密度梯度离心法-是利用不同颗粒之间存在沉降系数差,在一定离心力作用下

实验一密度梯度离心法提取叶绿体探索新鲜菠菜叶片叶绿体的分离纯化及其叶绿体蛋白质提取方法，为深入研究甘蔗叶绿体蛋白质组学奠定基础。

以叶片为材料，通过差速离心法制备粗叶绿体制品，分别利用蔗糖密度梯度离心和Percoll梯度离心进一步分离纯化完整叶绿体；提取叶绿体蛋白质，并进行电泳分析。

两种密度梯度离心法均可获得纯度和完整率较高的叶绿体，但蔗糖密度梯度离心法具有分离时间较短、成本较低，分离的叶绿体完整率、纯度和含量高等特点，并且提取的叶绿体蛋白质电泳条带清晰,蛋白质数量多且较全。

与Pecoll梯度离心法相比，蔗糖密度梯度离心法更适宜于在亚细胞水平上进行甘蔗蛋白质组学研究。

1 实验目的掌握手工制作密度梯度技术，了解蔗糖密度梯度离心的原理及优缺点。

2 实验原理密度梯度离心就是通过扩散法用相同的缓冲液把梯度介质配成不同浓度的梯度液，采用上铺法（或下铺法）将密度最大的梯度液置于离心管的底部，而把密度最小的梯度液铺在梯度的最上层，然后经之一段时间（最好放在与离心管温度相同的温度下，一般为24小时），让密度梯度溶质扩散，最后形成一种较为平坦的梯级梯度。

然后在密度梯度介质液柱的顶部铺上一层样品溶液，在离心期间，样品中的各种亚细胞组分会按照它们各自的沉降速度，被分成一系列的样品区带离心。

这种离心方法的基本依据是利用样品颗粒或大分子的不同沉降速率从而达到分离的目的。

密度梯度的作用在于一方面支撑样品溶液，另一方面用来稳定区带以防离心期间梯度柱中产生的对流对它的破坏。

颗粒在梯度中移动的快慢。

取决于它们的大小、形状、密度和离心力以及梯度介质的密度和黏度。

在含有不同颗粒的混合样品中，各种颗粒的移动是相互独立的，因此在各种颗粒的S值相差很小的情况下也能达到分离目的。

用两种或若干种浓度的蔗糖制成的梯度，在离心条件下，叶绿体和比它沉降系数小的细胞组分聚集到梯度交界处，而沉降系数较大的细胞组分沉到离心管底部。

通过这种方法可粗略的分离叶绿体。

病毒的超速离心纯化实验目的超速离心法纯化A型禽流感病毒。

实验原理不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。

此法的优点是：（1）分离效果好，可一次获得较纯颗粒；（2）适应范围广，能象差速离心法一样分离具有沉降系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度差的颗粒；（3）颗粒不会挤压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。

实验设备和材料专用的超离管、蔗糖配置管，长注射器（以上器材用酒精浸泡过夜，烘干待用）操作步骤蔗糖密度梯度的配制：用已高压的去离子水配制不同浓度的蔗糖，并用22 um滤器过滤。

蔗糖梯度柱长度一般为12 cm，每个梯度蔗糖层长约3 cm即蔗糖溶液体积为3 mL左右，病毒粒子停留的蔗糖密度层应该适当的增大，每个梯度蔗糖所配总体积为20 mL，不需要100 mL。

30%蔗糖溶液配制：去离子水中加入30 g蔗糖，定容到100 mL即可。

1. 病毒的增殖使用SPF鸡胚接毒，共收集150 mL左右病毒尿囊液。

具体如下：取37 ℃培养的9～11日龄SPF鸡胚15个左右。

向各尿囊腔中接种0.2mL储存的AIV（接种病毒液是否需要稀释，应根据病毒毒力的强弱以及实验需求而定。

此法是为增殖病毒，假若接种强毒，则需要根据毒力稀释相应倍数，以便能增殖更多病毒，于37 ℃下继续孵育，每隔12 h照胚一次，弃掉24 h内死亡鸡胚。

24 h后的死胚放4℃过夜，HA 效价7孔，收集尿囊液，直到96 h后收获剩下鸡胚尿囊液，不同时段收集的尿囊液可混合在一起，暂时存放可放-20℃，长时间存放则放于-40℃或-80℃。

