植物原生质体的分离与培养

植物原生质体的分离及融合生93沈睿2009012372同组：古梦婷实验日期：2011年11月2日一．实验原理1.原生质体分离原生质体指包被在植物细胞壁内的生活物质。

细胞壁的主要成分是纤维素和果胶质，它们分别经纤维素酶和果胶酶处理即可分解，从而脱去细胞壁，得到原生质体。

2.原生质体融和诱导原生质体融合的方法有多种，譬如物理法（电场刺激，激光，显微操作等）、化学法（聚乙二醇结合高钙高pH法）和生物法（仙台病毒法等）。

本实验用PEG诱导原生质体融和。

PEG是聚乙二醇的英文缩写，相对分子质量在200-6000之间的均可用作细胞融合剂，20-50%的浓度能对原生质体产生瞬间冲击效应，原生质体很快发生收缩与粘连。

PEG诱导融合的机理可能是由于其含有醚键而具负极性，与水、蛋白质、碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键。

当PEG分子足够长时，可作为相邻原生质体表面之间的分子桥而使之粘连。

PEG也能连接Ca2+等阳离子。

Ca2+可在一些负极化基团和PEG之间形成桥，因而促进粘连。

在洗涤过程中，连接在原生质体膜上的PEG分子可被洗脱，这将引起电荷的紊乱和再分布，从而引起原生质体融合。

高钙、高pH洗液清洗则增加了质膜的流动性，因而大大提高了融合频率，洗涤时的渗透冲击对融合也可能起作用。

普遍认为PEG分子能改变各类细胞细胞膜的结构，由于两细胞相接处质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，两细胞接触点处细胞膜的脂类分子发生疏散和重组。

PEG法诱导的优点是取材方便、操作简易、效率高且效果稳定，缺点是对细胞有毒性。

二．实验步骤1.原生质体的制备（1）将新鲜的剑兰（唐菖蒲）花瓣洗干净，用吸水纸吸干表面水分；将小平皿洗净，用蒸馏水冲洗后晾干或擦干。

（2）向小平皿中加入适量酶液，用尖头镊剥取剑兰花瓣的上、下表皮，27o C恒温振荡1h 左右。

（3）镜检细胞的酶解情况，若酶解效果不佳，可延长酶解时间，并用吸管吹吸。

（4）将酶解好的原生质体混合液经300目尼龙网过滤到10ml离心管，去除未被酶解的大块组织，用洗涤液冲洗平皿若干次，收集冲洗的液体。

植物原生质体的分离
植物原生质体的分离
植物原生质体(plant protoplasts)是植物细胞核以外的细胞质组成，它们可以通过去核反应获得。

原生质体可以分离出来，是植物胚性转化的一种重要方法，可以用来分离和获得植物细胞和细胞器的活性。

植物原生质体的分离可以采用不同的方法，以下是常用的几种方法：
一是用果胶酶和裂解酶将细胞膜降解，使细胞质中的内质网结构改变，使原生质体从细胞壁中分离出来。

二是用保护剂处理和胞质囊泡技术。

保护剂处理，把细胞质和细胞膜充分溶解，裂解出原生质体；而胞质囊泡技术，是通过用氯仿（等其他溶剂）将细胞膜脱落，或者将细胞膜和细胞质分开，使原生质体分离出来。

三是用低温处理，低温能使细胞膜结构改变，形成小孔，使原生质体从小孔中流出。

四是运用低温抗体介导的细胞膜破裂，在低温下用抗体对细胞膜特异性地结合，从而实现细胞膜的改变，使原生质体分离出来。

以上几种方法通常都能有效地获得植物原生质体。

另外，还可以采用全自动分离系统，自动化地破碎、清洗细胞，最终得到原生质体。

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原生质体的培养1. 原生质体的分离与纯化原生质体培养的意义(1)再生植株由原生质体再生生成植株，不论在进行有关细胞生物学或生物合成和代谢的实验研究上，还是在组织培养实践中，都有一定的优点：①可利用均一的分化细胞群体；②因无细胞壁，试剂对细胞作用更为直接，其反应能直接测量，以使反应产物能较快的分离出来；③在理论和实践中，可极大节省空间，如在一个三角瓶就能培养210个细胞，但在大田种植需要4亩地；④可缩短实验周期，如悬浮培养时仅需1～2个小时。

