植物原生质体的分离与纯化

植物原生质体的分离及融合生93沈睿2009012372同组：古梦婷实验日期：2011年11月2日一．实验原理1.原生质体分离原生质体指包被在植物细胞壁内的生活物质。

细胞壁的主要成分是纤维素和果胶质，它们分别经纤维素酶和果胶酶处理即可分解，从而脱去细胞壁，得到原生质体。

2.原生质体融和诱导原生质体融合的方法有多种，譬如物理法（电场刺激，激光，显微操作等）、化学法（聚乙二醇结合高钙高pH法）和生物法（仙台病毒法等）。

本实验用PEG诱导原生质体融和。

PEG是聚乙二醇的英文缩写，相对分子质量在200-6000之间的均可用作细胞融合剂，20-50%的浓度能对原生质体产生瞬间冲击效应，原生质体很快发生收缩与粘连。

PEG诱导融合的机理可能是由于其含有醚键而具负极性，与水、蛋白质、碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键。

当PEG分子足够长时，可作为相邻原生质体表面之间的分子桥而使之粘连。

PEG也能连接Ca2+等阳离子。

Ca2+可在一些负极化基团和PEG之间形成桥，因而促进粘连。

在洗涤过程中，连接在原生质体膜上的PEG分子可被洗脱，这将引起电荷的紊乱和再分布，从而引起原生质体融合。

高钙、高pH洗液清洗则增加了质膜的流动性，因而大大提高了融合频率，洗涤时的渗透冲击对融合也可能起作用。

普遍认为PEG分子能改变各类细胞细胞膜的结构，由于两细胞相接处质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，两细胞接触点处细胞膜的脂类分子发生疏散和重组。

PEG法诱导的优点是取材方便、操作简易、效率高且效果稳定，缺点是对细胞有毒性。

二．实验步骤1.原生质体的制备（1）将新鲜的剑兰（唐菖蒲）花瓣洗干净，用吸水纸吸干表面水分；将小平皿洗净，用蒸馏水冲洗后晾干或擦干。

（2）向小平皿中加入适量酶液，用尖头镊剥取剑兰花瓣的上、下表皮，27o C恒温振荡1h 左右。

（3）镜检细胞的酶解情况，若酶解效果不佳，可延长酶解时间，并用吸管吹吸。

（4）将酶解好的原生质体混合液经300目尼龙网过滤到10ml离心管，去除未被酶解的大块组织，用洗涤液冲洗平皿若干次，收集冲洗的液体。

植物原生质体的分离
植物原生质体的分离
植物原生质体(plant protoplasts)是植物细胞核以外的细胞质组成，它们可以通过去核反应获得。

原生质体可以分离出来，是植物胚性转化的一种重要方法，可以用来分离和获得植物细胞和细胞器的活性。

植物原生质体的分离可以采用不同的方法，以下是常用的几种方法：
一是用果胶酶和裂解酶将细胞膜降解，使细胞质中的内质网结构改变，使原生质体从细胞壁中分离出来。

二是用保护剂处理和胞质囊泡技术。

保护剂处理，把细胞质和细胞膜充分溶解，裂解出原生质体；而胞质囊泡技术，是通过用氯仿（等其他溶剂）将细胞膜脱落，或者将细胞膜和细胞质分开，使原生质体分离出来。

三是用低温处理，低温能使细胞膜结构改变，形成小孔，使原生质体从小孔中流出。

四是运用低温抗体介导的细胞膜破裂，在低温下用抗体对细胞膜特异性地结合，从而实现细胞膜的改变，使原生质体分离出来。

以上几种方法通常都能有效地获得植物原生质体。

另外，还可以采用全自动分离系统，自动化地破碎、清洗细胞，最终得到原生质体。

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植物原生质体分离和活性鉴定实验目的1.学习植物细胞原生质体分离纯化的方法。

2.了解原生质体活性鉴定的原理。

实验原理植物原生质体(protoplast)是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞”,是开展基础研究的理想材料。