2. 取反复冻融后的病毒液10 mL，在10000 r/min、4℃下离心30min，留上清，并测上清HA。

3. 超离：把已经离心处理好的病毒尿囊液装入超离管（实验室超离管体积为30 mL），超离管内不能有气泡，以免超离过程爆破。

离心转速根据病毒粒子直径而定，新城疫病毒尿囊液以40000 r/min 4℃下离心5 h。

密度梯度离心法的原理解析密度梯度离心法是一种广泛应用于生物化学、分子生物学和医学领域的实验技术，用于分离和纯化生物大分子、细胞和次细胞结构。

该方法基于样品中不同组分的密度差异，利用离心力和密度梯度分离的原理来实现。

密度梯度离心法的原理可以简单概括为以下几个步骤：1. 密度梯度制备：制备一个由多个密度层构成的梯度液体。

这些密度层是根据密度逐渐增加或减少排列的，通常由离心管或离心管中的夹层形成。

常用的密度梯度制备物质包括蔗糖、葡萄糖或碘化物等。

2. 样品处理：将待分离的样品加入到密度梯度中。

样品可以是生物大分子如蛋白质、核酸或多肽，也可以是细胞或次细胞结构如细胞核或线粒体等。

3. 离心分离：通过高速离心设备，施加离心力将密度梯度中的样品分离。

离心过程中，样品中的各个组分受到的离心力不同，根据其密度的差异在密度梯度中上下移动。

离心力越大，移动距离越远。

4. 提取和分析：离心分离后，不同密度层中的组分被提取出来，然后进一步进行分析。

这可以是采用分光光度法、蛋白质电泳、质谱分析或核酸杂交等技术。

通过分析不同密度层中的组分，可以获取样品中各种生物大分子或细胞结构的纯度和数量信息。

密度梯度离心法的优点是可以实现高分辨率和高效率的分离和纯化。

这是因为，不同密度的组分在离心力的作用下可以根据其密度差异均匀地分布在梯度液体中，从而实现准确分离。

该方法对样品体积和细胞大小没有特别严格的要求，适用于分离和研究多种不同类型的生物样品。

密度梯度离心法还可以用于研究细胞功能和结构的多个方面。

它可以用于分离不同亚细胞器如线粒体、内质网和高尔基体等，进一步研究它们的功能和组成。

该方法还可用于分离和纯化蛋白质复合物、染色体和病毒等，为进一步研究它们的生理和生化特性提供有力的工具。

总结和回顾上述内容，密度梯度离心法是一种基于样品中不同组分密度差异的分离和纯化技术。

它可以通过制备密度梯度、施加离心力和分析不同密度层中的组分来实现。

该方法具有高分辨率、高效率和广泛适用性的优点，可用于研究多种生物样品的分离和纯化，以及细胞和亚细胞结构的功能和组成研究。

《生物分离工程》练习题二（第4~5章）一、选择题（22分）1、以下哪项不是在重力场中，颗粒在静止的流体中降落时受到的力（ B ）A.重力B. 压力C.浮力D. 阻力2、颗粒与流体的密度差越小，颗粒的沉降速度（ A ）A.越小B.越大C.不变D.无法确定3、等密度区带离心的密度梯度中最大密度（ A ）待分离的目标产物的密度。

A.大于B.小于C.等于D.以上均可4、差速区带离心的密度梯度中最大密度（ B ）待分离的目标产物的密度。

A.大于B.小于C.等于D.以上均可5、以下各物质可用于密度梯度离心介质的是（ D ）。

A.蔗糖B.聚蔗糖C.氯化铯D.以上均可6、当两种高聚物水溶液相互混合时，二者之间的相互作用不可能产生（D）A. 互不相溶，形成两个水相B. 两种高聚物都分配于一相，另一相几乎全部为溶剂水C. 完全互溶，形成均相的高聚物水溶液D. 形成沉淀7、超临界流体萃取中，如何降低溶质的溶解度达到分离的目的（C）A.降温 B升高压力 C.升温 D.加入夹带剂8、物理萃取即溶质根据（B）的原理进行分离的A.吸附B.相似相溶 C分子筛 D 亲和9、超临界流体萃取法适用于提取（ B ）A、极性大的成分B、极性小的成分C、离子型化合物D、亲水性成分10、在萃取液用量相同的条件下，下列哪种萃取方式的理论收率最高（C）A.单级萃取B.三级错流萃取C.三级逆流萃取D.二级逆流萃取11、关于萃取下列说法正确的是（C）A. 酸性物质在酸性条件下萃取 B碱性物质在碱性条件下萃取C. 两性电解质在等电点时进行提取D. 两性电解质偏离等电点时进行提取12、液一液萃取时常发生乳化作用，如何避免（D）A.剧烈搅拌 B低温 C.静止 D.加热13、在葡聚糖与聚乙二醇形成的双水相体系中，目标蛋白质存在于（A）A.上相 B下相 C.葡聚糖相 D.以上都有可能14、超临界流体萃取中，如何降低溶质的溶解度达到分离的目的（C）A.降温 B升高压力 C.升温 D.加入夹带剂15、关于反萃取的概念，下列说法正确的是：（A）。