原生质体培养可在遗传学方面进行基因互补，不亲和性，连锁群和基因鉴定，分析基因的激活和失活水平的研究。

在研究分化问题时，用一个均一的原生质体群体可以筛选数以千计的不同。

营养和激素条件，探索诱导单细胞的分化条件等。

(2)用于远缘体细胞融合，进行体细胞杂交。

这是一种新的远缘杂交方法，为人们提供新的育种方法。

两个亲缘关系较远的植株用一般杂交方法是不容易成功的，而用细胞融合的方法却成为可能。

首先，两个原生质体融合形成异核体，异核体再再生细胞壁，进行有丝分裂，发生核融合，产生杂种细胞，由此可培养新的杂种。

一、原生质体(protoplast)的分离（一）材料来源原生质体是通过质壁分离与细胞壁分开的部分，是能存活的植物细胞的最小单位。

自从1960年用酶法制备大量植物原生质体首次获得成功以来，原生质体培养成为生物技术最重要的进展之一。

通过大量的试验表明，没有细胞壁的原生质体仍然具有"全能性"，可以经过离体培养得到再生植株。

原生质体的分离研究较早，1892年Klereker首先用机械的方法分离得到了原生质体，但数量少且易受损伤。

1960年，英国植物生理学家Cocking首先用酶解法从番茄幼苗的根分离原生质体获得成功。

他使用一种由疣孢漆斑菌培养物制备的高浓度的纤维素酶溶液降解细胞壁。

然而，直至1960年纤维素酶和离析酶成为商品酶投入市场以后，植物原生质体研究才成为一个热门的领域。

《细胞生物学》实验指导书（不太全供参考）适用专业:生物科学、生物技术实验目录实验一植物原生质体的分离与融合•••]实验二动物细胞原代培养•••3实验三细胞传代培养…彳实验四植物细胞骨架的光学显微镜观察••Y实验五细胞凋亡的诱导、观察与检测“I实验六环境因素诱变染色体改组的观察实验七红细胞膜蛋白的分离及其电泳检测 (11)实验一植物原生质体的分离与融合实验项目类型:综合性所属课程名称：《细胞生物学》实验计划学时：7学时一、实验目的1.掌握原生质体分离的原理与技术；2.了解细胞融合的基本原理及应用；3.初步掌握PEG融合法和电融合法.二、实验原理植物原生质体是去除了细胞壁的裸露的细胞.原生质体可以从培养的单细胞、愈伤组织和植物器官（叶等）获得.但一般认为从叶肉组织分离原生质体是理想的材料，其优点是材料来源方便，供应及时，而且遗传性较为一致.原生质体的分离通常采用酶解法，对细胞壁成分进行降解后获得.原生质体培养的条件和对营养的要求与组织、细胞相似.但原生质体由于除去了细胞壁,所以需要一定浓度的渗透压稳定剂来保持原生质体的稳定.常用的渗透压稳定剂包括甘露醇、山梨醇、蔗糖等. 其次，还应当考虑取材、酶的种类和纯度、酶液的渗透压、酶解时间及温度等因素对分离原生质体的影响.2个或2个以上的细胞合并成为1个细胞的现象称为细胞融合.细胞融合的主要方法有病毒法、聚乙二醇(PEG)法和电融合3种方法，其原理基本相同，都是两细胞接触点的膜分子发生重组,然后由于表面张力作用,形成一个球形细胞. 原生质体分离融合和培养的意义：1.除去了细胞壁为植物细胞之间的融合扫平了障碍，为制造新杂种开辟了道路.植物原生质体融合和培养在植物遗传工程和育种研究上具有广阔的应用前景.它是植物同源、异源多倍体获得的途径之一，它不仅能克服远缘杂交有性不亲和障碍，也可克服传统的通过有性杂交诱导多倍体植株的麻烦，最终将野生种的远缘基因导入栽培种中，原生质体融合技术可望成为作物改良的有力工具之一.2.原生质体可摄入外源DNA,细胞器、细菌或病毒颗粒,这些特性与植物全能性相结合为高等植物的遗传饰变打下基础.3.获得细胞无性系和选育突变体的优良起始材料.三、实验仪器与材料1.