植物原生质体融合技术

原生质体融合技术的局限性植物原生质体是指用特殊方法去细胞壁的、裸露的、有生活力的原生团。

这种裸露细胞在适当的外界条件下，还可形成细胞壁，进行有丝分裂，形成愈伤组织和诱发再生植株，因而仍然具有细胞的全能性。

植物原生质体融合技术是借鉴于动物细胞融合的研究成果，在原生质体分离培养的基础上建立起来的，以植物的原生质体为材料，通过物理、化学等因素的诱导，使两个原生质体融合在一起以致形成融合细胞的技术。

它不是雌雄孢子之间的结合，而是具有完整遗传物质的体细胞之间的融合，是2种原生质体间的杂交。

通过原生质体融合可以把带有不同的基因组的两个细胞结合在一起，与有性杂交相比，无疑可以使“杂交”亲本组合的范围扩大，不但可以利用细胞核内基因资源，还可以利用包含在细胞质中的诸如叶绿体和线粒体DNA的遗传资源。

原生质体培养是细胞杂交的基础，但是直到目前为止，也只有360多个种的原生质体培养再生了完整的植株，大多数重要的植物尤其是木本植物如葡萄、棕榈、橡胶、茶、香蕉、椰子和芒果等的原生质体再生仍然很困难，或者还未进行深入研究。

在原生质体再生的物种中，茄科占了将近1/4，并且用于育种目的的大多数体细胞杂种和细胞质杂种也比较集中于茄属、烟草属、苜蓿属、柑橘属、芸薹属和番茄属等6个属中。

因此，为了有效地进行植物遗传改良，不但要使杂种细胞再生成完整植物，而且还必须提高植株再生的频率，以便有足够的群体进行有效的选择。

但目前存在的一个普遍的问题使许多原生质体再生的程序似乎较低，重复性较差，并且还具有基因型的依赖性。

为了将体细胞杂交技术应用于更多的植物中，还需要更加深入地研究植物细胞的分化、脱分化和再分化等发育机制。

1.技术局限性植物细胞杂交的本质是将两种不同来源的原生质体，在人为的条件下进行诱导融合。

由于植物细胞的全能性，因此融合之后的杂种细胞，可以再生出具有双亲性状的杂种植株。

因此，细胞融合也叫原生质体融合或细胞杂交。

其包括三个主要环节：诱导融合；选择融合体或杂种细胞；杂种植株的再生和鉴定。

原生质体融合操作方法
原生质体融合是将两个或更多的细胞融合在一起，以形成单一的细胞。

在实验室中，原生质体融合可用于合成杂交细胞或研究细胞膜蛋白质交互作用。

以下是一种常用的原生质体融合操作方法：
1. 制备原生质体：收获新鲜的植物细胞并环绕其周围的细胞壁。

用酶类解除细胞壁以获得原生质体。

2. 制备混合物：在离心管中将两种原生质体混合并加入缓冲液。

3. 让细胞融合：通过高渗透压或电脉冲使膜破裂或局部破损，让细胞形成互通。

4. 分离融合物：将融合物分离出来，并放在一个合适的培养基上培养。

5. 检测融合结果：使用显微镜观察细胞是否真正融合，或使用特定的抗体标记来检测融合后的细胞表面分子。

需要注意的是，原生质体融合需要谨慎操作，避免损坏细胞结构或引入杂质。

在实验中，需要仔细选择不同类型的原生质体，以确保它们能够融合。

植物原生质体融合的方法
植物原生质体融合技术是一种准确、灵活和快速的分子育种技术，它可以将一种植物中的遗传物质与另一种植物的遗传物质融合在一起，以获得更有效的育种方法。

下面介绍植物原生质体融合技术的基本概念和其应用：
一、植物原生质体融合技术的基本概念
1、原生质体的定义：原生质体（Protoplast）是指细胞原有的稳定的液体质结构，在植物细胞当中占据重要的分子物质，可以被用来搅拌，冷冻，施主或克隆植物细胞的核酸，蛋白质以及其他的分子物质。