第二章发酵液的预处理和固液分离的方法一、名词1、凝聚：凝聚作用就是向胶体悬浮液中加入某种电解质，在电解质中异电离子作用下，胶粒的双电层电位降低，使胶体体系不稳定，胶体粒子间因相互碰撞而产生凝集（1mm左右）的现象。

2、絮凝：是指在某些高分子絮凝剂存在下，基于桥架作用，当一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同的胶粒表面上，产生桥架联接时，形成粗大的絮凝团（10mm）的过程。

絮凝是一种以物理的集合为主的过程。

3、混凝：对于非离子型和阴离子型高分子絮凝剂通常会与无机电解质凝聚剂搭配使用。

在发酵液中首先加入无机电解质凝聚剂，使得悬浮粒子间的相互排斥能降低，脱稳而凝聚成微粒，然后再加入絮凝剂，通过分子间引力和氢键作用产生吸附架桥形成絮凝团的过程。

这种包括凝聚和絮凝机理的过程称为混凝。

4、亲和絮凝：利用絮凝剂和细胞膜表面某种组分间具有的专一性亲和连接作用而产生吸附架桥。

如硼酸盐（四硼酸纳）可与多羟基的糖类化合物（甘露糖醇、山梨糖醇）发生专一性亲和连接作用而产生吸附架桥。

5、凝聚价：电解质的凝聚能力可用凝聚价或凝聚值来表示，使胶粒发生凝聚作用的最小电解质浓度（毫摩尔／升）6、过滤：过滤是借助过滤介质，将悬浮在发酵液中的固体颗粒与液体进行分离的过程。

7、质量比阻：衡量过滤特性的主要指标是滤饼的质量比阻（r B），表示单位滤饼厚度的阻力系数，与滤饼结构特性有关。

8、离心技术：离心技术是借助离心机旋转所产生的离心力，对具有不同沉降系数或浮力密度的物质进行分离、浓缩和提纯的一项技术；其目的是达到固-液或液-液的分离。

9、分离因子（Z）：离心力/重力加速度(g)的比值，也称为相对离心力(RCF)。

衡量离心程度的一个参数,用于离心机的分类。

10、沉降系数：指单位离心力作用下颗粒沉降的速度。

一般用斯维德贝格单位(Svedbergs) S 表示，1S =10−13s。

11、壁效应：由于溶剂在层析容器周壁附近流动不均匀造成分离区带在边缘部分扩散和弯曲的现象。

差速离心法和密度梯度离心法的区别教学问题：高中生物必修1中研究细胞器的分离方法是差速离心法，必修2中研究DNA复制方式——半保留复制的方法是密度梯度离心法，两者之间有什么区别？一、差速离心法差速离心法是交替使用低速和高速离心，用不同强度的离心力使具有不同质量的物质分级分离的方法。

此法适用于混合样品中各沉降系数差别较大组分的分离。

1．工作原理通常两个组分的沉降系数差在10倍以上时可以用此法分离。

例如某样品中有大、中、小三个组分，用差速离心法分离时，把样品放在离心管内，先按大组分的沉降系数选择离心转速和离心时间，当离心结束时正好使大组分全部沉降到离心管底部，这时中小组分中的一部分也会沉降到底部。

若原始样品液中三个组分的含量相等，则在原始样品液中大组分占总组分量的三分之一。

通过一次离心后分离出的大组分沉淀占总组分量约90%。

如要进一步提纯可以把此沉淀物再溶解，再按大组分的沉降条件离心，得到大组分的第二次离心沉淀。

通过多次对沉淀和上清液差速离心，可以把三个沉降系数有差别的组份分离提纯，所以这个方法又称为分步离心法。

2．差速离心法的优缺点差速离心法的优点是样品的处理量较大，可用于大量样品的初分离。

其缺点是分离复杂样品和要求分离纯度较高时，离心次数多，操作繁杂。

由于沉淀的多次清洗、溶解、再沉淀，容易引起中间损失，所以离心分辨力差。

实际分离时由于离心时的对流、扩散和收取沉淀时的污染，对于一些沉降系数相差不大的组分无法进行完全的分离提纯。

产品的纯度和回收率都达不到上述理论值。

因此差速离心法主要用于大量样品的初步分离提纯。

二、密度梯度离心法密度梯度离心法又称为区带离心法，可以同时使样品中几个或全部组分分离，具有良好的分辨率。

离心时先将样品溶液置于一个由梯度材料形成的密度梯度液体柱中，离心后被分离组分以区带层分布于梯度柱中。

1．工作原理不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。

离心方法和原理差速离心主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。

起始的离心速度较低，让较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒仍然悬浮在上清液中。

收集沉淀，改用较高的离心速度离心悬浮液，将较小的颗粒沉降，以此类推，达到分离不同大小颗粒的目的。

密度梯度离心（density gradient centrifugation）用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。