材料:油菜叶子、白菜花2.溶液或试剂:(1)洗涤液:甘露醇0.7mol/L,CaC12 • 2H2O3.5mmol/L,KH2PO4 0.7mmol/L(pH 5.6),高压灭菌；(2)混合酶液:1.5%纤维素酶,1%果胶酶溶于洗涤液中(pH 5.6).(3)50%PEG(4)高pH高钙稀释液：(5)20%蔗糖溶液(6)DPD培养基：3.仪器或其他用具:超净工作台、灭菌锅、显微镜、恒温培养箱、镶子、解剖刀、剪子、接种针、铝饭盒、锡箔纸、记号笔、橡皮筋、试剂瓶、三角瓶移液管、培养皿、酒精灯等.四、实验步骤(一)原生质体的制备：1.取材:取新鲜油菜叶和白菜花瓣自来水洗净，再用70%乙醇浸泡30S,0.5%次氯酸钠消毒lOmin,无菌水冲洗5次.2.酶解：材料切成1mm宽细丝，加入适量酶液，置摇床上(60〜70rpm),在25〜28°C黑暗条件下，酶解5〜7h.3.分离：用200目网过滤除去未完全消化的残渣，在lOOOrpm条件下离心5分钟,弃上清.加入3〜4ml洗涤液，相同条件下离心2-5分钟，弃上清，留1ml洗液.用滴管将混有原生质体的1ml洗液吸出，轻轻铺于20% 蔗糖溶液上(5ml离心管装3ml 20%蔗糖溶液)，在lOOOrpm条件下离心5-10分钟，由于密度梯度离心的作用，生活力强状态好的原生质体漂浮在20%的蔗糖与洗涤液之间，破碎的细胞残渣沉入管底.用200 u 1移液器轻轻将状态好的原生质体吸出（注意尽可能不要吸入下层的蔗糖溶液），放入另一干净的离心管中，加4ml洗涤液,1000rpm离心2-5分钟, 弃上清.（二）原生质体融合：1.将原生质体用DPD调节浓度为1*105个/mL.2.将原生质体混合物滴入小培养皿，静置8〜10分钟.3.然后滴入50%的PEG溶液，静置2分钟.4.依次间隔5分钟加入0.5ml、1 ml和2 ml高钙高pH洗涤液.注意在第二、三次洗液加入前,用移液器轻轻吸走部分溶液，但不能吸干，否则原生质体破碎死亡;最后用液体培养基洗1〜2次.制片，镜检.五、实验报告画出观察到的融合细胞，并计算融合率.六、思考题1.你认为要获得数量多、生活力强的原生质体，在实验中应注意那些问题？增多数量的方法:多取材且尽量切碎，增加酶浓度，提高酶解温度，延长酶解时间，操作轻柔，勿使原生质体破碎等.提高生活力的方法:取新鲜材料,采用合适的酶浓度、作用温度和时间2.举例说明原生质体融合的应用价值.实验二动物细胞原代培养实验项目类型:基础性所属课程名称：《细胞生物学》实验计划学时：4学时一、实验目的1.掌握动物细胞原代培养的基本方法和操作过程；2.熟悉原代培养细胞观察方法.二、实验原理用直接从机体获取的细胞进行的培养称为原代培养.原代培养是建立各种细胞系的第一步，该技术可以在体外进行各种类型细胞的增殖、遗传、变异、分化和脱分化、恶变与去恶变等研究.分为组织块培养法和消化法两种.三、实验仪器与材料1.材料:小鼠心、肝、脾、肾等2.溶液或试剂：(1)RPMI-1640培养基、小牛血清.(2)0.25%胰蛋白酶、(pH 5.6).(3)Hanks液3.仪器或其他用具:CO2培养箱、倒置显微镜、超净工作台、高压锅、水浴锅、解剖器械、培养瓶、微量加样器、吸管、移液管、酒精灯、酒精棉球等.四、实验步骤1.处死小鼠:将小鼠用颈椎脱臼法处死，放入75%酒精种浸泡消毒.2.取材:在超净工作台中用灭菌的解剖器械剖开小鼠腹腔，辨认并取下肝脏、脾脏和肾脏，放入灭菌的培养皿中，加入Hanks液清洗，然后加入2mL胰蛋白酶液,研磨并过滤.3.将液体转移到离心管,1200rpm离心5min收集细胞,加入适量培养液,C02培养箱培养.4.观察:逐日在倒置镜下观察细胞生长情况.