2、破壁法的原理：破壁法是一种用于分离出植物原生质体的方法，它利用酶和/或静电力，这种酶使细胞壁细胞可以被剥离出来，从而形成原生质体。

3、原生质体融合技术：原生质体融合技术就是利用破壁法将不同植物的原生质体融合起来，以获得新的基因组的遗传材料，从而为植物的育种提供了新的思路。

二、植物原生质体融合技术的应用
1、引入新基因：原生质体融合技术可以有效地引入一些新的基因材料到植物细胞，从而改变植物的性状特征，从而获得抗逆性、抗病性、烘焙品质和其他重要特征，使植物更适应环境条件。

2、突变：通过将不同植物原生质体融合起来，可以引发基因突变，从
而获得新的外观形状或性状，更好地提高植物的繁殖力和适应性。

3、抗逆育种：原生质体融合技术可以有效地增强植物细胞体抗病性和抗逆性，从而大大提高植物的耐受性，使一些极端的环境能够更好地适应植物的生长和发育。

总而言之，植物原生质体融合技术旨在将宿主植物中基因携带的遗传改良物质融入受体细胞中，以获得更多优良育种材料，从而提高植物的适应性和抗逆性，从而提升作物的产量。

原生质体融合的方法原生质体融合又叫体细胞杂交，是指将不同来源的植物原生质体进行融合，再经培养获得杂种植株的过程。

一、盐类融合法1909年，Kuster用低渗NaNO溶液引起原3生质体的融合。

融合方法获得1972年，Carlson等用NaNO3了第一株体细胞杂种，即烟草与其野生种间体细胞杂种（粉蓝烟草与郎氏烟草）。

原理：NaNO3、KNO3、Ca(NO3)2、NaCl、CaCl2等。

通过改变细胞膜表面的理化特性，增加细胞的内吞作用，而实现融合。

应用最早的融合法，但由于异核体形成率低，且对细胞有毒害，目前已不太应用。

二、高钙-高pH融合法1973年，Keller和Melchers用强碱性的高浓度钙离子（5mM CaCl2·2H2O，pH10.5）溶液融合烟草叶肉原生质体，获得种内及种间体细胞杂种。

原理：CaCl 2•2H 2O 0.05mol /L ，pH9.5-10.5，可使质膜表面特性发生改变，而发生融合。

异核体形成率有所提高，但对细胞有一定毒害，目前已不太应用。

三、聚乙二醇（PEG）融合法1974年，Kao和Michaylub用聚乙二醇(PEG)作融合剂，明显提高了异核体的形成率，且对细胞的毒性很低。

因此，该方法迅速展开。

1978年，用PEG法，成功获得了西红柿与马铃薯第一个属间体细胞杂种。

薯番茄或番茄薯PEG融合原理：短时间内，细胞质膜粘连，形成分子桥，进行融合。

四、PEG 、高钙-高pH 相结合的融合法PEG 融合液PEG600030%Ca(NO 3)2•4H 2O0.1M 甘露醇0.4-0.6M pH 10.0五、电融合法开发较晚，1979年，Senda发现电融合方法。

由于对细胞无毒害，已广泛应用。

电融合必须有融合仪和融合板。

电融合仪融合板两个电极原生质体电融合的基本程序①细胞膜的接触：两极通以交变电流，使原生质体沿电场方向排列成串珠状；②膜的击穿：再给以瞬间的高强度电脉冲，使原生质体膜局部受损失而导致融合。

1 引言原生质体融合（protoplast fusion）亦称细胞融合（cell fusion）、体细胞杂交（somatic hybridization）、超性杂交（Para sexual hybridization）或超性融合（Para sexual fusion ），是指不同种类的原生质体不经过有性阶段，在一定条件下融合创造杂种的过程[1]。

