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04第四章 灭活剂、保护剂和免疫佐剂(兽医生物制品学)

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生物制品的灭活剂、佐剂及保护剂

生物制品的灭活剂、佐剂及保护剂

第四章兽医生物制品的灭活剂、佐剂及保护剂【知识目标】·熟悉兽医生物制品生产中常用的灭活剂、佐剂及保护剂；·理解灭活剂、佐剂及保护剂在兽医生物制品生产中的作用；·掌握·灭活剂、佐刺、保护剂的概念；·影响灭活剂作用的因素；·影响保护剂效能的因素。

·了解·佐剂的基本要求及类型；·保护剂的组成、效能。

【能力目标】·能进行白油佐剂的乳化。

第一节灭活与灭活剂为了提高兽医生物制品的安全性、防止散毒，许多疫苗通常通过灭活制成无毒力和无感染性的制品，灭活乃是兽医生物制品中的一项基本技术。

一、灭活及灭活剂的概念灭活(inanimation)，是指破坏微生物的生物学活性、繁殖能力及致病性，但尽可能不影响其免疫原性，用以制备灭活疫苗。

广义的灭活尚包含灭能(inactivation)，即使一些活性物质(微生物及其代谢产物、激素、酶、血清因子和抗体等)丧失活力的过程。

各种灭活疫苗、诊断抗原等的制造过程均属于灭活；血清经56℃加热30min处理，使补体丧失活性、破坏某些抑制因子的过程，以及破伤风毒素经甲醛处理后即失去致病性成为类毒素的过程均为灭能。

用来灭活的药物称为灭活剂，又称化学灭活剂。

化学灭活是制备灭活苗最重要的手段。

二、灭活的类型按其灭活作用的性质可将灭活分为物理灭活和化学灭活两类，尤以化学灭活法效果确实、方法简便而最为常用。

但不同的微生物、活性物物质采取灭活方法、灭活剂也不尽相同，因此，选择合适的灭活剂和灭活方法对研制灭活兽医生物制品十分重要。

(一)物理灭活一般常用热灭活、超声波灭活、紫外线灭活和γ射线灭活等方法杀死微生物或消除其毒性。

热灭活最早由Smith等研制猪霍乱灭活菌苗时提出，后来发现热灭括容易发生菌体蛋白质变性。

过去用加热灭活方法者较多。

该法简单易行，但加热杀死微生物的方法比较粗糙，容易造成菌体蛋白质变性，凶而免疫原性受到明显影响。

兽用疫苗保护剂和佐剂讲解

兽用疫苗保护剂和佐剂讲解

一些常用的冷冻干燥保护剂
分类
保护剂
复合物 糖类 盐类 醇类 酸类 聚合物
脱脂乳、明胶、蛋白质、蛋白胨、糊精、血清、甲基纤维素等 蔗糖、乳糖、麦芽糖、葡萄糖、果糖等 乳酸钙、谷氨酸钠、氯化钠、氯化钾、醋酸铵、硫代硫酸钠等 山梨醇、甘油、甘露醇、肌醇、木糖醇等 柠檬酸、酒石酸、氨基酸等 葡聚糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮 (PVP) 等
助于抗原性物质在胞内被加工，被 MHC 分子特异性的结合、保护、运输并递 呈给效应细胞。
②抗原寻的（ antigen targeting ）
指抗原传递给免疫系统中适当效应细胞的效率。包括 吸引巨噬细胞到达组织部位、活化吞噬细胞、促进抗原 与细胞受体的结合等有重要作用。
③免疫调节（immune modulation ） 是指任何可以修饰的免疫效应细
２、保护剂浓度：严格按照配方执行。 ３、保护剂配制方法：糖类不能用121℃高压灭菌处理。 ４、保护剂酸碱度（PH 值）：主要对M的影响。
三、常用的冻干保护剂（稳定剂） 明确不同种类微生物需要添加不同保护剂
（一）细菌的保护剂 ① 需氧或兼氧厌氧菌：５％蔗糖脱脂乳或５％蔗糖、 1.5％明胶； ② 厌氧性细菌：含1.5％谷氨酸钠的１％乳糖或10％脱 脂乳或7.5％葡糖血清。 注：脱脂乳：20％脱脂奶粉溶于水配制而成。
疫苗冻干保护剂组成
1. 营养液： ? 可修复因冻干而受损的细胞，使冻干制品含有一定量水分； ? 可促进高分子物质形成骨架，使冻干制品呈多孔的海绵状， 增加溶解度 2. 赋形剂： ? 防止低分子物质的碳化和氧化，保护活性物质不受加热影响 ? 使冻干制品形成多孔性、疏松的海绵状物，增加溶解度 3. 抗氧化剂： ? 抑制冻干制品中的酶作用，增加生物活性物质在冻干后贮存 期间的稳定性，如维生素C、维生素E和硫代硫酸钠等。