五、实验报告画出细胞贴壁前和贴壁后的形态.六、思考题试述细胞原代培养成功的条件？实验三细胞传代培养实验项目类型:基础性所属课程名称：《细胞生物学》实验计划学时：3学时一、实验目的1.熟练掌握贴壁细胞传代的培养方法；2.观察传代细胞贴壁、生长、繁殖过程中细胞形态的变化.二、实验原理离体培养的细胞群体增殖达到一定密度时，细胞的生长和分裂速度就会减慢甚至停止，如不及时分离传代培养,细胞将逐渐衰老死亡.传代培养是指细胞从一个培养瓶以1:2或其它比率转移，接种到另一培养瓶的培养.贴壁培养细胞的传代通常采用胰蛋白酶消化,把细胞分散成单细胞再传代.三、实验仪器与材料1.材料:原代培养的小鼠细胞或Hela细胞2.溶液或试剂：(1)RPMI-1640培养基、小牛血清.(2)0.25%胰蛋白酶、(pH 5.6).(3)Hanks液3.仪器或其他用具:CO2培养箱、倒置显微镜、超净工作台、高压锅、水浴锅、培养瓶、微量加样器、吸管、移液管、酒精灯、酒精棉球等.四、实验步骤1.将长成单层的细胞从二氧化碳培养箱中取出,在超净工作台中倒掉瓶内的培养液，加入少许消化液.(以液面盖住细胞为宜)，静置5~10分钟.2.在倒置镜下观察被消化的细胞，如果细胞变圆,相互之间不再连接成片，这时应立即在超净台中将消化液倒掉，加入3〜5ml新鲜培养液,吹打, 制成细胞悬液.3.将细胞悬液吸出2ml左右，加到另一个培养瓶中并向每个瓶中分别加3ml 左右培养液，盖好瓶塞，送回二氧化碳培养箱中，继续进行培养.五、实验报告分别画出贴壁生长的小鼠细胞和Hela细胞,并说明二者的不同.六、思考题写出细胞传代培养成功的条件？实验四植物细胞骨架的光学显微镜观察实验项目类型:基础性所属课程名称：《细胞生物学》实验计划学时：3学时一、实验目的了解细胞骨架的结构特征及其制备技术二、实验原理细胞骨架是由蛋白质丝组成的复杂网状结构，根据其组成成分和形态结构可分为微管、微丝和中间纤维.它们对细胞形态的维持，细胞的生长、运动、分裂、分化，物质运输，能量转换，信息传递，基因表达等起到重要作用.用适当浓度的Triton X-100处理细胞时，可将细胞质膜和细胞质中的蛋白质和全部脂质溶解抽提，但细胞骨架系统的蛋白质不受破坏而被保存，经戊二醛固定，考马斯亮蓝R250染色或间接免疫荧光标记以后，可在显微镜下观察到细胞骨架结构.三、实验仪器与材料1.材料:洋葱鳞茎和口腔上皮细胞2.溶液或试剂：(1)M-缓冲液(2)6mmol/L(pH 6.8)磷酸缓冲液(3)l%Triton X-100(用M-缓冲液配制)(4)0.2%考马斯亮蓝R250(5)3%戊二醛3.仪器或其他用具:光学显微镜、50ml烧杯、玻璃滴管、容量瓶、试剂瓶、载玻片、盖玻片、镶子、小剪刀、吸水纸、擦镜纸等.四、实验步骤1.撕取洋葱鳞叶内表皮若干片,大小约lcm2,置于青霉素小瓶或小烧杯中.2.用磷酸缓冲液(PBS)浸泡片刻.3.吸去磷酸缓冲液，用1% TritonX-100处理20分钟抽提细胞骨架以外的蛋白质,从而使骨架图像更加清晰.4.吸去TritonX-100,用M-缓冲液洗3次，每次3分钟.M-缓冲液有稳定细胞骨架的作用.5.用3%戊二醛固定15-20分钟6.用PBS洗3次，每次3分钟7.考马斯亮蓝染色15分钟8.蒸馅水洗2次9.置于载玻片上，盖上盖玻片，在光学显微镜下观察.五、实验报告绘出植物细胞骨架微丝结构图.六、思考题说出各步骤的目的和一些重要试剂的在此处的作用.实验五细胞凋亡的诱导、观察与检测实验项目类型:创新设计性实验所属课程名称：《细胞生物学》实验计划学时：9学时一、实验目的1.了解细胞凋亡的概念和原理;2.掌握细胞凋亡诱导的方法;3.