其中,酶解法分离原生质体是一个常用的技术,其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成,因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分,除去细胞壁,即可得到原生质体。

由于原生质体内部与外界环境之间仅隔一层薄薄的细胞膜,必须保持在渗透压平衡的溶液中才能保持其完整性。

其次,还应当考虑取材、酶的种类和纯度、酶液的渗透压、酶解时间及温度等因素对分离原生质体的影响。

测定原生质体的活性有多种方法。

荧光素双醋酸酯(FDA)染色是常用的一种方法,FAD 本身无荧光,无极性,可透过完整的原生质膜。

一旦进入原生质体后,由于受到酯酶分解而产生具有荧光的极性物质荧光素。

它不能自由出入原生质膜,因此有活力的细胞能产生荧光,无活力的原生质体不能分解FAD无荧光产生。

实验材料、用品材料：绿豆,烟草幼苗叶片等。

绿豆烟草幼苗试剂：(1)酶解液(绿豆)：1%(W／V) 纤维素酶,1% (W／V)果胶酶,0.7mol／L甘露醇;10mmol/L CaCl2.2H2O,0.7mmol/L KH2PO4,pH 6.8～7.0。

(2)13%CPW洗涤液(绿豆)：27.2mg/L KH2PO4,101.0mg/LKNO3,1480.0mg/LCaCl2.2H2O,246.0mg/L MgSO4,0.16mg/LKI ,0.025mg/L CuSO4.5H2O,13%(W/V)甘露醇,pH 6.0。

(3)酶解液(烟草)：用01％2-N-吗啡啉乙磺酸钠配制2％(W／V)纤维素酶,1％ (W／V)果胶酶,005 mmol／L氯化钙,0.6 mol／L甘露醇,pH 6.0。

(4)洗涤液(烟草)：0.2 mol／L氯化钙, 加有01％2-N-吗啡啉乙磺酸钠,pH 6.0。

实验五植物原⽣质体的分离和培养实验四植物原⽣质体的分离和培养实验⽬的掌握植物原⽣质体分离和培养的基本⽅法，并对培养的结果进⾏初步观察。

实验原理原⽣质体是除去细胞壁的裸露细胞。

在适宜的培养条件下，分离的原⽣质体能合成新壁，进⾏细胞分裂，并再⽣成完整植株。

植物的幼嫩叶⽚、⼦叶、下胚轴、未成熟果⾁、花粉四b咻、培养的愈伤组织和悬浮培养细胞均可作为分离原⽣体的材料来源。

分离愿⽣厦籀萨采⽤酶解法。

其原理是根据由纤维素酶、罘胶酶和半纤维素酶配制⽽成的溶液对细胞壁成分的降解作⽤，⽽使原⽣质体释放出来。

原⽣质体的产率和活⼒与材料来源、⽣理状态、酶液的组麟，以及原⽣质体收集⽅法有关。

酶液通常需要保持较⾼的渗透压，以使原⽣质体在分离前细胞处于质壁分离状态，分离之后不致膨胀破裂。

渗透剂常⽤⽢露醇，⼭梨醇，葡萄糖或蔗糖。

酶液中还应含⼀定量的钙离⼦，来稳定原⽣质膜。

游离出来的原⽣质体可⽤过筛⼀低速离⼼法收集，⽤蔗糖漂浮法纯既，然后进⾏培养。

实验⽤品⼀、材料1.烟草幼苗的叶⽚、或向⽇葵⽆菌苗的叶⽚、⼦叶或下胚轴等。

2.胡萝⼘根切⽚诱导的松软愈伤组织。

⼆、器材超净⼯作台、台式离⼼机或⼿摇离⼼机、倒置显微镜、普通显微镜、培养室、灭菌锅、⾎细胞计数板、⽯蜡膜带等。

细菌过滤器和0·45µm的滤膜、300⽬不锈钢⽹筛及配套的⼩烧杯、解剖⼑、尖头镊⼦、注射器(5、10m1)和12号长针头、带⽪头的刻度移液管(5、10ml，上部管⼝加棉塞)、培养⽫(直径6cm)或扁平培养瓶(50m1)、⼤培养⽫、吸⽔纸等、使⽤前需经过灭菌。