项目四 灭活剂、保护剂与免疫佐剂

项目四 灭活剂、保护剂与免疫佐剂

三、影响灭活作用的因素
⒈灭活剂特异性：石炭酸对真菌和病毒效果差，甲醛 最常用。 ⒉微生物的种类和特性：一般含氮量越高，甲醛等灭 活剂的消耗量就越大，灭活脱毒速度越慢。 ⒊灭活剂浓度（一定要合适） ⒋灭活温度（具体不同病原体和或毒素，其灭活时间 和温度不一致）。 ⒌灭活时间：随灭活剂浓度及温度升高，灭活时间则 缩短。 ⒍PH：微酸时灭活速度慢，抗原性保持较好。 ⒎有机物的存在：被灭活的病毒或细菌液中，如果含 有血清或其它有机物质，会影响灭活剂的灭活能力。
当以水为分散相，以加有乳化剂的油为连续相时，制
成的乳剂为油包水型乳剂（水／油或W／O），是生物 制品采用的主要剂型。
白油佐剂
一种好的乳剂苗，应该是W／O或O／W型，粘度较低， 颗粒大小均匀，稳定性良好，呈乳白色。
（四） 蜂胶佐剂 （五）ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ生物佐剂
三、新型免疫佐剂
1、细胞因子类 2、免疫刺激复合物
二、常用灭活剂的应用
⒈甲醛溶液：最常用 2.苯酚（石炭酸）：用于防腐，很少用于疫苗研制。 3.结晶紫：蛋白质变性。（溶于有机溶剂）用于诊断抗原 的制备：鸡白痢抗原 4.β-丙内酯 狂犬病灭活苗制备所用 5 烷化剂 乙酰基乙烯亚胺 二乙烯亚胺 缩水甘油醛 6 硫柳汞 用于生物制品的防腐和消毒。 7 缩水甘油醛 注意：灭活剂对人有害，有时对皮肤黏膜有强烈刺激性。
④干扰素类生物活性物质的保存：加葡聚糖。
二、冻干保护剂的组成
⒈低分子物质（营养液）：
营养液：脱脂乳、蛋白胨、氨基酸、和糖类 等 ⒉赋形剂(高分子物质）骨架
赋形剂：蔗糖、山梨醇、乳糖、PVP、葡聚 糖等 ⒊抗氧化剂 抗氧化剂：Vit.C、Vit.E和硫代硫酸钠等

兽医生物制品学 教学大纲

兽医生物制品学 教学大纲

兽医生物制品学Veterinary Biologicology一、课程基本情况课程编号：05130245课程总学时：32 (讲课32 ，实验0 ，上机0 ，实习0 ，课外学时0)课程学分：2课程分类：选修开设学期：春开课单位：动物医学院预防兽医系传染病微生物教研室适用专业：动物医学所需先修课：动物免疫学、兽医微生物学、家畜传染病学课程负责人：二、课程内容简介兽医生物制品学是动物医学专业的选修课。

