梯度离心法,两者之间有什么区别?一、差速离心法差速离心法是交替使用低速和高速离心,用不同强度的离心力使具有不同质量的物质分级分离的方法。
此法适用于混合样品中各沉降系数差别较大组分的分离。
1.工作原理通常两个组分的沉降系数差在10倍以上时可以用此法分离。
例如某样品中有大、中、小三个组分,用差速离心法分离时,把样品放在离心管内,先按大组分的沉降系数选择离心转速和离心时间,当离心结束时正好使大组分全部沉降到离心管底部,这时中小组分中的一部分也会沉降到底部。
若原始样品液中三个组分的含量相等,则在原始样品液中大组分占总组分量的三分之一。
通过一次离心后分离出的大组分沉淀占总组分量约90%。
如要进一步提纯可以把此沉淀物再溶解,再按大组分的沉降条件离心,得到大组分的第二次离心沉淀。
通过多次对沉淀和上清液差速离心,可以把三个沉降系数有差别的组份分离提纯,所以这个方法又称为分步离心法。
2.差速离心法的优缺点差速离心法的优点是样品的处理量较大,可用于大量样品的初分离。
其缺点是分离复杂样品和要求分离纯度较高时,离心次数多,操作繁杂。
由于沉淀的多次清洗、溶解、再沉淀,容易引起中间损失,所以离心分辨力差。
实际分离时由于离心时的对流、扩散和收取沉淀时的污染,对于一些沉降系数相差不大的组分无法进行完全的分离提纯。
产品的纯度和回收率都达不到上述理论值。
因此差速离心法主要用于大量样品的初步分离提纯。
二、密度梯度离心法密度梯度离心法又称为区带离心法,可以同时使样品中几个或全部组分分离,具有良好的分辨率。
离心时先将样品溶液置于一个由梯度材料形成的密度梯度液体柱中,离心后被分离组分以区带层分布于梯度柱中。
1.工作原理不同颗粒之间存在沉降系数差时,在一定离心力作用下,颗粒各自以一定速度沉降,在密度梯度不同区域上形成区带的方法。
离心方法和原理差速离心主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。
起始的离心速度较低,让较大的颗粒沉降到管底,小的颗粒仍然悬浮在上清液中。
收集沉淀,改用较高的离心速度离心悬浮液,将较小的颗粒沉降,以此类推,达到分离不同大小颗粒的目的。
密度梯度离心(density gradient centrifugation)用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度,将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部,通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。
这类分离又可分为速度沉降和等密度沉降平衡两种。
密度梯度离心常用的介质为氯化铯,蔗糖和多聚蔗糖。
分离活细胞的介质要求:1)能产生密度梯度,且密度高时,粘度不高;2)PH中性或易调为中性;3)浓度大时渗透压不大;4)对细胞无毒。
密度梯度离心原理不同颗粒之间存在沉降系数差时,在一定离心力作用下,颗粒各自以一定速度沉降,在密度梯度不同区域上形成区带的方法。
密度梯度离心法density gradient centrifugation method〔1〕亦称平衡密度梯度离心法。
用超离心机对小分子物质溶液,长时间加一个离心力场达到沉降平衡,在沉降池内从液面到底部出现一定的密度梯度。
若在该溶液里加入少量大分子溶液,则溶液内比溶剂密度大的部分就产生大分子沉降,比溶剂密度小的部分就会上浮,最后在重力和浮力平衡的位置,集聚形成大分子带状物。
利用这种现象,测定核酸或蛋白质等的浮游密度,或根据其差别进行分析的一种沉降平衡法。
自1958年米西尔逊(M.Meselson),斯塔尔(F.W.Stahl),维诺格拉德(J.Vinograd)成功地分离了〔15N〕DNA和〔14N〕DNA以来,该法取得许多成果。
为得到必要的浓度梯度,多采用浓氯化铯溶液,所以有时也使用氯化铯浓度梯度离心法这个名称,还可采用氯化铷、溴化铯等溶液。
通常利用分析超离心机,但在将细胞颗粒成分进行分离等以纯化为目的的情况,利用密度差,使用分离超离心机,采用预先制备好的蔗糖等的密度梯度。
密度梯度离心与差速离心的区别