三、试剂1. 70％酒精。

2. 0.1％升汞⽔溶液，并滴⼊少许TWeen 80。

3. 灭菌蒸馏⽔。

4. 0.16mo／L和0.20mo／L CaCl2·2H2O溶液，并加有0.1％MES（2-N-吗啉已烷磺酸），PH5.8~6.2。

5. 20％和12％蔗糖溶液，pH PH5.8~6.2。

植物原生质体的制备原理
植物原生质体的制备原理是利用生物学方法将植物细胞的质膜和细胞壁打破，使得细胞质与细胞器分离，获得纯净的细胞质。

具体制备原理如下：
1. 选择新鲜的植物组织，例如嫩叶片、根尖等，并将其切碎。

2. 将切碎的组织置于适当的缓冲液中，缓冲液中含有维持细胞渗透压的某些成分，如蔗糖。

3. 经过一定时间的培养，细胞内的质膜和细胞壁会被渗透液逐渐分解，从而使细胞质暴露在外。

4. 使用过滤纸或细孔滤网将悬浊液过滤，以去除细胞壁碎片和其他杂质。

5. 对滤液进行离心，以分离更纯净的细胞质。

6. 最后，将分离得到的细胞质保存在低温条件下，或进行后续的实验操作。

通过上述步骤，就可以制备得到植物原生质体，供后续的生物学研究和实验使用。

植物原生质体分离、纯化与活力检测刘亚靖200911020一.实验器材：普通生物显微镜、移液枪及枪头、恒温水浴箱、离心机、pH计、离心管、剪子、镊子、培养皿、烧杯、三角瓶、载玻片、盖玻片、镊子、血球计数板、酒精灯等。

二. 试剂：(1) CPW溶液： KH2PO4 27.2 mg/L，KNO3101mg/L，CaCl2·2H2O 148 0mg/L，MgSO4·7H2O 246 mg/L，KI 0.16 mg/L，CuSO4·5H2O 0.025 mg/L，pH 5.6。

(2) 预处理液：700 mmol/L甘露醇(约13%甘露醇)，用CPW溶液配制。

(3) 酶解液：1%纤维素酶（cellulase Onzuka R-10）、0.1%果胶酶（pectinase）、0.5%离析酶（MacerozymeR-10）用洗涤液配制。

(4) 洗涤液：含600 mmol/L甘露醇(约11%甘露醇)的CPW溶液。

(5) 原生质体染色贮液： 0.4%的台盼兰（用洗涤液配制）。

三. 实验材料：胡萝卜根皮层0.5-1.0 mm。

四.实验程序与操作要点1. 原生质体的分离与纯化(1) 取胡萝卜根去表皮和里心0.4293 g，置薄层预处理溶液中，室温黑暗下预处理1h。

(2) 用吸管吸去预处理液，按材料：酶液=1：10的比例加入4.3 mL酶解液，在26℃下保温黑暗酶解，其间不时轻轻摇动培养皿。

(3) 酶解2 h后，取样在显微镜下观察到细胞壁的酶解情况，每0.5 h观察一次，有圆球形原生质体释放到溶液中时即停止酶解。

实际情况为未能观察到圆球形原生质体而一直未停止酶解。

2. 原生质体的纯化由于纯化时的离心转速过大会导致原生质体破碎，故略过本步骤。

而实际情况是原生质体已经破碎，离心后破碎的是细胞器。

3.原生质体活力测定台盼兰活体染色法：吸取纯化的原生质体悬浮液1滴于载玻片上中，滴加染料混匀在明视野显微镜下观察，未被着色者为有活力的胡萝卜根皮层原生质体，深蓝色者是死细胞。

