[课件]植物原生质体的分离与纯化PPT

实验五植物原⽣质体的分离和培养实验四植物原⽣质体的分离和培养实验⽬的掌握植物原⽣质体分离和培养的基本⽅法，并对培养的结果进⾏初步观察。

实验原理原⽣质体是除去细胞壁的裸露细胞。

在适宜的培养条件下，分离的原⽣质体能合成新壁，进⾏细胞分裂，并再⽣成完整植株。

植物的幼嫩叶⽚、⼦叶、下胚轴、未成熟果⾁、花粉四b咻、培养的愈伤组织和悬浮培养细胞均可作为分离原⽣体的材料来源。

分离愿⽣厦籀萨采⽤酶解法。

其原理是根据由纤维素酶、罘胶酶和半纤维素酶配制⽽成的溶液对细胞壁成分的降解作⽤，⽽使原⽣质体释放出来。

原⽣质体的产率和活⼒与材料来源、⽣理状态、酶液的组麟，以及原⽣质体收集⽅法有关。

酶液通常需要保持较⾼的渗透压，以使原⽣质体在分离前细胞处于质壁分离状态，分离之后不致膨胀破裂。

渗透剂常⽤⽢露醇，⼭梨醇，葡萄糖或蔗糖。

酶液中还应含⼀定量的钙离⼦，来稳定原⽣质膜。

游离出来的原⽣质体可⽤过筛⼀低速离⼼法收集，⽤蔗糖漂浮法纯既，然后进⾏培养。

实验⽤品⼀、材料1.烟草幼苗的叶⽚、或向⽇葵⽆菌苗的叶⽚、⼦叶或下胚轴等。

2.胡萝⼘根切⽚诱导的松软愈伤组织。

⼆、器材超净⼯作台、台式离⼼机或⼿摇离⼼机、倒置显微镜、普通显微镜、培养室、灭菌锅、⾎细胞计数板、⽯蜡膜带等。

细菌过滤器和0·45µm的滤膜、300⽬不锈钢⽹筛及配套的⼩烧杯、解剖⼑、尖头镊⼦、注射器(5、10m1)和12号长针头、带⽪头的刻度移液管(5、10ml，上部管⼝加棉塞)、培养⽫(直径6cm)或扁平培养瓶(50m1)、⼤培养⽫、吸⽔纸等、使⽤前需经过灭菌。

三、试剂1. 70％酒精。

2. 0.1％升汞⽔溶液，并滴⼊少许TWeen 80。

3. 灭菌蒸馏⽔。

4. 0.16mo／L和0.20mo／L CaCl2·2H2O溶液，并加有0.1％MES（2-N-吗啉已烷磺酸），PH5.8~6.2。

5. 20％和12％蔗糖溶液，pH PH5.8~6.2。

实验五 植物原生质体的分离与纯化 2017.10.266. 实验结果与分析6.1实验结果图1.光学显微镜下菠菜原生质体观察（物镜×40倍） H ：完整原生质体 K ：被压碎的原生质体 P ：细胞壁Q ：梯细胞 W ：原生质体碎片结果描述：光学显微镜下，完整的菠菜原生质体为圆形或椭圆形，颜色为中间浅边缘深的绿色，色泽分布不均匀，为颗粒状分布；被压碎的原生质体为松散状聚在一起，绿色；视野中还有一些绿色的原生质体碎片；被分离的细胞壁为透明的圆形；梯细胞为透明螺旋状，形似梯子。

原生质体纯度：完整原生质体/总原生质体=27/65=41.5％① ② ③ ④ HP Q H K W结果分析：光学显微镜下原生质体为颗粒状的绿色不均匀分布是由于光学显微镜下看到的是原生质体的叶绿体，所以为颗粒状分布，又因为叶绿体大多沿细胞膜分布，所以原生质体的边缘会比中央的颜色要深；因为菠菜的细胞去除了细胞壁，所以在高渗溶液下原本方形的原生质体变为椭圆形。

由于在制作悬浮液或离心时会对原生质体造成冲击，所以会有一些原生质体破碎。

梯细胞最终发育为维管。

原生质体的纯度为41.5％，相对来说结果还算理想，因为去除细胞壁的原生质体较为脆弱，很容易受到破坏。

W ：完整原生质体 K ：被压碎的原生质体 P ：木质素Q ：原生质体碎片结果描述：荧光显微镜下完整的菠菜原生质体为圆形或椭圆形，颜色为中间浅边缘深的红色，色泽分布不均匀，为颗粒状分布；被压碎的原生质体为松散状聚在一起，红色；视野中还有一些红色的原生质体碎片和呈黄色的木质素。

结果分析：荧光显微镜下完整的菠菜原生质体为红色，主要是因为在荧光下叶绿体泛红光，主要通过观察叶绿体来辨别原生质体的具体形态。

因为叶绿体大多沿细胞膜分布，所以原生质体的边缘会比中央的颜色要深，又因为菠菜的细胞去除了细胞壁，所以在高渗溶液下原本方形的原生质体变为椭圆形。

视野中呈透明黄色的为木质素，为细胞壁的成分。