这类分离又可分为速度沉降和等密度沉降平衡两种。

密度梯度离心常用的介质为氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖。

分离活细胞的介质要求：1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；2）PH中性或易调为中性；3）浓度大时渗透压不大；4）对细胞无毒。

密度梯度离心原理不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。

密度梯度离心法density gradient centrifugation method〔1〕亦称平衡密度梯度离心法。

用超离心机对小分子物质溶液，长时间加一个离心力场达到沉降平衡，在沉降池内从液面到底部出现一定的密度梯度。

若在该溶液里加入少量大分子溶液，则溶液内比溶剂密度大的部分就产生大分子沉降，比溶剂密度小的部分就会上浮，最后在重力和浮力平衡的位置，集聚形成大分子带状物。

利用这种现象，测定核酸或蛋白质等的浮游密度，或根据其差别进行分析的一种沉降平衡法。

自1958年米西尔逊（M．Meselson），斯塔尔（F．W．Stahl），维诺格拉德（J．Vinograd）成功地分离了〔15N〕DNA和〔14N〕DNA以来，该法取得许多成果。

为得到必要的浓度梯度，多采用浓氯化铯溶液，所以有时也使用氯化铯浓度梯度离心法这个名称，还可采用氯化铷、溴化铯等溶液。

通常利用分析超离心机，但在将细胞颗粒成分进行分离等以纯化为目的的情况，利用密度差，使用分离超离心机，采用预先制备好的蔗糖等的密度梯度。

密度梯度离心法density gradient centrifugation method，为得到必要的浓度梯度，可采用浓氯化铯溶液，也可以采用蔗糖等一些小分子溶液，预先在分离超离心机的样品地内制备出密度梯度，在其上面再加上一层少量的大分子溶液后，离心，大分子就形成层状而沉降。

不连续密度蔗糖梯度离心液一般可以采用优级纯的蔗糖用超纯水配制成百分比浓度分别为16.1%、37.4%、45%的蔗糖溶液，从离心管底部逐层向上铺设。

也有用8层Feicoll梯度离心,即在14mL离心管中由下至上从84％到35％Feicoll液，按7％递减，各加1．0mL，形成7层Feicoll 梯度。

连续密度蔗糖梯度离心液则需要用专用仪器配制。

密度梯度离心又称速率—区带离心,沉降系数较接近的物质分离的方法；原理：不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。

介质梯度应预先形成，介质的最大密度要小于所有样品颗粒的密度。

常用的有蔗糖、甘油；密度梯度液的制备用梯度混合器，形成由管口到管底逐步升高的密度梯度；操作：离心前将样品小心铺放在密度梯度溶液表面，离心形成区带。

离心后不同大小、不同形状、有一定沉降系数差异的颗粒在密度梯度液中形成若干条界面清楚的不连续区带；可用来分离核酸、蛋白质、核糖体亚基及其它成分〔1〕亦称平衡密度梯度离心法。

用超离心机对小分子物质溶液，长时间加一个离心力场达到沉降平衡，在沉降池内从液面到底部出现一定的密度梯度。

若在该溶液里加入少量大分子溶液，则溶液内比溶剂密度大的部分就产生大分子沉降，比溶剂密度小的部分就会上浮，最后在重力和浮力平衡的位置，集聚形成大分子带状物。

利用这种现象，测定核酸或蛋白质等的浮游密度，或根据其差别进行分析的一种沉降平衡法。

自1958年米西尔逊（M．Meselson），斯塔尔（F．W．Stahl），维诺格拉德（J．Vinograd）成功地分离了〔15N〕DNA和〔14N〕DNA 以来，该法取得许多成果。