本课程以兽医生物制品为核心，由兽医生物制品的基本知识、兽医生物制品的生产技术和生物制品制造实例三个部分所组成。

兽医生物制品的基本知识包括：兽医生物制品的概念及分类；我国兽医生物制品发展的历史与成就；兽医生物制品学的发展前景；灭活剂、保护剂与佐剂。

兽医生物制品的生产技术包括：兽医生物制品生产的基本程序和技术；兽医生物制品制造的新技术；兽医生物制品的质量监控。

生物制品制造实例包括细菌性疫苗、病毒性疫苗、诊断制剂和治疗制剂的制造过程和检验规程。

Veterinary Biologicology is an elective course for the students in College of Animal Medicine. This curriculum take the veterinary biological products as a core, which is composed of three parts namely the elementary knowledge of veterinary biologics, the manufacture technologies of veterinary biologics and the manufacture examples of several veterinary preparations. The first part includes the concepts and classifications of veterinary biologics, the development history and achievement about veterinary biologics in our country, the veterinary biologics prospects for development, and inactivators, protectors and immunologic adjuvants. The second part includes the main routines and technologies, the new technologies and the quality monitoring of veterinary biologics. The third part includes the manufacture process and examination standards of bacterium vaccine, virus vaccine, diagnosis preparations and treatment preparations.三、各部分教学纲要1、课堂讲授部分教学内容要点、基本要求及学时数(32学时)第一章兽医生物制品学绪论（2学时）兽医生物制品学的概念、发展简史以及在动物疫病防制中的作用，我国兽医生物制品研究和生产的现状、存在的问题以及解决问题的对策。

兽用疫苗保护剂和佐剂

兽用疫苗保护剂和佐剂

兽用疫苗保护剂和佐剂
源文件
家畜用疫苗和佐剂
疫苗保护剂（vaccines）是一种生物制品，用于预防特定的传染病，
特别是传染性病毒性疾病，其核心成分是通过特定的方法培养出来的微生
物（如病毒、细菌或其他微生物），或者是受其影响的细胞组织的细胞组
织的结构，以及一种或多种被特定技术经过处理的特殊成分。

疫苗保护剂
的主要目的是刺激免疫系统，使其识别感染其中一种病毒或细菌所制造的
特殊物质，从而达到预防疾病的作用。

疫苗保护剂中的佐剂（adjuvants）是添加到疫苗中的其中一种物质，可以能够增强疫苗的作用。

疫苗保护剂的典型佐剂包括水溶性共价核酸、
油溶性混合物、羟基或其它的物质。

其作用是抑制疫苗保护剂中细胞组织
的细胞组织成分，以及使病毒蛋白的活性更高，从而增加疫苗的免疫效果。

家畜疫苗保护剂常用于特定的家畜，如家禽、家畜和动物等，以预防
它们感染病毒或细菌性疾病。

它们的作用是通过诱导免疫系统产生特异性
的抗体来防止或减轻家畜感染病毒和细菌性疾病的症状。

家畜疫苗保护剂
通常是由活的、活性免疫有力的，但毒性较低的微生物制成的，或者是由
体外特定技术处理而成的特殊细胞组织制成。

生物制品生产工艺—灭活剂、保护剂和免疫佐剂

生物制品生产工艺—灭活剂、保护剂和免疫佐剂
用途:羊痘、鸡新城疫、鸡痘和鸭瘟等病毒性活疫苗 的保护剂
2.明胶蔗糖保护剂
明胶2-3%(g/ml),蔗糖5%(g/ml),硫脲1%-2%(g/ml) 先将12%-18%明胶液,30%蔗糖液和6-12%硫脲液加 热溶解,116℃高压灭菌30-40min;或100℃灭菌3 次,每次30min.
用途:猪肺疫和猪丹毒等细菌性活疫苗保护剂
广义上讲：保护剂是保护微生物和寄生虫等活
力和免疫原及酶和激素等生物活性的一类物质，
还包括细菌或病毒的营养液、赋形剂和抗氧化剂。来自一些常用的冷冻干燥保护剂
分类
保护剂
复合物 糖类 盐类 醇类 酸类 聚合物
脱脂乳、明胶、蛋白质、蛋白胨、糊精、血清、甲基纤维素等 蔗糖、乳糖、麦芽糖、葡萄糖、果糖等 乳酸钙、谷氨酸钠、氯化钠、氯化钾、醋酸铵、硫代硫酸钠等 山梨醇、甘油、甘露醇、肌醇、木糖醇等 柠檬酸、酒石酸、氨基酸等 葡聚糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等
3.聚乙烯吡咯烷酮乳糖保护剂 取聚乙烯吡咯烷酮K30-35g和乳糖10g,加蒸馏水至 100ml,混合溶解,120℃高压灭菌20min
4.SPGA保护剂
蔗糖76.62g,磷酸二氢钾0.52g,磷酸氢二钾1.64g, 谷氨酸钠0.83g,牛血清白蛋白10g,加去离子水至 1000ml,混合溶解,过滤除菌.
四、常用的冻干保护剂
各种微生物适用的保护剂甚多，各国的配制方法 也各异。即使同一种制品所使用的保护剂组分也 不一样。
如：鸡新城疫弱毒疫苗，5%蔗糖脱脂乳；日本用 5%乳糖，0.15%聚乙烯吡咯烷酮,1%马血清或0.4% 蔗糖脱脂乳,0.2%聚乙烯吡咯烷酮
猪丹毒弱毒菌苗,我国用5%蔗糖,1.5%明胶冻干剂;
5.立克次氏体
10%脱脂乳