植物细胞融合技术包括原生质体的制备、细胞融合的诱导、杂种细胞的筛选和培养，以及植株的再生和鉴定等环节。

原生质体融合涉及了双亲的细胞质，它不仅可以把细胞质基因转移到全新的核背景中，也可使叶绿体基因组或线粒体基因组间重新组合。

原生质体融合还可避免受精作用中的种的特异性配子识别反应，有可能打破远亲杂交中的有性不亲和界限。

原生质体技术还可用于种质资源的保存、细胞突变体的筛选、细胞器移植和外源DNA的导入等方面。

原生质体融合技术起源于20世纪60年代，是基因重组技术的一部分。

经过一定的理化条件处理,使外源目的基因进入受体细胞，并得以表达，以期使得受体细胞在原有性状的基础上，获得所需的新的特殊性状[2]。

1953年we bull首先用肤聚糖水解酶，溶菌酶得到巨大芽胞杆菌的原生质体，1960年Cocking用酶法分离出番茄根原生质体后，Nagata等首次利用烟草叶分离原生质体，经培养获得再生植株，1972年Carlson等以烟草获得了体细胞杂种[4] ，1974年高国楠发现聚乙二醇（PEG）在钙离子存在的条件下能促使植物细胞原生质体融合，1975年Vardi等首次从木本植物Shamonti甜橙珠心组织诱导胚性愈伤组织，并从愈伤组织分离原生质体,经培养通过胚状体再生出植株，1985年Fujimura等率先在水稻原生质体培养中获得了再生植株并从许多种内、种间、属间甚至亚科间的体细胞杂交获得杂种细胞系或杂种植株。

随着多种植物原生质体的成功培养和融合技术的不断改进，植物细胞融合获得了巨大成功。

植物细胞原生质体融合方法
植物细胞原生质体融合方法：
聚乙二醇（PEG）介导的融合：使用聚乙二醇（PEG）将原生质体暴露在高渗透性的聚乙二醇溶液中，促使原生质体相互融合。

电脉冲介导的融合：通过将原生质体置于电场中，施加电脉冲使质膜产生短暂的孔隙，使得两个原生质体可以融合。

融合诱导剂介导的融合：一些融合诱导剂，如聚乙二醇和钙离子融合剂，可以在一定程度上促进原生质体的融合。

微操控介导的融合：在实验室条件下，可以使用显微操控技术，如显微注射器或显微操作夹，将两个原生质体精确地放置在一起，使它们发生融合。

基因枪介导的融合：基因枪将DNA或原生质体粒子投射到目标细胞中。

植物原生质体的融合技术探析植物原生质体的融合技术探析本文关键词：质体，探析，融合，植物，技术植物原生质体的融合技术探析本文简介：原生质体是组成细胞的一个形态结构单位,原生质体是指被去掉了细胞壁后的被细胞膜包围的＂裸露细胞＂,是开展基础研究的主要材料。

1960年英国科学家Cocking第一次用酶法大量制备原生质体,Cocking采用的方法是在番茄幼苗的根组织中加入可降解细胞壁的等渗酶液,在一定条件下培养植物原生质体的融合技术探析本文内容：原生质体是组成细胞的一个形态结构单位, 原生质体是指被去掉了细胞壁后的被细胞膜包围的＂裸露细胞＂, 是开展基础研究的主要材料。

1960年英国科学家Cocking第一次用酶法大量制备原生质体, Cocking采用的方法是在番茄幼苗的根组织中加入可降解细胞壁的等渗酶液, 在一定条件下培养一段时间后, 发现大部分细胞的细胞壁被降解, 从而制备出大量有活力的原生质体。

1、原生质体融合的目的及意义原生质体融合技术可克服不同原生质体间的排斥力, 使两种不同种属的原生质体间发生膜融合、胞质融合和核融合, 进而形成具有含两种遗传物质的杂交细胞, 克服远缘杂交的不亲和性和子代不育等障碍。

另外, 可转移优良的生物性状, 实现基因重组, 而改良现有品种。

目前原生质体融合所改良的目标性状包括抗冻、抗干旱、抗病毒、抗虫、耐高盐等, 还可按照人们预先的期望创造出新物种。

2、原生质体的融合方法2.1、自发融合在酶解细胞壁形成原生质体的过程中, 相邻的原生质体会因细胞间胞间连丝的扩展和粘连而彼此融合形成同核体(homokaryon) 。

