植物原生质体相关材料2013-9-2 From HZB一、植物材料研究表明，几乎从植物的所有部位都能得到原生质体，其中以叶片为多。
根尖组织也是植物原生质体的重要来源，它可由各种植物的种子萌发后取得。
花粉经特异酶处理也能得到原生质体，在单倍体遗传育种中有特殊的用途。
但是，要获得高质量的原生质体，则须选用生长旺盛、生命力强的组织作材料。
材料的生理状况是原生质体质量的决定性因素之一。
1. 细胞悬浮培养物在建立细胞悬浮培养物之前，需提前培养愈伤组织：取用成熟种子胚、未成熟胚、幼穗、花药、胚芽鞘或幼叶，经无菌消毒后，在26℃黑暗条件下，在含2,4－D 2-4mg/L的MS固体培养基上，诱导愈伤组织，每隔2-4d转接一次。
从中选出增殖较快而且呈颗粒状的愈伤组织，或经继代培养一次后，转移到液体培养基的100ml三角瓶中进行悬浮培养。
具体方法是用旋转式振荡器，速度控制在80-120r/min，在25±1℃下暗培养。
通常经悬浮培养3～4月后，悬浮培养细胞的大小变得较为一致，且细胞质变得较浓时，可用作分离原生质体。
2. 叶肉细胞叶肉细胞是分离原生质体的最好的细胞材料，用叶片的薄壁组织作为材料来源，既要考虑植株的生长环境，又要考虑叶片的年龄及其生理状态对原生质体分离的影响。
取生理状态适宜的叶片，有利于原生质体的细胞再生和细胞分裂。
要获得良好的培养材料，下列外界因素是需要着重考虑的：（1）光强为3000-6000lx。
（2）温度为20-25℃培养。
（3）相对湿度在60％-80％左右。
植物的其他器官也可用于分离原生质体，如用花粉四分体和花粉壁细胞。
3. 植物材料的预处理对原生质体材料进行预处理能提高原生质体的分裂频率；也可以逐步提高植物材料的渗透压，以适应培养基中的高渗环境。
这些处理包括：暗处理、预培养、低温处理等。
例如，把豌豆的枝条取下后，在分离原生质体前，先让材料在黑暗中的一定湿度条件下放1～2d，这样得到的原生质体存活率高，并能继续分裂。
在羽衣甘蓝叶肉组织原生质体分离和培养中，先去掉叶片的下表皮，再在诱导愈伤组织的培养基中预培养7d，然后再去壁；经预培养的叶片分离的原生质体高度液泡化，叶绿体也解体。
龙胆试管苗的叶片只有用4CC低温处理后分离得到的原生质体才能分裂。
但在很多情况下材料不必经过专门的预处理。
二、酶1. 酶的种类构成植物细胞壁的三个主要成分是：①纤维素，占细胞壁干重的25％至50％不等；②半纤维素，平均约占细胞壁干重的53％左右；③果胶质，一般占细胞壁的5％。
分离原生质体最常用的酶有纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶。
ZA3-867纤维酶是上海植物生理研究所从野生型绿色木霉同各菌种中提取制成的，粗制品是多种酶的复合物，含有纤维素酶（包括C1、CX、B一葡萄糖苷酶等）、果胶质、半纤维素酶等，分离细胞壁的效果较好。
这种复合酶使用时不需加半纤维素酶和果胶酶等，就可以分离出植物原生质体。
日本产的Onozuka纤维素酶常和果胶酶结合使用，可先用果胶酶降解果胶，使分开细胞，再用纤维素酶处理降解细胞壁。
即二步法降解。
2. 渗透稳定剂植物细胞壁对细胞有良好的保护作用。
去除细胞壁之后如果溶液中的渗透压和细胞内的渗透压不同，原生质体有可能涨破或收缩。
因此在酶液、洗液和培养液中渗透压应大致和原生质体内的相同，或者比细胞内渗透压略大些。
渗透压大些有利于原生质体的稳定，但也有可能阻碍原生质体的分裂。
因此，在分离原生质体的酶溶液内，需加入一定量的渗透稳定剂，其作用是保持原生质体膜的稳定，避免破裂。
常用的两种系统为：①糖溶液系统：包括甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等，浓度约在0.40-0.80mol/L。
本系统还可促进分离的原生质体再生细胞壁并继续分裂；②盐溶液系统：包括KCL、MgSO4和KH2PO4等。
其优点是获得的原生质体不受生理状态的影响，因而材料不必在严格的控制条件下栽培，不受植株年龄的影响，使某些酶有较大的活性使原生质体稳定。
另外，添加牛血清蛋白可减少或防止降解壁过程中对细胞器的破坏。
近年来多采用在盐溶液内进行原生质体分离，然后再用糖溶液作渗透稳定剂的培养基中培养。
此外，酶溶液里还可加入适量的葡聚糖硫酸钾，它可提高原生质体的稳定性。
这种物质可使RNA酶不活化，并使离子稳定。
3. 酶溶液的pH值酶溶液的pH值对原生质体的产量和活力影响很大。
例如，用菜豆叶片作培养材料时，发现原始pH值为5.0时，原生质体产生一得很快，但损坏较严重，并且培养后大量破裂。
当PH值提高到6.0时，最初原生质体却产生少，但与pH值为5.0时处理同样时间后相比，原生质体数量显著增加。
原始pH值提高到7.0时生活的原生质体数量进一步增加，损伤的原生质体也少得多。
三、原生质体的分离分离原生质体时，首先要让酶制剂大量地吸附到细胞壁的纤维素上去，因此，一般先将材料分离成单细胞，然后分解细胞壁。