密度梯度离心属于密度萃取,是根据溶质和溶液的密度差异来实现分离的,是在高细胞压力的作用下,在容积较大的离心管中利用液体单位体积的重量(密度)差异进行分离;而差速离心是基于离心力的不同,即根据溶质的分子量和浓度的差异,从而使得这一溶液的相对离心力差异改变而实现分离,利用的是两液体的离心力差异。
2、分离效率不同
密度梯度离心的效率一般比较低,它主要利用液体单位体积的重量差异,物质分子量的差异较小,溶液浓度的差异也较小,因此分离效率不会高。
而差速离心可以实现高密度的湍流而高速度的分离,分离效率更高。
三、应用不同
密度梯度离心主要用于对分子量大的物质进行分离,如生物体分离,尤其是细胞分离,可以达到更高的精度;而差速离心可以用于分离分子量小的有机物,如分离水溶性有机物、抗体和抗原之间的结合等。
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密度梯度离心和密度梯度超速离心的区别密度梯度离心和密度梯度超速离心都是常用的分离技术,它们的区别主要在于离心过程中的离心力不同。
密度梯度离心是利用不同密度物质之间的分层原理进行分离的。
在离心过程中,样品被加入密度梯度液体中,高密度的样品会沉降到离心管底部,低密度的样品则会浮在液面上。
这种离心方式适用于分离不同密度的生物分子和细胞器,如蛋白质、RNA、DNA、细胞核等。
密度梯度超速离心是在密度梯度离心的基础上进一步加速离心
过程,以达到更高的离心力。
在离心过程中,样品受到的离心力大于常规离心,由于惯性力的作用,会引起样品中分子的离心沉积。
这种离心方式适用于分离高分子量的生物分子,如蛋白质复合物、病毒等。
因此,密度梯度离心和密度梯度超速离心的区别在于离心过程中的离心力和适用范围。
选择合适的离心方式可以帮助科研人员更好地分离和提取样品中的目标物质。
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高中生物科学方法(2)差速离心法与密度梯度离心法同位素标记法与荧光标记法一、差速离心法与密度梯度离心法1.差速离心法(1)概念:差速离心主要是采取逐渐提高离心速率分离不同大小颗粒的方法。
(2)原理:在分离细胞中的细胞器时,将细胞膜破坏后,形成由各种细胞器和细胞中其他物质组成的匀浆,将匀浆放入离心管中,采取逐渐提高离心速率的方法分离不同大小的细胞器。
(3)具体操作:起始的离心速率较低,让较大的颗粒沉降到管底,小的颗粒仍然悬浮在上清液中。
收集沉淀,改用较高的离心速率离心上清液,将较小的颗粒沉降,以此类推,达到分离不同大小颗粒的目的。
2.密度梯度离心法(1)概念:密度梯度离心法又称为区带离心法,可以同时使样品中几个或全部组分分离,具有良好的分辨率。
(2)原理:不同颗粒之间存在沉降系数差时,在一定离心力作用下,颗粒各自以一定速度沉降,在密度梯度不同区域上形成区带的方法。
(3)操作:离心时先将样品溶液置于一个由梯度材料形成的密度梯度液体柱中,离心后被分离,组分以区带层分布于梯度柱中。
3.密度梯度离心法和差速离心法的区别(1)差速离心法是用不同强度的离心力使具有不同质量的物质分级分离,密度梯度离心中单一样品组分的分离是借助于混合样品穿过密度梯度层的沉降或上浮来达到的。
(2)差速离心用两个甚至更多的转速,而密度梯度离心只用一个离心转速。
(3)差速离心是适用于混合样品中各沉降系数差别较大组分,而密度梯度离心的物质是密度有一定差异的。
二、同位素标记法与荧光标记法1.同位素标记法(1)同位素:同一元素中,质子数相同、中子数不同的原子互为同位素。
常用的同位素有:具有放射性的同位素:14C、32P、3H、35S等;还有不具有放射性的同位素:15N、18O等。
(2)同位素的特点:物理性质可能有差异,但组成的化合物化学性质相同。
(3)同位素标记法①概念:用物理性质特殊的同位素标记特定的原子,追踪化学反应中特定原子的去向。
②应用方法:标记特征化合物作为反应的原料,检测特征元素的去向,从而探究生化反应过程。
细胞器的分离技术-----差速离心法高中生物教学中涉及两种重要生物技术:差速离心和密度梯度离心。
高中生物必修一《分子与细胞》分离各种细胞器的方法介绍的是差速离心法。
一、实验原理1.细胞器是细胞中维持细胞复杂生命活动的功能性器官,为了研究各种细胞器的功能,首先就要将这些细胞器从细胞中分离出来。