第四章 灭活剂和免疫佐剂

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注意
第四章 灭活剂和免疫佐剂
灭活病毒的重组—交叉复活作用：
• 死活病毒间的重组。例如将能在鸡胚中生长良好 的甲型流感病毒（A0或A1亚型）疫苗株经紫外线 灭活后，再加亚洲甲型（A2亚型）活流感病毒一 同培养，产生出具有前者特点的A2亚型流感病毒， 可供制作疫苗，此称为交叉复活(Cross reactivation)。
例如：经过56℃加热30分钟处理，可破坏诊断血清或待检血 清中的补体活性，从而避免补体对诊断的干扰作用。

一. 概述
• 生物制品意义上的灭活： • 利用物理或化学的方法，破坏微生物的生
物学活性，繁殖能力和致病性，尽可能不 影响其免疫原性。
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一. 概述
1. 物理学灭活 • 2. 化学灭活：用于灭活微生物的化学试剂或药物
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（二）烷化剂（Alkylating agent）
1. 缩水甘油醛（GDA）： • 50年代末合成的一种烷化剂，曾用于大肠杆
菌、噬菌体、新城疫病毒、口蹄疫病毒等灭活， 灭活效果优于甲醛。
• 本品易挥发，0-4℃保存3个月后含量下降，约 半年失效；20℃只能保存10 d。
• 灭活机制： • 环氧烷基作用于病毒蛋白、核酸而导致丧失毒
3. 二乙烯亚胺（BEI）： • 市购商品为0.2%的BEI溶液，0-4℃可保存1
个月； • 口蹄疫病毒灭活：最终浓度为0.02%，加入
2%硫代硫酸钠阻断。
13
（三）苯酚
• 又称石炭酸。有腐蚀性，而且有毒，易溶 于水及有机溶剂。
• 灭活机制：使微生物蛋白质变性和抑制如 脱氨酶、氧化酶等酶系统的活性，从而导 致微生物死亡。
（一）甲醛溶液 灭活浓度
通常：用于需氧菌苗灭活的浓度为0.1-0.2%；

兽医生物制品复习资料(朱善元版)

生物制品复习题第一章兽医生物制品的免疫学基础1. 抗原的定义：抗原是一类能刺激机体免疫系统发生免疫应答，并能与相应免疫应答产物在体内外发生特异性结合的物质。

2. 免疫应答：是机体免疫系统对抗原刺激所产生的以排除抗原为目的的生理反应过程3. 免疫应答的基本过程：免疫应答的发生,发展和最终效应是一个相当复杂,但又规律有序的生理过程,这个过程可以人为地分成三个阶段。

抗原识别阶段（antigen-recognitingphase）是抗原通过某一途径进入机体,并被免疫细胞识别,递呈和诱导细胞活化的开始时期,又称感应阶段。

一般，抗原进入机体后，首先被局部的单核-巨噬细胞或其他辅佐细胞吞噬和处理,然后以有效的方式（与MHCⅡ类分子结合）递呈给TH细胞；B细胞可以利用其表面的免疫球蛋白分子直接与抗原结合, 并且可将抗原递呈给TH细胞。

T细胞与B细胞可以识别不同种类的抗原，所以不同的抗原可以选择性地诱导细胞免疫应答或抗体免疫应答,或者同时诱导两种类型的免疫应答.另一方面，一种抗原颗粒或分子片段可能含有多种抗原表位，因此可被不同克隆的细胞所识别,诱导多特异性的免疫应答。