认识细胞凋亡的特征.二、实验原理人体内的细胞注定是要死亡的，目前人们已经知道细胞的死亡起码有两种方式，即细胞坏死与细胞凋亡.坏死是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程.表现为细胞胀大，胞膜破裂，细胞内容物外溢，核变化较慢,DNA降解不充分，引起局部严重的炎症反应.凋亡是细胞受到内、外因子刺激后发生的由基因调控的生理性死亡行为.其细胞及组织的变化与坏死明显不同.细胞凋亡的形态学变化: 首先细胞体积缩小，连接消失，与周围的细胞脱离，然后胞质密度增加, 核质浓缩，核膜核仁破碎,DNA降解,胞膜形成小泡，最终为为几个凋亡小体，无内容物外溢,因此不引起周围的炎症反应，凋亡小体可迅速被周围专职或非专职吞噬细胞吞噬.凋亡细胞DNA的有控降解是一种内源性核酸内切酶作用的结果,该酶在核小体连接部位切断染色体DNA,这种降解表现在琼脂糖凝胶电泳中就呈现特异的梯状Ladder图谱,而坏死呈弥漫的连续图谱.三、实验仪器与材料1.鸡血细胞2.溶液或试剂：生理盐水,20mmol/LCaC12顺伯，姬姆萨染色剂，Tris.HCl,SDS, EDTA,乙醇，甲醇，蛋白酶K.3.仪器或其他用具:超净工作台、灭菌锅、显微镜、恒温培养箱、镶子、解剖刀、剪子、接种针、铝饭盒、锡箔纸、记号笔、橡皮筋、试剂瓶、三角瓶移液管、培养皿、酒精灯等.四、实验步骤（一）细胞凋亡的诱导：1.采鸡血10ml,加0.85%的生理盐水混匀,1200r/min离心5min,弃上清液（重复三次），制备红细胞悬液，然后加入50ml血细胞保存液混匀放于4°C冰箱中备用.2.取4个试管，各加入鸡血细胞保存液2ml,在1号管中加入2ml生理盐水作为阴性对照,2号试管加入2ml 10ug/ml的顺伯溶液作为阳性对照;3号试管中加入2ml 20mmol/L的CaC12溶液进行胁迫处理;4号试管不加任何物质，实验时煮沸5 min使细胞坏死.（二）细胞凋亡的形态学观察：1.处理4h取样，用生理盐水稀释5倍，各取50ul细胞悬液均匀涂布于5 片载玻片上,晾干.2.用甲醇固定2min,然后在载玻片上滴加适量姬姆萨染液染色lOmin.3.用蒸馅水轻轻洗去染液，室温晾干，在光学显微镜下观察细胞形态变化.4.照相，并对试验组细胞进行凋亡计数统计.（三）DNA梯状条带的检测：1.离心收集鸡血细胞，弃上清.2.加入1ml的细胞裂解缓冲液重悬，转入1.5ml离心管中，加入蛋白酶K （500ug/ml）20 n 1,混匀.3.在65°C恒温水浴锅中水浴30min（也可转入37°C水浴12〜24h）,间歇振荡离心管数次.4.于台式离心机以12000 rpm离心5min,取上清液入另一离心管中.5.加2倍体积异丙醇，倒转混匀后，可以看见丝状物，用100ul吸头挑出, 或12,000转/分离心5分钟，弃上清,晾干.6.用50ulTE 缓冲液(pH8.0)溶解沉淀,并加入RNase A(10ug/ul)5ul,于37 °C 保温10〜15分钟.7.1.2 %琼脂糖凝胶,75 V电压，电泳45 min左右，8.紫外灯下观察并照相.(琼脂糖凝胶电泳:称取 1.2克琼脂糖加入100ml1*TBE),加热使之溶解，取一个凝胶模子，两端用胶布封好，水平放置.将制孔器(即梳子)放在模子一侧约0.5cm处，其底部距模子约1mm.待琼脂冷至约70°C时，加入10ul 0.5mg/ml EB,混匀，倒入模子，待冷却凝固后，取下梳子，撕去两端胶布,放入电泳槽中，使有加样孔的一端放在负极一端.在电泳槽中加入1*TBE至超过凝胶表面约1mm.加入DNA 电泳样:1.5ul DNA 。