利用各种物理方法(研磨、超声波振荡、低渗等将组织制成匀浆,细胞中的个中亚组分即从细胞中释放出来。
2.细胞内不同结构的细胞器大小密度存在差异,因此不同细胞器在介质中的沉降系数各不相同。
根据这一原理,常用不同转速的离心法来分离不同的细胞器。
分级分离的方法有差速离心和密度梯度离心两种。
3.分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆,在均匀的悬浮介质中用差速离心法进行分离,其过程包括组织细胞匀浆、分级分离和分析三步,这种方法已成为研究亚细胞成分的化学组成、理化特性及其功能的主要手段。
二、实验步骤(1)匀浆(Homogenization)低温条件下,将组织放在匀浆器中,加入等渗匀浆介质(即0.25mol/L蔗糖)进行破碎细胞使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆。
(2)分级分离(Fractionation)由低速到高速离心逐渐沉降。
先用低速使较大的颗粒沉淀,再用较高的转速,将浮在上清液中的颗粒沉淀下来,从而使各种细胞结构,如细胞核、线粒体等得以分离。
由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心开始时均匀分布在整个离心管中,所以每级离心得到的第一次沉淀必然不是纯的最重的颗粒,须经反复悬浮和离心加以纯化.(一)差速离心(differential centrifugation)在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心,用于分离不同大小的细胞和细胞器。
差速离心法是指有低速到高速逐级沉淀分离,使较大的颗粒先在较低速中沉淀,再用较高的转速将原先悬浮于上清夜中的较小颗粒分离沉淀下来,从而使各种亚细胞组分得以分离。
但由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心十是均匀分布于整个离心介质中的,故每级分离得到的第一次沉淀必然不是纯的最重的颗粒,需经反复悬浮和离心加以纯化。
细胞组分的分析方法一、超速离心技术(P64)离心技术原理:不同的细胞器具有不同的密度和体积,因此,可以利用离心方法加以分离和纯化。
1、差速离心(differential centrifugation)利用不同的离心速度产生的不同的离心力,将各种亚细胞组分和各种颗粒分离开来。
适合分离沉降速率差别较大的亚微结构颗粒。
多次离心达到纯化的目的。
2、密度梯度离心(P65)①速度沉降——分离密度接近大小不一的组分②等密度沉降——分离不同密度的组分将介质形成一涵盖所有组分密度的密度梯度,不同的样品由于其密度差异,在离心过程中进入到等密度介质区域即不再移动,从而实现分离的目的。
速度沉降和等密度沉降的比较二、组织化学和细胞化学(P65)利用一些显色剂与被测物质中的某些基团特异性结合,来判断核酸、蛋白质(酶)、糖类、脂类在细胞中的分布和含量。
福尔根(Feulgen)反应——显示DNA格莫瑞(Gomori)反应——显示碱性磷酸酶三、特异蛋白抗原的定位与定性P66原理:抗体能够自行识别并结合对应的抗原目的:检测特定蛋白质在细胞内的分布状况和含量。
(一)免疫荧光技术(二)免疫电镜技术人成纤维细胞中肌动蛋白束(800×)BHK细胞中的微管蛋白(500×)四、细胞内特异核酸序列的定位和定性研究对象:细胞内特异核酸(DNA或RNA)目的:定位、定量分析方法:原位杂交(in situ hybridization,ISH)以目标核酸的互补序列为探针,对细胞或者组织标本进行杂交处理,使目标核酸可视呈现的技术。
是细胞生物学、细胞遗传学、分子生物学相互交融的研究手段。
构建DNA分子物理图谱光谱核型分析(spectral karyotype,SKY)SKY of Human五、放射自显影研究生物大分子(略)六、定量细胞化学分析技术P69细胞分选(cell sorting):是细胞生物学中较新技术,是利用流式细胞仪(flow cytometery,FCM)对细胞或者其他生物微粒(如染色体)进行分选,并对其进行定量分析(大小、形状、核酸含量和蛋白质含量等)的技术。