实验六植物原生质体的分离与融合第一部分：综合性实验紫叶甘蓝与园葱原生质体的分离与融合一、实验原理及意义植物原生质体由于已去除了细胞壁，它能够像动物细胞一样，在人为的条件下互相融合，获得细胞杂种植株。

如果用近缘种内或种间的原生质体融合，可以获得稳定的、具有双亲两套染色体的细胞杂种植株，它们往往可育，可以直接作为育种的种质材料；如果用远缘不亲和物种间的原生质体融合，可以获得常规有性杂交得不到的无性杂种植株，不仅克服了远缘杂交不亲和性，而且可以扩大植物的变异范围，拓宽种质来源，选育出新种质，甚至产生新种。

要分离植物原生质体，必须去掉由果胶质、纤维素和半纤维素及木质素等构成的细胞壁。

目前普遍采用酶分离法来获得原生质体。

1.酶：分离原生质体最常用的酶有纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶。

2.渗透稳定剂：植物细胞壁对细胞有良好的保护作用。

去除细胞壁之后如果溶液中的渗透压和细胞内的渗透压不同，原生质体有可能涨破或收缩。

因此在酶液、洗液和培养液中渗透压应大致和原生质体内的相同。

3.植物材料：一般来说，植物各个器官，如：根、茎、叶、花、果实、种子及愈伤细胞和悬浮细胞等都可作为分离原生质体的材料。

但是，要获得高质量的原生质体，则须选用生长旺盛、生命力强的组织作材料。

材料的生理状况是原生质体质量的决定性因素之一。

4.酶溶液的pH值：对原生质体的产量和生活力影响很大。

一般为5~7。

酶的活性与pH值有关。

Onoznka纤维素酶R－10最适宜pH值为5~6。

不过实际上酶溶液的pH值经常调节4.7~6.0之间。

对于不同的材料、不同型号的酶其所要求的最适值是不同的，应通过实验确定。

5.温度：对酶解效率和植物原生质体的活力都有影响。

酶：40~50摄氏度，适于植物材料的温度一般都在25℃，所以一般在25℃左右进行酶解。

二、试剂的配制1、pH5.7的磷酸钾缓冲液10 mL：A液：称取0.272g KH2PO4（0.2mol/L，溶于蒸馏水中，定容至10 mL。

简要说明原生质体分离的方法原生质体是植物细胞中的一种重要细胞器，它在细胞的生理活动中起着关键作用。

为了研究和利用原生质体，科学家们开展了一系列的实验，其中最重要的一步就是分离原生质体。

本文将以简要说明原生质体分离的方法为标题，介绍几种常用的原生质体分离方法。

一、低速离心法低速离心法是最常用的原生质体分离方法之一。

该方法的原理是通过离心将细胞破碎后的混合液分离成不同密度的组分。

具体步骤如下：1. 将植物组织切碎并加入适量的缓冲液。

2. 用离心机以较低的转速离心，使细胞破碎并分离成三个层次的组分：上层是液相，含有溶质和溶剂；中间层是细胞碎片和细胞核碎片；下层是较重的原生质体。

3. 将下层的原生质体用吸管或移液器小心地取出，并用缓冲液洗涤去除杂质。

二、梯度离心法梯度离心法是一种通过调整离心管中梯度浓度来分离不同细胞器的方法。

该方法可以得到纯度较高的原生质体。

具体步骤如下：1. 准备一个离心管，在离心管中加入不同浓度的梯度液，通常是葡萄糖或蔗糖梯度。