《生物分离工程》复习题一（第1~3章）二、填空题1、Cohn方程logS=β-KsI中，Ks越大，β值越小，盐析效果越好。

2、固液分离的主要方法有离心和过滤。

3、对发酵液进行预处理方法主要有加热法、调节PH值、凝聚和絮凝、使用惰性助助滤剂、加入反应剂。

4、根据过滤机理的不同，过滤操作可分为澄清过滤和滤饼过滤两种类型5、盐析的操作方法有加入固体盐、加入饱和溶液法、透析平衡法。

6、核酸的沉淀方法主要有有机溶剂沉淀法、等电点沉淀发、钙盐沉淀法、溶剂沉淀法。

7、蛋白质胶体溶液的稳定性主要靠蛋白质分子间静电排斥作用、蛋白质周围的水化层等因素稳定。

8、为使过滤进行的顺利通常要加入惰性助滤剂。

9、典型的工业过滤设备有半框压滤机和真空转鼓过滤机。

10、常用的蛋白质沉析方法有盐析、等电点和有机溶剂。

二、填空1、常用离心设备可分为离心沉降和离心过滤两大类；2、在一个转子中，将粒子沉降下来的效率可以用 K系数来描述。

3、超离心法是根据物质的沉降系数、质量和形状不同，应用强大的离心力，将混合物中各组分分离、浓缩、提纯的方法。

4、密度梯度离心中，制备密度梯度的常用方法有手工法、梯度混合仪法、离心形成法。

5、阳离子交换树脂按照活性基团分类，可分为强酸型、弱酸型和中等强度；其典型的活性基团分别有磺酸基团、羧基和磷酸基。

7、蛋白质分离常用的层析方法有凝胶层析、多糖基离子交换、亲和层析和疏水层析。

8、离子交换分离操作中，常用的梯度洗脱方法有 PH梯度和离子强度梯度。

10、多糖基离子交换剂包括葡集团离子交换剂和离子交换纤维素两大类。

11、离子交换树脂由载体、活性基团和可交换离子组成。

12、DEAE Sepharose是阴离子交换树脂，其活性基团是二乙基氨基乙基。

13、CM Sepharose是阳离子交换树脂，其活性基团是羧甲基。

14、离子交换操作一般分为动态和静态两种。

15、利用薄层定量测定时，一般控制待测组分的Rf在 0.2-0.5 之间。

密度梯度离心法density gradient centrifugation method，为得到必要的浓度梯度，可采用浓氯化铯溶液，也可以采用蔗糖等一些小分子溶液，预先在分离超离心机的样品地内制备出密度梯度，在其上面再加上一层少量的大分子溶液后，离心，大分子就形成层状而沉降。

不连续密度蔗糖梯度离心液一般可以采用优级纯的蔗糖用超纯水配制成百分比浓度分别为16.1%、37.4%、45%的蔗糖溶液，从离心管底部逐层向上铺设。

也有用8层Feicoll梯度离心,即在14mL离心管中由下至上从84％到35％Feicoll液，按7％递减，各加1．0mL，形成7层Feicoll 梯度。

连续密度蔗糖梯度离心液则需要用专用仪器配制。

密度梯度离心又称速率—区带离心,沉降系数较接近的物质分离的方法；原理：不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。

介质梯度应预先形成，介质的最大密度要小于所有样品颗粒的密度。

常用的有蔗糖、甘油；密度梯度液的制备用梯度混合器，形成由管口到管底逐步升高的密度梯度；操作：离心前将样品小心铺放在密度梯度溶液表面，离心形成区带。

离心后不同大小、不同形状、有一定沉降系数差异的颗粒在密度梯度液中形成若干条界面清楚的不连续区带；可用来分离核酸、蛋白质、核糖体亚基及其它成分〔1〕亦称平衡密度梯度离心法。

用超离心机对小分子物质溶液，长时间加一个离心力场达到沉降平衡，在沉降池内从液面到底部出现一定的密度梯度。

若在该溶液里加入少量大分子溶液，则溶液内比溶剂密度大的部分就产生大分子沉降，比溶剂密度小的部分就会上浮，最后在重力和浮力平衡的位置，集聚形成大分子带状物。

利用这种现象，测定核酸或蛋白质等的浮游密度，或根据其差别进行分析的一种沉降平衡法。

自1958年米西尔逊（M．Meselson），斯塔尔（F．W．Stahl），维诺格拉德（J．Vinograd）成功地分离了〔15N〕DNA和〔14N〕DNA以来，该法取得许多成果。

密度梯度离心法原理密度梯度离心法原理密度梯度离心法是一种常用的生物化学分离技术，它基于样品中不同成分的密度差异，利用高速旋转的离心机产生的离心力将样品分离成不同密度梯度层次。