淋巴细胞活化阶段是接受抗原刺激的淋巴细胞活化和增殖的时期，又可称为活化阶段。

仅仅抗原刺激不足以使淋巴细胞活化,还需要另外的信号；TH细胞接受协同刺激后，B细胞接受辅助因子后才能活化；活化后的淋巴细胞迅速分化增殖,变成较大的细胞克隆。

分化增殖后的TH细胞可产生IL-2,IL-4,IL-5和IFN等细胞因子，促进自身和其他免疫细胞的分化增殖，生成大量的免疫效应细胞。

B细胞分化增殖变为可产生抗体的浆细胞，浆细胞分泌大量的抗体分子进入血循环，.这时机体已进入免疫应激状态,也称为致敏状态。

抗原清除阶段是免疫效应细胞和抗体发挥作用将抗原灭活并从体内清除的时期，也称效应阶段.这时如果诱导免疫应答的抗原还没有消失，或者再次进入致敏的机体，效应细胞和抗体就会与抗原发生一系列反应。

灭活剂保护剂和免疫佐剂


A12(SO4)3·18H2O+6NaOH→2Al(OH)3+2Na2SO4+18H2O
取氢氧化铝干粉50～55kg, 加 入6万毫升沸水中, 搅拌均匀; 倒入硫酸100kg, 爆沸至棕褐 色, 经30～60min后, 加温水, 边加边搅拌约至总量为35万 毫升；用前加水稀释至100万 毫升, 温度约为80℃, 盛装在 一个缸内
并发挥免疫系统细胞间协同作用（巨噬细胞与T细胞, T细胞与B细胞）。
灭活剂保护剂和免疫佐剂
第18页
作用机理
① 抗原递呈（antigen presentation） ② 抗原寻（antigen targeting） ③ 免疫调整（immune modulation）
灭活剂保护剂和免疫佐剂
第19页
①抗原递呈: 指抗原分子递呈给T细胞方法。佐剂与疫苗联合使 用，有利于抗原性物质在胞内被加工，被MHC分子特异性结合、 保护、运输并递呈给效应细胞。
（2）用明矾加碳酸钠合成法
2 KAl(SO4)2+3 Na2CO3+3H2O→2Al(OH)3+3Na2SO4+3CO2↑
（3）用三氯化铝与氢氧化钠合成
A1C13+3NaOH→Al(OH)3↓+3NaCl
灭活剂保护剂和免疫佐剂
第26页
用铝粉加烧碱合成法:
2Al(OH)3+12H2O+3H2SO4→Al2(SO4)3·18H2O
灭活剂保护剂和免疫佐剂
第24页
（二）非颗粒性佐剂
1．肽类佐剂（peptides）：胞壁酰二肽（MDP）及其 衍生物、
去胞壁酰多肽、脂肽和免疫调整多肽。
2．表面活性分子类佐剂：海藻糖合成衍生物（TDM）