离心方法的选用所分离的颗粒大小和密度相差较大:常速、高速离心;若从样品液中分离2种以上大小和密度不同的颗粒:差速离心;超速离心:差速离心法和密度梯度离心法,后者又分速率区带离心和等密度离心。
1、差速离心采用不同离心速度与时间,使不同沉降速度的颗粒分批分离;差速离心法:原理:采用逐渐增加离心速度或低速和高速交替进行离心,使沉降速度不同的颗粒在不同的分离速度及不同的离心时间下分批分离的方法,称为差速离心法。
当以一定离心力在一定的离心时间内进行离心时,在离心管底部就会得到最大和最重颗粒的沉淀,分出的上清液在加上转速下再进行离心,又得到第二部分较大、较重颗粒的“沉淀”及含小和轻颗粒“上清液”,如此,多次离心处理,即能把液体中的不同颗粒较好分开。
这时所得沉淀是不纯的,需经再悬浮和再离心(2—3次),才能得到较纯颗粒。
常用于从组织匀浆中分离细胞和病毒。
2、密度梯度离心又称速率—区带离心,沉降系数较接近的物质分离的方法;原理:不同颗粒之间存在沉降系数差时,在一定离心力作用下,颗粒各自以一定速度沉降,在密度梯度不同区域上形成区带的方法。
介质梯度应预先形成,介质的最大密度要小于所有样品颗粒的密度。
常用的有蔗糖、甘油;密度梯度液的制备用梯度混合器,形成由管口到管底逐步升高的密度梯度;操作:离心前将样品小心铺放在密度梯度溶液表面,离心形成区带。
离心后不同大小、不同形状、有一定沉降系数差异的颗粒在密度梯度液中形成若干条界面清楚的不连续区带;可用来分离核酸、蛋白质、核糖体亚基及其它成分。
3、等密度离心原理:当不同颗粒存在浮力密度差时,在离心力场下,在密度梯度介质中,颗粒或向下沉降,或向上浮起,一直移动到与它们各自的密度恰好相等的位置上形成区带,从而使不同浮力密度的物质得到分离;区别:离心介质、密度梯度范围与密度梯度离心不同,欲分离的颗粒密度处于离心介质密度范围内。
介质有:氯化铯、硫酸铯、溴化铯、三碘苯衍生物等。
操作:介质溶液与样品液混合均匀,足够时间离心。
密度梯度离心和差速离心
密度梯度离心和差速离心是两种用于分离混合物的离心方法。
密度梯度离心是利用离心管中不同密度的物质在离心作用下分离出来的原理。
在离心管中,先加入不同密度的溶液,在离心作用下,各种溶液会在密度梯度上分层。
这时,可以采用吸取分层液的方法进行样品的分离,从而分离出不同密度的组分。
差速离心是利用离心管中不同质量的物质在离心作用下分离出来的原理。
在离心管中,将样品或混合物装入离心管中,在离心作用下,不同的组分根据其质量的大小,向不同方向运动,形成不同的层次,然后再用注射器等方法分离所需组分。
两种离心方法在生物化学、生物医学等领域得到广泛应用,如DNA纯化、蛋白质分离等。
差速离心和梯度离心异同差速离心和梯度离心,这俩听起来似乎挺高大上的,实则它们就是科研实验室里的两个“得力助手”。
说实话,你大可以把它们看作是细胞和蛋白质“大厨”在厨房里的两种“炒菜”技巧,各有各的拿手好戏,效果也不尽相同。
那它们到底有什么区别呢?咱们今天就来聊一聊,顺便顺手给你打个比方,轻松搞懂这两个术语,咋样?先说说差速离心。
差速离心就像咱们玩转盘游戏,靠的是转得快,来筛选不同的物质。
基本原理就是通过离心力的差异,把样本中的不同成分按照“重的往下走,轻的往上漂”的规律分开。
举个例子,就像你去河边捞水里的沙子和石子,石头比较重,甩得越远;沙子轻,跑得慢,最后就被分开了。
差速离心的最大特点是通过不断加速旋转,慢慢让不同的物质“分层”,这种方法效率比较高,能快速分离出较大粒子的东西,比如细胞、细胞核、线粒体什么的。
不过,话说回来,差速离心也有它的局限。
它对分离的纯度要求不高,像那些小小的颗粒,可能会没分开,或者分得不够彻底。
要是你想分离非常精细的小东西,这就有点困难了。
所以,这时候就得派上梯度离心的大明星了。
梯度离心可不一样,它不像差速离心那样一股脑儿地拼命转,而是采取了一种更“温柔”的方式。
你可以想象一下,在一瓶液体里,咱们先调个“液体梯度”,也就是说,底下浓度大,上面浓度小,然后把样本加入,慢慢转。
这里的奥妙就在于浓度的变化,大家一边旋转,一边根据自己“重量”的不同位置,恰好在某个浓度层次里停下来,就像有些人会停在跳舞班里适合的位置,而有些人则不会。
通过这种办法,你就能把那些不同大小、密度的物质,分得超级清楚。
比如分离病毒、蛋白质什么的,梯度离心简直是一绝!它能做到高精度分离,像在挑选黄金一样,把杂质筛掉,剩下的都是“精华”。