采用将酶液减压渗入组织，或将组织切成薄片等方法，都可增加酶液与纤维素分子接触的机会。
酶处理目前常用的多是“一步法”，即把一定量的纤维素酶，果胶酶和半纤维素酶组成混合酶溶液，材料在其中处理一次即可得到分离的原生质体。
植物材料须按比例和酶液混合才能有效地游离原生质体，一般去表皮的叶片需酶量较少，而悬浮细胞则用酶量较大。
每克材料用酶液10-30ml不等。
由于不同材料的生理特点不同，在研究游离条件时，必须试验不同渗透压浓度的细胞，找出适宜的渗透浓度。
酶解处理一般地在黑暗中静止进行，在处理过程中偶尔轻轻摇晃几下。
对于悬浮细胞，愈伤组织等难游离原生质体的材料，可置于摇床上，低速振荡以促进酶解。
酶解时间几小时至几十小时不等、以原生质体游离下来为准。
但是，时间过长对原生质体有害，所以一般不应超过24h。
酶解温度要从原生质体和酶的活性两方面考虑。
对于这几种酶来说，最佳处理温度在40-50℃，但这个温度对植物细胞来说太高，所以一般都在25℃左右进行酶解。
1. 叶片、子叶等材料取已展开的生活叶片，用0.53％次氨酸钠和70％酒精进行表面灭菌，然后切成2cm2。
把4g叶组织置于含有200ml不加蔗糖和琼脂的培养基500ml三角瓶中，在4℃黑暗条件下培养16～24h。
之后将灭菌的叶片或子叶等材料下表皮撕掉，去表皮的方法是：在无菌条件下将叶面晾干、顺叶脉轻轻撕下表皮；如果去表皮很困难，也可直接将材料切成小细条，放入酶液中。
叶片转入含有纤维素酶、果胶酶、无机盐和缓冲液的混合液中，pH值为5.6，通常在酶液中使用的等渗剂为0.55～0.6mol甘露醇。
然后，酶液真空渗入叶片组织。
在28℃条件下，每分钟40转的旋转式转床上培养4h后，叶片组织可完全分离。
2. 悬浮细胞等材料用悬浮培养细胞，可不经过果胶酶处理，因为悬浮细胞液主要由单细胞和小细胞团组成。
如果细胞团的大小很不均一，在酶解前最好先用尼龙网筛过滤一次，将原细胞团去掉，留下较均匀的小细胞团时再进行酶解。
取悬浮细胞放入10ml的酶液中（3％纤维素酶，14％蔗糖，pH值5.0～6.0），在25～33℃条件下酶解24h。
原生质体一酶混合液用30um的尼龙网过滤，通过低速离心收集原生质体。
四、影响原生质体分离的因素1.酶制剂活力和纯度粗制的商品酶含有核酸酶和蛋白酶等杂质，它们对原生质体的活力是有害的。
酶的活性还与pH值有关。
Onoznka纤维素酶R-10和离析酶R-10的最适宜pH值分别为5-6和4-5。
不过实际上酶溶液的pH值经常调节4.7-6.0之间。
2. 渗透稳定剂的作用在分离原生质体时，渗透稳定剂有保护原生质体结构及其活力的作用。
糖溶液系统可使分离的原生质体能再生细胞壁，并使之能继续分裂，其缺点是有抑制某些多糖降解酶的作用。
盐溶液系作渗透稳定剂时对材料要求较严格，且使原生质体稳定，使某些酶有较大活性。
但是易使原生质体形成假壁，同时使分裂后细胞是分散的。
五、原生质体的净化和活力测定在分离的原生质体中，常常混杂有亚细胞碎片、维管束成分、未解离细胞、破碎的原生质体以及微生物等。
这些混杂物的存在会对原生质体产生不良影响。
此外，还需去掉酶溶液，以净化原生质体。
原生质体纯化常用过滤和离心相结合的方法，步骤大致如下：1. 将原生质体混合液经筛孔大小为40-100um的滤网过滤，以除去未消化的细胞团块和筛管、导管等杂质，收集滤液。
2.将收集到的滤液离心，转速以将原生质体沉淀而碎片等仍悬浮在上清液中为准，一般以500r/min离心15min。
用吸管谨慎地吸会上清液。
3.将离心下来的原生质体重新悬浮在洗液中（除不含酶外，其他成分和酶液相同），再次离心，去上清液，如此重复三次。
4.用培养基清洗一次，最后用培养基将原生质调到一定密度进行培养。
一般原生质体的培养密度为104-106/ml。
在原生质体培养前，常常先对原生质体的活性进行检测。
测定原生质体活性有多种方法，一是凭借形态可识别原生质体的存活性，二是采用特异的染色方法来确定。
可用0.1%酚藏花红液染色，活的原生质体能着红色；最好是采用荧光素双醋酸酯（FDA）染色，有活力的原生质体带有荧光，无活力的不产生荧光。
FDA染色测活性的方法如下：取洗涤过的原生质体悬浮液0.5ml，置于10×100mm的小试管中，加入FDA溶液使其最终浓度为0.01％，混匀、置于室温5min后用荧光显微镜观察。
激发光滤光片用QB24，压制滤光片用JB8。
发绿色荧光的原生质体为有活力的，不产生荧光的为无活力的。
由于叶绿素的关系，叶肉原生质发黄绿色荧光的为有活力的，发红色荧光的为无活力的。
六、原生质体的培养常用的原生质体培养方法有以下几种：1.液体培养法：是把纯化后的原生质体悬浮于液体培养基中的培养方法。
2.固体平板法：是把原生质体均匀地埋入琼脂培养基中的培养方法。
3.双层培养法：是在琼脂培养基上部加入一薄层液体原生质体培养液的培养方法。
来源：/doc/view-d2537567.html/view/81ecfaf39e314332396893a6.html。