灭火剂、保护剂与免疫佐剂


（二）烷化剂
1）性状：化学性质活泼。烷化剂是含有烷基的 分子中去掉一个氢原子集团的化合物，能与另一 化合物作用，将烷基引入，形成烷基取代物。
2）作用机制：烷化DNA分子中的鸟嘌呤或腺嘌 呤等，引起单链断裂或双螺旋交联，改变DNA结 构，妨碍RNA合成，抑制细胞有丝分裂。也可与 酶系统和核蛋白起作用，干扰核酸代谢。
这类灭活剂能破坏病毒的核酸芯髓，丧失病毒感 染力，不损害蛋白衣壳，从而保留保护性抗原.
3）常用烷化剂：
乙酰基乙烯亚胺（AEI）：淡黄透明，轻微氨臭，能与 水、醇任意混合，AEI的功能基团是乙烯亚胺基，灭活 口蹄疫病毒培养液加入最终浓度为0.05%，30℃8h灭活， 2%硫代硫酸钠阻断灭活。
二乙烯亚胺（BEI）：市购商品为0.2%,0-4℃保存1个月 缩水甘油醛(GDA)：用于大肠杆菌、噬菌体、新城疫病 毒和口蹄疫病毒等。法国梅里厄研究所用本品生产牛和
3.病毒
常以下列物质的不同浓度或不同比例混合组成冻干保护剂: 明胶、血清、谷氨酸钠、羊水、蛋白胨、蔗糖、乳糖、山梨 醇、葡萄糖和PVP等
4.支原体
50%马血清、1%牛血清白蛋白、5%脱脂乳和7.5%葡萄糖加马 血清等。
5.立克次氏体
10%脱脂乳
6.酵母菌
马血清、含7.5%葡萄糖的马血清及1%谷氨酸钠的10%脱脂乳 等。
广义上讲：保护剂是保护微生物和寄生虫 等活力和免疫原及酶和激素等生物活性 的一类物质，还包括细菌或病毒的营养 液、赋形剂和抗氧化剂。
一些常用的冷冻干燥保护剂
分类 保 护 剂
复合物
糖 类 盐 类
脱脂乳、明胶、蛋白质、蛋白胨、糊精、血清、甲基纤维素等
蔗糖、乳糖、麦芽糖、葡萄糖、果糖等 乳酸钙、谷氨酸钠、氯化钠、氯化钾、醋酸铵、硫代硫酸钠等
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(四)温度
温度越高，灭活越快，灭活作用随温度上升而加速。在低温时，温 度每上升10C，细菌死亡率可成倍增加。每升高10C，金属盐类的灭菌 作用增加2-5倍，石炭酸的杀菌作用增加5-8倍。但是，如果温度超过 40C 或更高，对微生物的抗原性将有不利影响。
(五)pH
在微酸性时灭活速度慢，抗原性保持较好，在碱性时灭活速度快，但 抗原性易受破坏。灭活初期损失较快，以后逐渐减慢，尤其甲醛溶液浓度 高时，在碱性溶液中抗原性损失更大。
附：
用乙烯亚胺衍生物对病毒进行灭活，当灭活结束时，应中止灭活并 除去其残存物，以免继续作用而损害疫苗的免疫原性。采用的方法是： 在乙烯亚胺衍生物灭活的病毒液中加入过量的硫代硫酸钠或亚硫酸钠， 不论是0.05%AEI或0.02%BEI，病毒液中硫代硫酸钠最终浓度均为2%， 以中断灭活剂灭活作用。
此外，-丙内脂（-propiolactone）也是一种良好的病毒灭活剂， 它是一种不稳定的液体，于37C 2h后能自行水解为无毒物质。
注意：这里指的是甲醛的浓度，并非福尔马林的浓度！
(二) 苯酚
酚类是以羟基取代苯环上的氢而形成一类化合物。苯酚(phenolum)， 又称石炭酸(acidum carbolicum)，为具有特殊气味的无色结晶，易潮解， 溶于水及有机溶剂，见光则颜色变深，置于空气中易被氧化，颜色也变深， 所以应避光保存。
三、影响灭活作用的因素
(一) 灭活剂的特异性
某些灭活剂只对一部分微生物有明显的灭活作用，而对另一些微生物 则效力很差。如酚类能抑制和杀灭大部分细菌的繁殖体，5%石炭酸溶液 于数小时内能杀死细菌的芽胞。阳离子表面活性剂抗菌谱广，效力快，对 组织无刺激性，能杀死多种革兰氏阳性菌和阴性菌，但对绿脓杆菌和细菌 芽胞作用弱。
(六)微生物含氮量
一般微生物或毒素的总氮量和氨基氮含量对灭活有一定影响。一般 含氮量越高，甲醛等灭活剂的消耗量就越大、灭活脱毒越慢。
(七)有机物的存在
