密度梯度离心法取单个核细胞具体方法 ppt课件

2020/12/12
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Ficoll密度梯度离心法分离外周血单 个核细胞(PBMC)的实验方法
单个核细胞浓度(细胞数／1毫升细胞悬液)＝ 4个大方格内细胞总数
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×104×2 （稀释倍数）
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Ficoll密度梯度离心法分离外周血单 个核细胞(PBMC)的实验方法
6.细胞活力检测：死的细胞可被染成兰色，活细胞 不着色。计数200个淋巴细胞。计算出活细胞百 分率。
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密度梯度离心原理
• 不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定 离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降， 在密度梯度不同区域上形成区带的方法。
• 介质梯度应预先形成，介质的最大密度要 小于所有样品颗粒的密度。常用的有蔗糖、 甘油；
• 密度梯度液的制备用梯度混合器，形成由 管口到管底逐步升高的密度梯度。
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活细胞百分率＝
活细胞数 总细胞数
×100％
用本法分离PBMC，纯度在90％以上，收获率可达 80～90％，活细胞百分率在95％以上。
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Ficoll密度梯度离心法分离外周血单 个核细胞(PBMC)的实验方法
二、试剂和材料 比重1.077±0.001的聚蔗糖-泛影葡胺(商品名为淋巴细胞
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密度梯度离心可用来分离核酸、蛋 白质、核糖体亚基及其它成分。
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密度梯度离心法
• 也称“平衡密度梯度离心法”：用超离心机对小 分子物质溶液，长时间加一个离心力场达到沉降 平衡，在沉降池内从液面到底部出现一定的密度 梯度。若在该溶液里加入少量大分子溶液，则溶 液内比溶剂密度大的部分就产生大分子沉降，比 溶剂密度小的部分就会上浮，最后在重力和浮力 平衡的位置，集聚形成大分子带状物。利用这种 现象，测定核酸或蛋白质等的浮游密度，或根据 其差别进行分析的一种沉降平衡法。
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蔗糖密度梯度离心法
• 采用蔗糖等一些小分子溶液，预先在分离超离心 机的样品地内制备出密度梯度，在其上面再加上 一层少量的大分子溶液后，离心，大分子就形成 层状而沉降。若含有沉降系数不同的许多成分， 就会出现许多层。这种情况采用适当的编排号码， 取出样品池内的溶液，然后进行研究。这是与密 度梯度离心法不同的一种沉降速度法，除了以相 同的目的被用于通常的沉降速度法外，在能取出 分离物这点上是有优越性的。因多采用蔗糖密度 梯度，所以亦称为蔗糖密度梯度离心法。按同样 原理，也可使用分析超离心机进行测定。
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实验所需试剂的配置方法
一、Hank‘s液(无Ca２＋、Mg２＋)配制法
NaCl ： 8.0 克
KCl ： 0.4 克
Na２HPO４·12H２O ： 0.12 克
KH２HPO４：0.06克
分离液)。 Hank's液(无Ca２＋、Mg２＋) 10％小牛血清RPMI1640 0.2％台酚兰染色液，用生理盐水或等渗的PBS配制。 肝素用Hank‘s液或生理盐水稀释成500单位／ml，牽9凝
人外周血肝素用量约为50单位／1毫升血。 短中管、毛细滴管、1毫升和10毫升刻度吸管。 无菌干燥注射器针头。 血球计数板、显微镜、水平式离心机。 碘酒，75％酒精，无菌棉球，镊子，橡皮止血带。
• 目前比较常用ficoll密度梯度法。
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Ficoll密度梯度离心法分离外周血单 个核细胞（PBMC）的实验方法
一、步骤 1. 在短中管中加入适量淋巴细胞分离液。 2. 取肝素抗凝静脉血与等量Hank‘s液或RPMI1640 充分混
匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚 的界面。水平离心2000rpm×20分钟。 3. 离心后管内分为三层，上层为血浆和Hank‘s液， 下层主 要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在上、中 层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，单 个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外，还含有血小板。
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Ficoll密度梯度离心法分离外周血单
个核细胞(PBMC)的实验方法
4.用毛细血管插到云雾层，吸取单个核细胞。 置入另一短中管中，加入５倍以上体积的 Hank‘s液或RPMI1640，1500rpm×10分钟， 洗涤细胞两次。
5.末次离心后，弃上清，加入含有10％小牛 血清的RPMI1640，重悬细胞。取一滴细胞 悬液与一滴0.2％台盼兰染液混合，于血球 计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。
密度梯度离心法取单个核细胞
2020/• 密度梯度离心法又称为区带离心法，可以 同时使样品中几个或全部组分分离，具有 良好的分辨率。离心时先将样品溶液置于 一个由梯度材料形成的密度梯度液体柱中， 离心后被分离组分以区带层分布于梯度柱 中。
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精品资料
• 你怎么称呼老师？
• 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你 是否会认为老师的教学方法需要改进？
• 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ • 教师的教鞭
• “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我 笨，没有学问无颜见爹娘 ……”
• “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
密度梯度离心法
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Ficoll密度梯度离心法分离外周血单 个核细胞(PBMC)的实验方法
三、注意事项 • 抽取人外周静脉血时要注意无菌操作。 • 操作全程应尽可能短时间内完成，以免增加死细
胞数。 • 用淋巴细胞分离液分离PBMC时，离心机转速的
增加和减少要均匀、平稳，使保持清晰的界面。
• 小鼠、兔等动物淋巴细胞比重与人不同，配制相 应密度的Percoll或不同比例的聚蔗糖和泛影葡胺。
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分离活细胞的介质要求
• 1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不 高；
• 2）PH中性或易调为中性； • 3）浓度大时渗透压不大； • 4）对细胞无毒。
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密度梯度离心法应用
• 利用密度梯度离心的原理，用ficoll液或 precoll液分离和纯化人或动物外周血单个核 细胞（PBMC）。