该技术广泛应用于细胞、蛋白质、核酸等生物大分子的纯化和富集。

一、密度梯度离心法基本原理密度梯度离心法基于样品中不同成分的密度差异，通过制备一定浓度的稠密溶液，使得样品在这个溶液中形成一个连续的密度梯度。

当这个样品在高速旋转的离心机中受到离心力作用时，样品中不同成分会沉降到不同位置形成层次。

二、浓缩溶液制备为了制备稠密溶液，需要选择合适的浓缩剂。

常见浓缩剂包括葡聚糖（如Ficoll）、聚乙二醇（PEG）、硫酸铁铵等。

这些浓缩剂具有高分子量和高比重，可以形成连续的密度梯度。

在制备稠密溶液时，需要按照浓缩剂的浓度要求将其溶于缓冲液中，并进行充分混合。

三、样品制备在进行密度梯度离心前，需要对样品进行处理。

对于细胞，可以先将其离心收集，去除培养基或组织液等无关物质。

对于蛋白质或核酸等大分子，可以通过加入盐、有机溶剂等方式使其沉淀。

处理后的样品应该在浓缩剂上方均匀地滴加，并轻轻摇晃使其充分混合。

四、离心操作在样品滴加完成后，需要将样品放入高速离心机中进行旋转。

旋转时间和速度取决于样品的性质和浓缩剂的类型和浓度。

一般来说，旋转速度越快，分离效果越好。

当离心结束后，可以用移液管从不同层次采集样品。

五、应用密度梯度离心法广泛应用于生物大分子的纯化和富集。

例如，在蛋白质纯化中，可以利用Ficoll或PEG等浓缩剂制备密度梯度，将蛋白质从杂质中分离出来。

在细胞分离中，可以利用硫酸铁铵等浓缩剂制备密度梯度，将不同类型的细胞分离出来。

六、优点和局限性密度梯度离心法具有高效、简单、操作方便等优点。

但是其局限性也很明显，例如需要选择合适的浓缩剂和样品处理方法，且对于某些大分子可能会出现聚集现象。

因此在实际应用中需要根据样品的特性进行调整。

七、总结密度梯度离心法是一种常见的生物化学分离技术，基于样品中不同成分的密度差异，利用高速旋转的离心机产生的离心力将样品分离成不同密度梯度层次。

蔗糖密度梯度离心一实验目的掌握手工制作密度梯度的技术，了解蔗糖密度梯度离心的原理及优缺点。

二实验原理2.1概述密度梯度区带离心法（简称区带离心法）：是将样品加在惰性梯度介质中进行离心沉降或沉降平衡，在一定的离心力下把颗粒分配到梯度中一些特定位置上，形成不同区带的分离方法。

此法的优点是：①分离效果好，可一次获得较纯颗粒；②适应范围广，能像差速离心法一样分离具有沉降系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度差的颗粒；③颗粒不会挤压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。

此法的缺点是：①离心时间较长；②需要制备惰性梯度介质溶液；③操作严格，不易掌握。

密度梯度区带离心法又可分为两种：（1）差速区带离心法：当不同的颗粒间存在沉降速度差时（不需要像差速沉降离心法所要求的那样大的沉降系数差）。

在一定的离心力作用下，颗粒各自以一定的速度沉降，在密度梯度介质的不同区域上形成区带的方法称为差速区带离心法。

此法仅用于分离有一定沉降系数差的颗粒（20% 的沉降系数差或更少）或分子量相差3倍的蛋白质，与颗粒的密度无关，大小相同，密度不同的颗粒（如线粒体，溶酶体等）不能用此法分离。

离心管先装好密度梯度介质溶液，样品液加在梯度介质的液面上，离心时，由于离心力的作用，颗粒离开原样品层，按不同沉降速度向管底沉降，离心一定时间后，沉降的颗粒逐渐分开，最后形成一系列界面清楚的不连续区带，沉降系数越大，往下沉降越快，所呈现的区带也越低，离心必须在沉降最快的大颗粒到达管底前结束，样品颗粒的密度要大于梯度介质的密度。

梯度介质通常用蔗糖溶液，其最大密度和浓度可达1.28kg/cm3和60％。

此离心法的关键是选择合适的离心转速和时间（2）等密度区带离心法：离心管中预先放置好梯度介质，样品加在梯度液面上，或样品预先与梯度介质溶液混合后装入离心管，通过离心从而形成梯度，这就是预形成梯度和离心形成梯度的等密度区带离心产生梯度的二种方式。

区带离心名词解释
区带离心是使用区带转子的离心方法。

区带离心又称密度梯度离心，是使待分离样品在密度梯度介质中进行离心沉降或沉降平衡,最终分配到梯度中某些特定位置上,形成不同区带的分离方法。

区带离心又分为差速区带离心和平衡区带离心。

差速区带离心适用于物质密度大于密度梯度最大密度；平衡区带离心适用于物质密度小于密度梯度最大密度。

区带离心是研究生物大分子的基本方法。

区带离心原理是将分离样品添加在梯度介质的液面上，当样品中不同颗粒间存在沉降速度差时，在一定的离心力作用下，大小、重量不同的颗粒将各自以一定的速度沉降，离心一段时间之后，不同沉降系数的样品颗粒逐渐分开，最后在密度梯度介质中形成一系列分界清晰的不连续区带。