被灭活的疫苗中，如果含有血清或其他有机物质，会影响灭活剂的 灭活能力。因为环境中的这些蛋白质等有机物吸附于灭活剂的表面或者 和灭活剂的化学基团相结合。
3．保护剂配置方法 配置方法不同会影响保护剂的效果。例如含糖保护剂灭菌温度不宜
过高，以114C 30min灭菌或间歇灭菌为宜；血清保护剂就不能用热灭菌 法，必须以滤过法除菌。
4．保护剂pH 保护剂的pH应与微生物生存时的pH相同或相近，过高或过低都能导
致微生物的死亡。例如明胶蔗糖保护剂的pH以6.8~7.0为最佳，否则会造 成微生物大量死亡。又如含葡萄糖、乳糖保护剂经高压灭菌后能改变保护 剂的pH值，从而影响保护效果，为此最好采取滤过除菌。
或氨基结合保护其二级和三级结构。
2. 对活细胞（细菌） 降低细胞内外的渗透压，防止细胞膜破损水； 防止因细胞内水分结晶而对细胞膜或其他生物成份产生的应力，以
致改变膜或分子的立体结构； 若保护剂是细胞（细菌）的营养物质，可以在细胞复苏时迅速修复
细胞膜所受的损伤。
二、影响冻干保护剂效能的因素
每种生物制品一般都有其最佳冻干保护剂的组合，从而获得在冻干过 程中失活率最低、制品的保存期长。冻干保护剂的种类、组合、配制以 及组分的浓度对其效能的影响十分明显，影响保护剂效能的因素有下列 几方面。
酚类化合物的抗菌作用是通过损害细菌细胞膜，使胞浆漏出，并使菌 体溶解；可使菌体蛋白质凝固，抑制细菌特异酶系统(如脱氢酶和氧化酶) 活性。
苯酚在0.2%浓度时，即可抑制一般细菌的生长，而杀菌则需要1%以 上的浓度，如杀死葡萄球菌和链球菌需要3%的浓度作用1-3min，芽胞和 病毒对苯酚的耐受性很强。
(三) 结晶紫
(结晶紫甘油含2.5%结晶紫)
破伤风明矾沉降类毒素
0.4%甲醛
38C，21-31天
第二节 冻干保护剂
保护剂（protector）又称稳定剂（stabilizer）或分散剂。冻干保护剂 是指在冻干过程中及其后使制品的活性物质免受破坏的一类物质。
一、保护剂的组成与功用
生物制品冻干保护剂通常由以下三类物质组成：
3．抗氧化剂
抗氧化剂包括一些有机的和无机的物质，诸如抗坏血酸钠、硫脲、碘 化钾、钼酸铵等。抗氧化剂具有抑制冻干制品中的酶作用，从而保持微生 物等活性物质的稳定性。
保护剂的效用
1. 对生物活性物质 防止生物活性物质失去结构水； 防止结构水形成结晶，造成生物活性物质的分子破坏； 一些含羟基的有机保护剂能够替代部分结构水，与蛋白质中的羧基
总之，每种新的冻干制品在批量生产前应进行系统的最佳保护剂选择 试验，包括保护剂冻干前后的活菌数、病毒滴度和效价测定的比较试验； 不同保存条件和不同保存期的比较试验。
三、常用的冻干保护剂
各类微生物适用的保护剂很多，各国的配制方法各异。即使同一种制 品所使用的保护剂组成也不一样。
例如鸡新城疫弱毒疫苗，我国选用5%蔗糖脱脂乳为冻干保护剂，而日 本则用5%乳糖、0.15%聚乙烯吡咯烷酮、1%马血清；或0.4%蔗糖脱脂乳、 0.2%聚乙烯吡咯烷酮作保护剂。猪丹毒弱毒菌苗，我国以5%蔗糖、1.5% 明胶作冻干保护剂；而日本用5%脱脂乳、2.5%酵母浸膏为保护剂。
甲醛的使用浓度
甲醛用于病毒灭活其浓度可在0.05%~0.4%范围内，大部分使用浓 度为0.2%~0.3%。
一般需氧细菌用0.1%~0.2%的浓度。 厌氧菌则多用0.4%~0.5%杀菌或脱毒，处理时间37~39C 24h以上， 有的需要更长时间。 例 如 猪 肺 疫 灭 活 苗 ， 用 0.1% 的 甲 醛 溶 液 ， 在 37~38C 条 件 下 灭 活 7~12h；气肿疽灭活苗，用0.5%的甲醛液，37-38C灭活72~96h；破伤 风类毒素用0.4%甲醛液，在37~38C条件下灭活21~23天。
第四章
灭活剂、保护剂和免疫佐剂
内容提要 第一节 灭活与灭活剂
第二节 冻干保护剂