说了这么多,差速离心和梯度离心到底有什么相似和不同之处呢?简单来说,它们的相似之处就在于:不管是差速离心还是梯度离心,目标都是利用离心力的不同,来分开混杂在一起的各种物质。
密度梯度离心和密度梯度超速离心的区别密度梯度离心和密度梯度超速离心是两种常见的离心分离技术,它们在分离样品时有着不同的原理和应用。
本文将从原理、应用和优缺点三个方面来介绍这两种离心分离技术的区别。
一、原理
密度梯度离心是利用不同密度的物质在离心过程中分层的原理,将样品加入到密度梯度离心管中,离心后样品会在不同密度的梯度中分层,从而实现分离。
密度梯度离心的分离效果取决于样品的密度和离心管中的密度梯度。
密度梯度超速离心则是利用样品在离心过程中受到离心力的作用,从而分离出不同密度的物质。
在离心过程中,样品会受到离心力的作用,从而分离出不同密度的物质。
密度梯度超速离心的分离效果取决于样品的密度和离心力的大小。
二、应用
密度梯度离心主要应用于分离细胞、蛋白质、核酸等生物大分子,以及分离纯化病毒、蛋白质复合物等。
密度梯度离心可以分离出不同密度的物质,从而实现对样品的分离纯化。
密度梯度超速离心主要应用于分离细胞器、蛋白质、核酸等生物大分子,以及分离纯化病毒、蛋白质复合物等。
密度梯度超速离心可
以分离出不同密度的物质,从而实现对样品的分离纯化。
三、优缺点
密度梯度离心的优点是可以分离出不同密度的物质,从而实现对样品的分离纯化。
缺点是需要制备密度梯度离心管,操作比较繁琐。
密度梯度超速离心的优点是操作简单,不需要制备密度梯度离心管。
缺点是分离效果受离心力的大小和样品的密度影响较大。
密度梯度离心和密度梯度超速离心在原理、应用和优缺点等方面都有所不同。
在选择离心分离技术时,需要根据样品的特性和实验要求来选择合适的离心分离技术。
离心方法和原理差速离心主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。
起始的离心速度较低,让较大的颗粒沉降到管底,小的颗粒仍然悬浮在上清液中。
收集沉淀,改用较高的离心速度离心悬浮液,将较小的颗粒沉降,以此类推,达到分离不同大小颗粒的目的。
密度梯度离心(density gradient centrifugation)用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度,将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部,通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。
这类分离又可分为速度沉降和等密度沉降平衡两种。
密度梯度离心常用的介质为氯化铯,蔗糖和多聚蔗糖。
分离活细胞的介质要求:1)能产生密度梯度,且密度高时,粘度不高;2)PH中性或易调为中性;3)浓度大时渗透压不大;4)对细胞无毒。
密度梯度离心原理不同颗粒之间存在沉降系数差时,在一定离心力作用下,颗粒各自以一定速度沉降,在密度梯度不同区域上形成区带的方法。
密度梯度离心法density gradient centrifugation method〔1〕亦称平衡密度梯度离心法。
用超离心机对小分子物质溶液,长时间加一个离心力场达到沉降平衡,在沉降池内从液面到底部出现一定的密度梯度。
若在该溶液里加入少量大分子溶液,则溶液内比溶剂密度大的部分就产生大分子沉降,比溶剂密度小的部分就会上浮,最后在重力和浮力平衡的位置,集聚形成大分子带状物。
利用这种现象,测定核酸或蛋白质等的浮游密度,或根据其差别进行分析的一种沉降平衡法。
自1958年米西尔逊(M.Meselson),斯塔尔(F.W.Stahl),维诺格拉德(J.Vinograd)成功地分离了〔15N〕DNA和〔14N〕DNA以来,该法取得许多成果。
为得到必要的浓度梯度,多采用浓氯化铯溶液,所以有时也使用氯化铯浓度梯度离心法这个名称,还可采用氯化铷、溴化铯等溶液。
通常利用分析超离心机,但在将细胞颗粒成分进行分离等以纯化为目的的情况,利用密度差,使用分离超离心机,采用预先制备好的蔗糖等的密度梯度。
离心机常用的离心方法一、概述1、根据离心原理,对不同样品的分离选择不同的离心方法。