2. 将植物组织切碎并加入适量的缓冲液，制备细胞破碎液。

3. 将细胞破碎液轻轻地加入离心管中，避免与梯度液混合。

4. 用离心机以较高的转速离心，离心后不同细胞器会在离心管中分层。

原生质体一般会沉于梯度液的某一位置。

5. 小心地用吸管或移液器将原生质体分离出来，并用缓冲液洗涤去除杂质。

三、差速离心法差速离心法是一种通过调整离心速度来分离原生质体的方法。

该方法适用于分离密度较接近的细胞器。

具体步骤如下：1. 将植物组织切碎并加入适量的缓冲液，制备细胞破碎液。

2. 用低速离心将细胞破碎液离心一次，去除细胞碎片和细胞核碎片。

3. 将上一步得到的上清液转移至另一个离心管中，用较高的离心速度离心，原生质体会沉于离心管的底部。

4. 小心地将原生质体分离出来，并用缓冲液洗涤去除杂质。

四、亲和层析法亲和层析法是一种通过利用生物分子之间的特异性相互作用来分离原生质体的方法。

该方法适用于需要分离特定蛋白质的情况。

实验五 植物原生质体的分离与纯化 2017.10.266. 实验结果与分析6.1实验结果图1.光学显微镜下菠菜原生质体观察（物镜×40倍） H ：完整原生质体 K ：被压碎的原生质体 P ：细胞壁Q ：梯细胞 W ：原生质体碎片结果描述：光学显微镜下，完整的菠菜原生质体为圆形或椭圆形，颜色为中间浅边缘深的绿色，色泽分布不均匀，为颗粒状分布；被压碎的原生质体为松散状聚在一起，绿色；视野中还有一些绿色的原生质体碎片；被分离的细胞壁为透明的圆形；梯细胞为透明螺旋状，形似梯子。

原生质体纯度：完整原生质体/总原生质体=27/65=41.5％① ② ③ ④ HP Q H K W结果分析：光学显微镜下原生质体为颗粒状的绿色不均匀分布是由于光学显微镜下看到的是原生质体的叶绿体，所以为颗粒状分布，又因为叶绿体大多沿细胞膜分布，所以原生质体的边缘会比中央的颜色要深；因为菠菜的细胞去除了细胞壁，所以在高渗溶液下原本方形的原生质体变为椭圆形。

由于在制作悬浮液或离心时会对原生质体造成冲击，所以会有一些原生质体破碎。

梯细胞最终发育为维管。

原生质体的纯度为41.5％，相对来说结果还算理想，因为去除细胞壁的原生质体较为脆弱，很容易受到破坏。

W ：完整原生质体 K ：被压碎的原生质体 P ：木质素Q ：原生质体碎片结果描述：荧光显微镜下完整的菠菜原生质体为圆形或椭圆形，颜色为中间浅边缘深的红色，色泽分布不均匀，为颗粒状分布；被压碎的原生质体为松散状聚在一起，红色；视野中还有一些红色的原生质体碎片和呈黄色的木质素。

结果分析：荧光显微镜下完整的菠菜原生质体为红色，主要是因为在荧光下叶绿体泛红光，主要通过观察叶绿体来辨别原生质体的具体形态。

因为叶绿体大多沿细胞膜分布，所以原生质体的边缘会比中央的颜色要深，又因为菠菜的细胞去除了细胞壁，所以在高渗溶液下原本方形的原生质体变为椭圆形。

视野中呈透明黄色的为木质素，为细胞壁的成分。

S11实验十一植物原生质体的分离及融合（理论）实验十一植物原生质体的分离及融合（理论）原生质体培养的主要目的是实现远缘物种的体细胞杂交，外源染色体、DNA或细胞器的导入，创造新的远缘杂种。