简要说明原生质体分离的方法原生质体是植物细胞中的一种重要细胞器，它在细胞的生理活动中起着关键作用。

为了研究和利用原生质体，科学家们开展了一系列的实验，其中最重要的一步就是分离原生质体。

本文将以简要说明原生质体分离的方法为标题，介绍几种常用的原生质体分离方法。

一、低速离心法低速离心法是最常用的原生质体分离方法之一。

该方法的原理是通过离心将细胞破碎后的混合液分离成不同密度的组分。

具体步骤如下：1. 将植物组织切碎并加入适量的缓冲液。

2. 用离心机以较低的转速离心，使细胞破碎并分离成三个层次的组分：上层是液相，含有溶质和溶剂；中间层是细胞碎片和细胞核碎片；下层是较重的原生质体。

3. 将下层的原生质体用吸管或移液器小心地取出，并用缓冲液洗涤去除杂质。

二、梯度离心法梯度离心法是一种通过调整离心管中梯度浓度来分离不同细胞器的方法。

该方法可以得到纯度较高的原生质体。

具体步骤如下：1. 准备一个离心管，在离心管中加入不同浓度的梯度液，通常是葡萄糖或蔗糖梯度。

2. 将植物组织切碎并加入适量的缓冲液，制备细胞破碎液。

3. 将细胞破碎液轻轻地加入离心管中，避免与梯度液混合。

4. 用离心机以较高的转速离心，离心后不同细胞器会在离心管中分层。

原生质体一般会沉于梯度液的某一位置。

5. 小心地用吸管或移液器将原生质体分离出来，并用缓冲液洗涤去除杂质。

三、差速离心法差速离心法是一种通过调整离心速度来分离原生质体的方法。

该方法适用于分离密度较接近的细胞器。

具体步骤如下：1. 将植物组织切碎并加入适量的缓冲液，制备细胞破碎液。

2. 用低速离心将细胞破碎液离心一次，去除细胞碎片和细胞核碎片。

3. 将上一步得到的上清液转移至另一个离心管中，用较高的离心速度离心，原生质体会沉于离心管的底部。

4. 小心地将原生质体分离出来，并用缓冲液洗涤去除杂质。

四、亲和层析法亲和层析法是一种通过利用生物分子之间的特异性相互作用来分离原生质体的方法。

该方法适用于需要分离特定蛋白质的情况。

实验五 植物原生质体的分离与纯化 2017.10.266. 实验结果与分析6.1实验结果图1.光学显微镜下菠菜原生质体观察（物镜×40倍） H ：完整原生质体 K ：被压碎的原生质体 P ：细胞壁Q ：梯细胞 W ：原生质体碎片结果描述：光学显微镜下，完整的菠菜原生质体为圆形或椭圆形，颜色为中间浅边缘深的绿色，色泽分布不均匀，为颗粒状分布；被压碎的原生质体为松散状聚在一起，绿色；视野中还有一些绿色的原生质体碎片；被分离的细胞壁为透明的圆形；梯细胞为透明螺旋状，形似梯子。

原生质体纯度：完整原生质体/总原生质体=27/65=41.5％① ② ③ ④ HP Q H K W结果分析：光学显微镜下原生质体为颗粒状的绿色不均匀分布是由于光学显微镜下看到的是原生质体的叶绿体，所以为颗粒状分布，又因为叶绿体大多沿细胞膜分布，所以原生质体的边缘会比中央的颜色要深；因为菠菜的细胞去除了细胞壁，所以在高渗溶液下原本方形的原生质体变为椭圆形。

由于在制作悬浮液或离心时会对原生质体造成冲击，所以会有一些原生质体破碎。

梯细胞最终发育为维管。

原生质体的纯度为41.5％，相对来说结果还算理想，因为去除细胞壁的原生质体较为脆弱，很容易受到破坏。

W ：完整原生质体 K ：被压碎的原生质体 P ：木质素Q ：原生质体碎片结果描述：荧光显微镜下完整的菠菜原生质体为圆形或椭圆形，颜色为中间浅边缘深的红色，色泽分布不均匀，为颗粒状分布；被压碎的原生质体为松散状聚在一起，红色；视野中还有一些红色的原生质体碎片和呈黄色的木质素。

结果分析：荧光显微镜下完整的菠菜原生质体为红色，主要是因为在荧光下叶绿体泛红光，主要通过观察叶绿体来辨别原生质体的具体形态。

因为叶绿体大多沿细胞膜分布，所以原生质体的边缘会比中央的颜色要深，又因为菠菜的细胞去除了细胞壁，所以在高渗溶液下原本方形的原生质体变为椭圆形。

视野中呈透明黄色的为木质素，为细胞壁的成分。

植物原生质体培养的技术流程一、原生质体的分离解离液的准备：解离液的组成和浓度直接影响原生质体的分离效率。

常用的解离液包含酶类，如纤维素酶和果胶酶，它们能够分解植物细胞壁。

根据不同植物材料的特性，调整酶液的浓度和pH值，确保其能有效地分解细胞壁而不损伤细胞质。

原生质体的分离与纯化：解离后，将混合液通过筛网过滤，以去除未解离的细胞碎片。

然后，将过滤后的液体转移到离心管中，以低速离心收集原生质体。

使用适当的密度梯度离心技术进一步纯化原生质体，去除细胞碎片和其他杂质。

二、原生质体的培养培养基的选择与准备：原生质体的培养需要合适的培养基，通常选择含有碳源、矿质元素、维生素和生长调节剂的培养基。

培养基的配方会根据不同植物物种和实验目的进行调整。

培养基在使用前需要经过高压灭菌，以确保无菌条件。

原生质体的接种：将纯化后的原生质体悬液接种到固体或液体培养基上。

对于固体培养基，可以将原生质体悬液均匀地涂布在培养基表面。

对于液体培养基，则将原生质体悬液直接倒入培养瓶中。

接种后，培养基应保持无菌环境，并在适宜的温度和光照条件下进行培养。

培养环境的控制：原生质体的培养环境包括温度、湿度、光照等。

一般情况下，原生质体的培养温度为2528℃，光照条件则根据植物种类和培养目的进行调整。

保持适宜的环境条件，有助于原生质体的生长和分化。

三、原生质体的再生诱导再生：在适宜的培养条件下，原生质体开始分化成愈伤组织或小芽。

根据不同植物的需求，可能需要在培养基中添加特定的生长调节剂，如细胞分裂素、赤霉素等，以促进愈伤组织或芽的形成。

转化与选择：对于转基因实验，可能需要使用农杆菌介导的转化方法将外源基因导入原生质体中。

转化后的原生质体应在选择培养基上培养，以筛选出成功转化的细胞。

选择培养基通常含有抗生素，以筛选含有抗性基因的细胞。

分化与生根：成功转化的细胞在培养基中继续生长，并开始分化为完整的植物组织。

此阶段通常需要切换到生根培养基，以促使愈伤组织或芽生根。

实验七植物原生质体的分离和培养一、实验目的：了解植物原生质体分离的基本原理及其过程二、实验原理：植物原生质体是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞”，是开展基础研究的理想材料，在植物遗传工程和育种研究上具有广阔的应用前景。