临床实验室常用的离心方法大致可分为平衡离心法、等密度离心法、经典式沉降平衡离心法等三类。
2、平衡离心法是根据粒子大小、形状不同进行分离的方法,包括差速离心法和速率区带离心法。
3、等密度离心法(又称等比重离心法)是以粒子密度差进行分离的方法。
等密度离心法和上述速率区带离心法合称为密度梯度离心法。
4、经典式沉降平衡离心法主要用于对生物大分子分子量的测定、纯度估计、构象变化等。
二、差速离心法1、差速离心法又称为分步离心法。
根据被分离物的沉降速度不同,采用不同的离心速度和时间进行分步离心。
该法主要用于分离大小和密度差异较大的颗粒。
2、实验室用该方法提取组织或细胞中成分,将破碎的组织或细胞加入离心管中,先低速离心将上清液取出,把大的组织碎片及沉淀物弃掉,然后将上清液放入离心机后,加高转速离心,将小的颗粒分离出来,直至达到所需要的分离纯度为止。
三、密度梯度离心法密度梯度离心法又称为区带离心法。
该法又分为速率区带离心法和等密度区带离心法。
该方法主要用于沉降速度差别不大的微粒,将样品放在一定惰性梯度介质中进行离心沉淀或沉降平衡,在一定离心力下把颗粒分配到梯度液中某些特定位置上,形成不同区带的分离方法。
(一)速率区带离心法1、根据样品中不同组分粒子所具有的不同体积大小和不同的沉降系数将混合样品进行离心分离提纯。
混合样品中不同的组分将在梯度液柱的不同位置分别形成各自的区带,然后将区带取出。
只需通过一次离心就可以把混合样品中的各组分分离提纯,其纯度和回收率可达100%。
2、其优点是一次分离纯化,组分的沉降系数相差20%以上的即可选用此法,分辨力高。
缺点是由于梯度材料的条件限制、样品液浓度不能太高,否则操作条件很难控制。
临床实验室常用Percoll、Ficoll及蔗糖分离液对静脉血中的单个核粒细胞的分离,将分离到的淋巴细胞用做T淋巴细胞及B淋巴细胞的免疫功能测定。
密度梯度离心
一.概念
用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度,将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部,通过重力或离心力场的作用使细胞分层、别离。
二.密度梯度离心与差速离心法的区别
差速离心是一种较为简便的别离法,常用于细胞核和细胞器的别离.因为在密度均一的介质中,颗粒越大沉降越快,反之那么沉降较慢.这种离心方法只能将那些大小有显著差异的组分分开,而且所获得的别离组分往往不很纯;而密度梯度离心那么是较为精细的别离手段,这种方法的关键是先在离心管中制备出蔗糖或氯化铯等介质的浓度梯度并将细胞匀浆装在最上层,密度梯度的介质可以稳定沉淀成分,防止对流混合,在此条件下离心,细胞不同组分将以不同速率沉降并形成不同沉降带。
密度梯度离心与差速离心
离心技术是一种常用于分离混合物中成分的方法。
其中,密度梯度离心和差速离心是两种常见的离心方式。
密度梯度离心是利用不同密度的物质在离心管中分层的原理,将混合物分层分离的方法。
这种离心方法广泛应用于生物化学、生物医学和生命科学的研究中。
其原理是利用离心管中不同密度的物质在离心过程中受到的离心力不同,从而分层分离出各种不同密度的成分。
该方法需要在离心管中加入不同密度的稳定梯度物质,如葡萄糖、碘化物或硝酸铊等,以形成密度梯度。
混合物放置在梯度物质上,离心过程中,样品中的成分会被分层到不同的密度梯度上,从而实现分离。
差速离心是一种离心方法,它通过调节不同速度的旋转离心管来分离混合物中的成分。
该方法适用于分离大小和密度不同的颗粒物质,如细胞、细胞器和病毒等。
差速离心的原理是将混合物放置在离心管中,以一定的速度离心,根据颗粒物质的大小和密度不同,颗粒物质会被分离到不同的位置。
通过调节离心管旋转速度和时间,可以实现不同颗粒物质的分离。
密度梯度离心和差速离心都是离心技术中常用的方法。
两种方法的原理和应用有所不同,需要根据具体的实验目的和样品特性选择适合的离心方法。
在实际应用中,密度梯度离心和差速离心常常结合
使用,以实现更加精确的分离和纯化。
离心技术是一种非常重要的分离方法,密度梯度离心和差速离心是其中比较常用的两种方法。
密度梯度离心适用于分离密度不同的成分,而差速离心适用于分离大小和密度不同的颗粒物质。
在实际应用中,两种方法常常结合使用,以实现更加精确的分离和纯化。