密度梯度离心原理密度梯度离心原理是一种用于分离混合物中不同密度成分的物理过程。

它基于离心力对物质产生的分离作用，并且利用样品溶液中不同物质的密度差异来完成分离。

这种原理广泛应用于生物化学、生物工程、材料科学等领域，被广泛用于制备纯度高的生物分子、蛋白质、细胞和颗粒。

密度梯度离心原理的基本概念是通过参与离心过程的物质在离心管中形成密度梯度，并将样品加入到这个密度梯度中。

离心过程中，样品中不同密度成分受到离心力的作用，会在离心管中下沉或上浮，最终达到分离的目的。

在实际应用中，通过选择合适的离心材料和调整离心速度，可以控制生成的密度梯度。

常用的离心材料包括蔗糖、重碳酸铯和多聚乙二醇等。

这些离心材料的密度在离心过程中形成了一个密度梯度，离心条件控制得当时，样品中的不同成分会在梯度中沉降或上浮，形成不同的层次。

密度梯度离心原理可用于分离混合物中不同种类的生物分子，例如蛋白质。

在密度梯度离心过程中，通过选择合适的离心材料和离心速度，可以使蛋白质按照其密度大小在离心管中分层沉积。

稍重的蛋白质会下沉到密度梯度较为重的位置，而较轻的蛋白质则上浮到密度较轻的位置。

通过收集不同层次的蛋白质，可以实现对其有效的分离和富集。

密度梯度离心原理还可以用于分离细胞和颗粒。

细胞是生物体的基本结构单位，其密度与胞器、细胞类型和状态变化密切相关。

通过密度梯度离心，可以将样品中的不同类型的细胞有效地分离开来。

在离心过程中，较重的细胞下沉到密度梯度较重的位置，而轻的细胞上浮到密度较轻的位置。

这样就可以得到纯度较高的特定类型的细胞。

与细胞类似，颗粒也可以通过密度梯度离心进行分离。

颗粒是一种微小的固体物质，其密度也与其组成材料有关。

在离心过程中，不同密度的颗粒会根据其密度大小在离心管中形成层次。

通过调整离心条件，可以分离出不同密度的颗粒。

密度梯度离心是一种简单快速的物质分离方法，具有无损伤、无特殊设备要求、可大批量分离等特点。

因此，在生物化学研究中广泛应用于细胞分离、蛋白质富集、基因分析等领域。

Ficoll密度梯度离心法-是利用不同颗粒之间存在沉降系数差，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带Ficoll密度梯度离心法-是利用不同颗粒之间存在沉降系数差，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带，根据血液中各成分比重的不同：红细胞>中性粒细胞>淋巴细胞>单核细胞>血浆(包括血小板)，用Ficoll-Paque单核细胞分离液(相对密度为 1.077±0.001，介于中性粒细胞与淋巴细胞之间)将脐血细胞分成不同的层次。

学术术语来源——人脐血间充质干细胞培养方法的比较文章亮点：1 以软骨组织工程技术种子细胞为研究方向，选取人脐血为实验材料，利用密度梯度离心法分离出脐血单核细胞，并分别应用MesenGro人间充质干细胞培养基和DMEM培养基贴壁培养进行分离纯化脐血间充质干细胞，结果提示在培养间充质干细胞的数量、形态、生长速度和培养时间诸方面，MesenGro人间充质干细胞培养基均优于DMEM培养基。

2 对两种培养方法进行比较，掌握了人脐血间充质干细胞体外培养的适宜条件和方法，为下一步诱导脐血间充质干细胞成软骨分化和动物实验打下基础，为软骨组织工程技术研究提供了一定的理论和实验支持。

关键词：干细胞；脐带脐血干细胞；体外培养；脐血；间充质干细胞； MesenGro人间充质干细胞培养基；DMEM培养基；广东省自然科学基金主题词：胎血；间质干细胞；培养基；细胞，培养的摘要背景：脐血中含丰富的间充质干细胞，可以作为组织工程中一种新的种子细胞来源。