每个同核体内可包含两个或多个核, 这种类型原生质体的融合被称作为自发融合。

多核融合体常出现在植物幼嫩叶片或分裂旺盛的培养细胞制备的原生质体中。

如在玉米胚乳愈伤组织细胞和玉米胚悬浮细胞原生质体中, 大约有50%是多核融合体。

2.2、高p H-高Ca2+法通常情况下, Ca2+影响细胞融合的效率比Na+和K+要低, 但是在高p H环境下, 高浓度的Ca2+影响细胞融合的效率大大升高。

原生质体融合化学方法一、原生质体融合化学方法的基本概念原生质体融合化学方法呢，就是一种超酷的生物技术手段哦。

简单来说，就是让不同的原生质体通过化学物质的作用融合到一起。

就像是把不同颜色的小珠子，用一种神奇的胶水粘到一块儿。

这里的原生质体就像是一个个小小的细胞世界，里面包含着各种细胞器之类的东西。

比如说植物细胞的原生质体，它就有叶绿体啊，线粒体这些重要的成员。

那化学方法就是扮演着牵红线的角色，让这些原生质体凑到一起，开启一段奇妙的融合之旅。

二、常用的化学融合剂1. 聚乙二醇（PEG）这可是原生质体融合化学方法里的大明星呢。

PEG就像是一个超级社交达人，能把不同的原生质体拉到一起。

它通过改变原生质体的膜特性，让它们的膜变得更容易相互靠近，然后就融合啦。

这个过程就像是在一个大派对上，PEG这个热情的家伙把两个原本不认识的小伙伴拉到一起，然后他们就成了好朋友，紧紧地挨在一起，最后融合成一个新的整体。

2. 硝酸钠硝酸钠也是一种可以用来促进原生质体融合的化学物质哦。

它的作用方式和PEG不太一样，但目的都是一样的，就是让原生质体融合。

它可能就像是一个比较含蓄的介绍人，虽然没有PEG那么直接热情，但也能在原生质体融合这件事情上起到自己的作用呢。

三、原生质体融合化学方法的操作步骤1. 原生质体的制备这可是整个融合过程的基础哦。

要先把细胞的细胞壁去掉，这样才能得到原生质体。

对于植物细胞来说，一般会用到一些酶来分解细胞壁，就像用小剪刀把细胞壁这个围墙给剪掉一样。

这个过程得小心翼翼的，就像拆一个精美的小包裹，不能太粗鲁，不然原生质体可能就会受到损伤啦。

2. 融合剂的添加把准备好的原生质体放到合适的溶液里，然后加入融合剂，就像在一杯果汁里加入特别的调料一样。

不同的融合剂添加的量和条件都不太一样，这就需要我们根据实际情况来调整。

就像做饭的时候，不同的菜谱对调料的用量和添加顺序都有要求呢。

3. 融合后的处理当原生质体融合成功之后，可不能就这么不管它们啦。

人工诱导植物原生质体融合的方法
人工诱导植物原生质体融合的方法有以下几种：
1. 超声波处理法：将含有植物原生质体的悬浮液经过超声波处理，在超声波的作用下，原生质体的融合效果会得到提高。

2. 电融合法：利用电场的作用促使原生质体融合。

将含有植物原生质体的悬浮液放置在电融合装置中，通过调节电场强度和持续时间来诱导原生质体的融合。

3. 化学诱导法：利用化学物质（如聚乙二醇）改变原生质体的细胞膜的渗透性，使原生质体能够互相融合。

4. 高温处理法：将原生质体悬浮液暴露在较高的温度下，通过高温的作用促使原生质体融合。

5. 培养基优化法：通过改变培养基中的成分和浓度，调节pH
值等条件来提高原生质体融合的效率。

需要注意的是，不同植物原生质体融合的条件可能会有所不同，以上方法仅供参考，具体的操作条件需要根据实际情况进行优化和调整。