全部技术环节包括原生质体分离、原生质体培养、体细胞杂交、杂种细胞产生愈伤组织及再生植株等。

一、原生质体的概念1、原生质体是指用特殊方法脱去植物细胞壁的、裸露的、有生活力的原生质团。

没有细胞壁，但具有活细胞的一切特征。

2、原生质体培养指将植物细胞游离成原生质体，在适宜的培养条件下，依据细胞的全能性使其再生细胞壁，进行细胞的分裂分化，并发育成完整植株的过程。

二、原生质体的分离方法1、机械分离法采用渗透方法使细胞发生质壁分离，然后切开细胞壁释放出原生质体。

特点是原生质体产量很低；方法繁琐费力；局限性大。

2、酶法分离采用果胶酶、纤维素酶等酶类对植物细胞壁进行酶解，得到原生质体。

三、原生质体纯化与活力测定1、原生质体的纯化a、离心沉淀法应用原生质体的比重大于溶液的性质，将原生质体沉于底部，收集原生质体备用。

b、漂浮法应用渗透剂含量较高的洗涤液使原生质体漂浮于液体表面。

依次通过网筛过滤、离心、收集沉淀，再用蔗糖液洗涤离心2—3次，漂浮收集即可。

c、界面法选用两种不同渗透浓度的溶液，一种溶液密度大于原生质体的密度，另一种小于原生质体的密度，进行界面收集原生质体。

2、活力测定a、形态识别形态上完整，含有饱满的细胞质，颜色新鲜的即为存活的原生质体。

b、染色识别用0.1%酚番红或伊凡蓝进行染色，后进行观察，有活力而质膜完整的原生质体对染料有排斥作用而不被染色，死亡的却被染上颜色。

四、原生质体的培养方法培养方法有四种，即固体薄层培养法、液体浅层培养法、双层培养法和琼脂糖珠培养法。

1、固体薄层培养法又叫平板培养法，指将一定体积的原生质体按照一定细胞密度与等体积的处于45℃的琼脂培养基混合，在培养皿内制成薄层固体平板的方法。

使原生质体位置固定，避免其游动，便于定点观察。

原生质体的分离与纯化植物原生质体是指脱去全部细胞壁由质膜包被的具有生命活力的裸露细胞。

它具有细胞生命特征和全能型，是细胞无性系变异和突变体筛选的重要来源，同时也是植物遗传工程的理想受体和遗传改良的理想材料。

细胞壁的主要成分是纤维素、半纤维素、果胶质和少量蛋白质等。

高等植物分离原生质体研究最早是1892年Klercker用机械法进行的，但无法获得大量有活力的原生质体，取材又局限于液泡化程度较大的细胞或长形细胞的组织，原生质体的研究进展缓慢。

直到1960年，Cocking用酶成功地分离出大量原生质体后，才为深入研究打开道路。

那么,原生质体如何分离？试题解析试题：在植物的细胞培养中，有多种方法可提取原生质体。

原生质体的分离与培养成功解决了植物组织培养、植物克隆等方面的难题，标志着植物细胞工程技术向前迈进了一大步。

以下说法正确的是（）A．提取原生质体唯一有效的办法是酶解法B．把原生质体放入高渗溶液中，可正常膨大C．通过原生质体融合再生植株可克服远缘杂交的不亲和性，但不是遗传转化的理想受体D．原生质体的获得再一次证明植物细胞质壁分离现象的存在解析：酶解法是理想方法,但不是唯一的，比如物理机械磨损也可以，A错误；将原生质体放在高渗溶液中因为失水会萎缩的，B错误；通过原生质体融合再生植株可克服远缘杂交的不亲和性，也是遗传转化的理想受体，扩大了基因工程的受体范围，C错误；原生质体是通过质壁分离与细胞壁分开的部分，是能存活的植物细胞的最小单位，因此原生质体的获得再一次证明植物细胞质壁分离现象的存在，D正确。

故正确的答案为D。

原生质体的分离方法1.机械分离法原生质体的机械分离法是借助于利器如刀或机械磨损等措施使细胞壁破损，促使原生质体释放的方法。

即将叶肉细胞、愈伤组织和液体悬浮培养细胞置于高渗的糖溶液中（并不是一定用教材中所说的甘露醇），使之发生质壁分离，原生质体收缩成球形，然后用剪刀剪碎组织，就可切开细胞壁获得少量完整的原生质体。