是植物同源、异源多倍体获得的途径之一，不仅能克服远缘杂交有性不亲和障碍，也可克眼传统的通过有性杂交诱导多倍体植株的麻烦，最终将野生种的远缘基因导入栽培种中，原生质体融合技术可望成为作物改良的有力工具之一。

植物原生质体培养方法起源于植物单细胞的培养方法。

1954年，植物单细胞培养才获得成功。

Mllir 培养的万寿菊及烟草悬浮细胞植入到长有愈伤组织的培养基上得到了它们的单细胞克隆，并建立了看护培养的方法；1960年Jones等建立了微室培养法。

同年，Cocking应用酶法分离原生质获得成功，从而在实验条件下很容易获得大量的原生质体。

随着多种适用于原生质体分离的商品酶的出现，原生质体的培养方法也得到了不断地改进，其中酶解法分离原生质体是一个常用的技术，其原理是基于植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁，获得原生质体。

其原理是根据由纤维素酶、果胶酶和半纤维素酶配制而成的溶液对细胞壁成分的降解作用，而使原生质体释放出来。

原生质体的产率和活力与材料来源、生理状态、酶液的组成，以及原生质体收集方法有关。

酶液通常需要保持较高的渗透压，以使原生质体在分离前细胞处于质壁分离状态，分离之后不致膨胀破裂。

渗透剂常用甘露醇，山梨醇，葡萄糖或蔗糖。

酶液中还应含一定量的钙离子，来稳定原生质膜。

游离出来的原生质体可用过筛一低速离心法收集，用蔗糖漂浮法纯化，然后进行培养。

三、实验用品1、器材：三角瓶、离心管、烧杯、200目滤网、解剖刀、长、短镊子、培养皿、滤纸、0.2μm滤膜、滤器、培养瓶、台式离心机、高压灭菌锅。

2、实验材料：菠菜叶片3、试剂：（1）、酶解液成分如下：纤维素酶(cellulase，Onozuka )2%；果胶酶(13ectinase，Serva) 1 % (若用国产EA3-867纤维索酶，则果胶酶可省去。

实验九植物原生质体的分离和培养实验目的掌握植物原生质体分离和培养的基本方法，并对培养的结果进行初步观察。

实验原理原生质体是除去细胞壁的裸露细胞。

在适宜的培养条件下，分离的原生质体能合成新壁，进行细胞分裂，并再生成完整植株。

实验用品一、材料1.烟草幼苗的叶片、或向日葵无菌苗的叶片、子叶或下胚轴等。

2.胡萝卜根切片诱导的松软愈伤组织。

二、器材超净工作台、台式离心机或手摇离心机、倒置显微镜、普通显微镜、培养室、灭菌锅、血细胞计数板、石蜡膜带等。

细菌过滤器和0·45μm的滤膜、300目不锈钢网筛及配套的小烧杯、解剖刀、尖头镊子、注射器(5、10m1)和12号长针头、带皮头的刻度移液管(5、10ml，上部管口加棉塞)、培养皿(直径6cm)或扁平培养瓶(50m1)、大培养皿、吸水纸等、使用前需经过灭菌。