目的：应用两种培养基体外培养、扩增、分离纯化脐血间充质干细胞，比较其生物学特性的差异。

方法：无菌条件下采取40份足月顺产的脐血，肝素抗凝。

应用Ficoll密度梯度离心法分离脐血单核细胞，随机分为两组，其中20份用MesenGro人间充质干细胞培养基进行培养，20份用DMEM培养基进行培养。

实验一密度梯度离心法提取叶绿体[实验项目]密度梯度离心法提取叶绿体[实验目的]掌握手工制作密度梯度技术，了解蔗糖密度梯度离心的原理及优缺点。

[实验原理]不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带。

用不同浓度的蔗糖制成浓度梯度，在离心条件下，叶绿体和比他沉降系数小的细胞组分会聚集中到梯度交界处，而沉降系数较大的细胞组分则沉淀到离心管底部，这样可粗略的分离叶绿体。

[实验仪器设备]超速冷冻离心机（BECKMAN L8-60MR）一台荧光显微镜（(Olympus，FX-35WA，Japan)）一台组织捣碎机一台[实验材料]新鲜菠菜叶片[实验药品]匀浆介质(0.25mol/L蔗糖，0.05mol/L Tris-HCl缓冲液 pH 7.4)；称取88.55g 蔗糖，6.05g Tris，溶解在近800ml蒸馏水中，加入约4.25ml 0.1mol/L HCl，最后定容至1000ml。

60%蔗糖溶液，50%蔗糖溶液，40%蔗糖溶液，20%蔗糖溶液，15%蔗糖溶液。

[实验内容]1、洗净菠菜叶片，沥干水分，去除叶柄、主脉，称取50g，剪碎。

2、加入预冷到0℃的匀浆介质200ml，用组织捣碎机高档捣碎2min。

3、捣碎液双层纱布过滤到烧杯中。

4、滤液500r/min离心5min，轻取上清液。

5、在Polyallomer离心管内一次加入50%和15%蔗糖溶液（或依次加入60%，40%，20%，15%蔗糖溶液），注意要用滴管吸取15%蔗糖液沿离心管壁缓缓注入，不能搅动50%蔗糖液面，一般两种溶液各加12ml（四个梯度各加6ml），加液完成后，可见两种溶液接口处折光稍有不同，这样密度梯度便制好了。

6、在制好的密度梯度上小心的沿着管壁加入3ml粗离心过的上清液。

7、严格平衡离心管，分量不足加入少许上清液。

8、用甩平转头离心（18000r/min）90min。

9、取出离心管，可见叶绿体在密度梯度液中间形成带，用滴管轻轻吸出滴于载玻片，盖上盖玻片，荧光显微镜下观察。

实验室离心机常用的离心方法1.差速离心法：采用不同的离心速度和离心时间，使沉降速度不同的颗粒分步离心的方法，称为差速离心。

操作时，将含有两种不同颗粒的混悬液，以常速离心，使大的颗粒下沉，将上清液倾倒于另一离心管中，再加大离心力，离心一定时间，分离小的颗粒，反复多次分离，达到分离目的。

差速离心主要用于分离大小和密度差异较大的颗粒。

差速离心法的优点是：操作简单，离心后用倾倒法即可将上清液与沉淀分开，并可使用容量较大的角式转子。

2.密度梯度离心法：该法又分为速率区带离心法和等密度区带离心法。

样品在一定惰性梯度介质中进行离心沉淀或沉降平衡，在一定离心力下把颗粒分配到梯度液中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。

该法的优点是：具有很好的分辨率，分离效果好，可一次获得较纯颗粒;适用范围广，既能分离沉淀系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度的颗粒;颗粒不会积压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。

被离心的物质根据其沉降系数不同进行分离，同类物质则因分子大的沉降速度快于分子小的物质从而得到分离。

密度梯度的制备可采用梯混合器，也可将不同浓度的蔗糖溶液，小心地一层层加入离心管中，越靠管底，浓度越高，形成阶梯梯度。

在密度梯度离心过程中，区带的位置和宽度随离心时间的不同而改变。

随离心时间的加长，区带会因颗粒扩散而越来越宽。

3.分析性超速离心法：分析型超速离心机主要由一个椭圆形的转子、一套真空系统和一套光学系统所组成。

该转子通过一个柔性的轴连接成一个高速的驱动装置，此轴可使转子在旋转时形成自己的轴。

转子在一个冷冻的真空腔中旋转，其容纳两个小室：分析室和配衡室。

分析室的容量一般为1mL，呈扇形排列在转子中，其工作原理与一个普通水平转子相同。

分析室有上下两个平面的石英窗，离心机中装有的光学系统可保证在整个离心期间都能观察小室中正在沉降的物质，可以通过对紫外光的吸收或折射率的不同对沉降物进行监测。

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