一、灭活的概念 二、常用的灭活剂 三、影响灭活作用的因素
一、保护剂的组成与功用 二、影响冻干保护剂效能的因素 三、常用的冻干保护剂
第三节 免疫佐剂
一、佐剂概述 二、不溶性盐类胶体佐剂 三、油乳佐剂
第一节 灭活与灭活剂
一、灭活的概念
1．不同微生物的保护剂
由于细苗、病毒、支原体、立克氏体、酵母菌等生物学特性不同，其 适用的冻干保护剂也不相同。各类微生物常用的保护剂如下：
病 原 性 细 菌 ： 冻 干 保 护 剂 有 10% 蔗 糖 、 5% 蔗 糖 脱 脂 乳 、 1.5% 明 胶 、 10~20%脱脂乳、含1%谷氨酸钠的10%脱脂乳、5%牛血清白蛋白的蔗糖、 灭活马血清等。 厌氧细菌：含0.1%谷氨酸钠10%乳糖、10%脱脂乳、7.5%葡萄糖血清等。
1．高分子物质 2．低分子物质
1．高分子物质
3．抗氧化剂
高分子物质范围很广，种类甚多。它们在冻干类生物制品中主要起
骨架作用，防止低分子物质的碳化和氧化；保护活性物质不受加热的影响；
使冻干制品形成多孔性、疏松的海绵状物，从而使溶解度增加。
诸如白蛋白、血清、明胶、脱脂乳、液体培养基、淀粉、酵母浸膏
以及聚乙烯吡咯烷酮等合成聚合物。
(二) 微生物种类及其特性
不同种类的微生物如细菌、病毒、真菌以及革兰氏阳性菌与革兰氏 阴性菌对各类灭活剂的敏感性是个完全相同的；细菌的繁殖体及其芽胞 对化学药物的抵抗力不同；生长期和静止期的细菌对灭活剂的敏感程度 亦有差别，另外细菌的浓度也会影响灭活的效果。
(三)灭活剂浓度
以甲醛力例，甲醛浓度越高，灭活脱毒越快，但抗原损失量亦较大。 有人证明，加0.5%甲醛溶液脱毒的类毒素，其结合力仅相当于0.2%甲醛 溶液脱毒类毒素结合力的2/3。也可以采用分次加入甲醛溶液进行灭活、 脱毒比较缓和的方法。
作用于蛋白质的氨基产生羟甲基胺； 作用于羧基形成亚甲基二醇单酯，作用于羟基生成羟甲基酚； 作用于巯基生成硫代亚甲 基二醇。 还可引起细菌蛋白中氨基与羟基发生分子内交联。 甲醛还可与RNA碱基中的游离氨基特异性结合； 甲醛与核糖体中的氨基结合，使两个亚单位间形成交联链。
所有这些交联使微生物结构有轻微改变，失去活性，但不明显影响其 免疫原性。
2．低分子物质
低分子物质包括糖类和氨基酸类，前者如葡萄糖、乳糖、蔗糖、棉子 糖等，后者如谷氨酸、天门冬氨酸、精氨酸、赖氨酸等。低分子物质可产 生均匀的混悬液，使微生物保持稳定的活存状态及对水分子起缓解作用， 并能使冻干生物制品仍含有一定量水分，还可促进高分子物质形成骨架， 使冻干制品呈多孔的海绵状，从而增加溶解度。
结晶紫是一种碱性染料，为甲基紫的纯品，化学名为六甲基副玫瑰 苯胺。
结晶紫的灭活机制主要是： 它的阳离子与微生物蛋白质带阴电的羧基形成弱电离化合物，妨碍 了微生物的正常代谢，扰乱微生物的氧化还原作用。 干扰胞壁粘肽的合成，主要是对革兰氏阳性菌。
(四) 烷化剂
烷化剂（alkylating agent）是含有烷基的分子去掉一个氢原子基团 的化合物，它能与另一种化合物作用，将烷基引入，形成烷基取代物。
0.05%甲醛
灭 活
兔出热组织灭活苗
0.4%甲醛
剂 鸡传染性法氏囊病组织灭活苗
0.4%甲醛
及 牛、羊伪狂大病疫苗
0.15%甲醛
16-18C，48h 37C，24h 37C，12-24h 37C，20-24h 4-10C，冷库内7天
灭 犬传染性肝炎灭活苗
0.5%甲醛
37C，24h
活 口蹄疫细胞培养灭活苗
这里所讲的灭活是指微生物的灭活，即破坏微生物的生物学活性，破 坏病原微生物的繁殖能力及致病性，并且尽可能不影响或少影响其免疫原 性，用以制备灭活疫苗。
灭活的方法包括物理学方法和化学方法，其中物理学方法有加热及射 线照射等方法。该法简单易行，但加热杀死微生物的方法比较粗率，容 易造成蛋白质变性，明显影响微生物的免疫原性，所以这种灭活方法已 基本淘汰。