三、试剂1.70％酒精。

2.0.1％升汞水溶液，并滴入少许TWeen80。

3.灭菌蒸馏水。

4.0.16mo／L和0.20mo／LCaCl2·2H2O溶液，并加有0.1％MES（2-N-吗啉已烷磺酸），PH5.8~6.2。

5.20％和12％蔗糖溶液，pHPH5.8~6.2。

6.酶液A纤维素酶(cellulae，OnozukaR-102％果胶酶(13ectinae，Serva)1%(若用国产EA3-867纤维索酶，则果胶酶可省去。

)甘露醇0.6mol／LCaCl2·2H2O0.05mol／LMES0.1％pH5．8～6．27．酶液B纤维素酶(OnozukaR-10)2％离析酶(MacerozymeR-10)1％半纤维素酶(hemicellulae，Sigma)0.2％甘露醇0.4mol／LCaCl2·2H200.1％MESPH5.8～6.2表22-1DPD培养基成分NH4N03KN03MgSO4·7H20CaCl2·2H2OKH2P04FeSO4·7H20Na2-EDTAMnSO4·H2ONa2MoO4·2H2OH3BO3ZnSO4·7H2OCuSO4·5H2OCoCl2·6H2 O9．C81V培养基(表22-2)表22-2C81V培养基成分NH4N03柠檬酸铵尿素MgSO4·7H20CaCl2·2H2OKH2P04NaHCO3FeSO4·7H20Na2-EDTAMnSO4·H2OKICoCl2·6H2OZnSO4·7H2OCuSO4·5H2OH3BO3Na2MoO4·2 H2O含量（mg/L）100010010025040010015027.837.3100.750.02520.02530.25成分烟酸盐酸吡哆锌盐酸硫胺素肌醇叶酸水解酪蛋白甘氨酸谷氨酰胺色氨酸胱氨酸蛋氨酸胆碱葡萄糖玉米素萘乙酸pH含量（mg/L）111020015001010010105100.38mol／L0.10.25.8含量（mg/L）27014803405708027.837.350.1220.0150.01成分KI烟酸盐酸吡哆锌盐酸硫胺素肌醇叶酸甘氨酸生物素蔗糖甘露醇2，4一D激动素pH含量（mg/L）0.2540.741000.41.40.0420000.3mol ／L10.55.88．DPD培养基(表22-1)10.0.1％酚藏花红(配在0.4mol／L甘露醇中)。

获得植物原生质体的方法
1. 酶解法，使用细胞壁水解酶来去除植物细胞的细胞壁，从而释放原生质体。

这种方法通常涉及将植物材料暴露在酶解液中，然后通过轻微的振荡或离心来分离原生质体。

2. 筛选法，通过筛选植物组织中的原生质体来获得。

这种方法通常涉及将植物材料通过筛网或离心过滤，以分离原生质体。

3. 离心法，利用离心技术来分离植物细胞的不同部分，包括原生质体。

这种方法通常需要使用不同离心速度和时间来分离不同密度的细胞组分。

4. 化学法，使用化学试剂来破坏细胞壁，释放原生质体。

这种方法可能包括对植物组织进行化学处理，如酸碱处理或有机溶剂处理。

5. 超声波法，利用超声波技术来破坏细胞壁，释放原生质体。

这种方法通常需要对植物组织进行超声波处理，以实现细胞壁的破坏和原生质体的释放。

总的来说，获得植物原生质体的方法可以根据实验需要选择合适的方法。

每种方法都有其优缺点，研究人员需要根据实际情况选择最适合的方法来获得高质量的原生质体。

实验六植物原⽣质体的分离和培养实验六植物原⽣质体的分离和培养⼀．教学⽬标：了解植物原⽣质体作为细胞⼯程研究的重要意义，了解原⽣质体活性鉴定的原理。

掌握分离和培养原⽣质体的技术、⽅法和原理。

掌握细胞活性的检测⽅法。

掌握细胞计数的原理和⽅法。

⼆．重点：掌握分离和培养原⽣质体的技术、⽅法和原理。

掌握细胞活性的检测⽅法。

掌握细胞计数的原理和⽅法。

三．难点：分离和培养原⽣质体的技术。

四．授课⽅式与教学⽅法：讲解原理、实验操作⽰范或具体指导。

五．教学内容:实验原理植物原⽣质体(protoplast)是除去细胞壁后为原⽣质所包围的“裸露细胞”,是开展基础研究的理想材料。

其中,酶解法分离原⽣质体是⼀个常⽤的技术,其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成,因⽽使⽤纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分,除去细胞壁,即可得到原⽣质体。

由于原⽣质体内部与外界环境之间仅隔⼀层薄薄的细胞膜,必须保持在渗透压平衡的溶液中才能保持其完整性, 使原⽣质体分离后不致膨胀破裂，渗透剂常⽤⽢露醇或蔗糖，酶液还应含⼀定Ca2+来稳定原⽣质膜。

其次,还应当考虑取材、酶的种类和纯度、酶液的渗透压、酶解时间及温度等因素对分离原⽣质体的影响。

将原⽣质体接种在培养基上进⾏培养，细胞壁再⽣，细胞分裂和再⽣植株。

测定原⽣质体的活性有多种⽅法。

荧光素双醋酸酯(FDA)染⾊是常⽤的⼀种⽅法,FAD 本⾝⽆荧光,⽆极性,可透过完整的原⽣质膜。

⼀旦进⼊原⽣质体后,由于受到酯酶分解⽽产⽣具有荧光的极性物质荧光素。

它不能⾃由出⼊原⽣质膜,因此有活⼒的细胞能产⽣荧光,⽆活⼒的原⽣质体不能分解FAD⽆荧光产⽣。

细胞计数⼀般⽤⾎细胞计数极，按⽩细胞计数法进⾏计数。

从理论上讲，植物体的任何⼀部分都可以通过酶解作⽤去除细胞壁⽽得到原⽣质体。

但在实际操作中，只有幼嫩的组织才能完成去壁的过程。

所以，为了制备健康的原⽣质体，⼀般选⽤根尖、茎尖、嫩叶及对数⽣长期的愈伤组织为材料，⼀旦细胞具有⽊质化或次⽣加厚的外壁，则不能被酶降解。