实验六 微生物的简单染色及革兰氏染色

实验二：细菌的简单染色和革兰染色一、实验目的1.掌握细菌涂片的制备方法。

2.掌握细菌简单染色和革兰染色法的原理及操作步骤，识别细菌的革兰染色结果。

3.巩固显微镜油镜的使用方法。

4.学习无菌操作技术。

二、实验原理1、染色原理：细菌生长于酸性、中性和碱性溶液时常带负电荷，所以通常采用带正电荷的碱性染料（如美蓝、甲紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。

当细菌分解糖类产酸时，细菌所带正电荷增加易被带负电的酸性染料（如伊红、酸性复红或刚果红）着色。

2、革兰染色法原理：革兰染色法可根据细菌细胞壁结构和成分的不同，将其分为革兰阳性菌和革兰阴性菌。

革兰阳性细菌的肽聚糖层较厚，经乙醇处理后使之发生脱水作用而使孔径缩小，结晶紫与碘的复合物保留在细胞内而不被脱色；而革兰阴性细菌的肽聚糖层很薄，脂肪含量高，经乙醇处理后部份细胞壁可能被溶解并改变其组织状态，细胞壁孔径大，不能阻止溶剂透入，因而将结晶紫与碘的复合物洗去而被脱色。

另外，革兰染色的差异并不能完全认为是化学的差别，也有物理结构不同的结果。

如酵母菌细胞壁的成份完全与细菌不同，但具有革兰染色阳性反应。

三、实验仪器，材料和用具1、仪器及用具：显微镜、酒精灯、火柴、接种环、载玻片、盖玻片、镊子、擦镜纸、镜油、无菌牙签2、菌种：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、葡萄球菌、牙垢、未知菌S1和S33、试剂：结晶紫染液、革氏碘液、洗脱液（95%乙醇溶液）、番红染液四、实验步骤（1）简单染色1、载玻片的处理：用纱布将取出的载玻片擦干，把要涂菌的部位在火焰上烤一下，冷却待用。

2、涂片：左手持菌液试管，右手持接种环在火焰上烧灼灭菌，待接种环冷却后在火焰旁从试管中取一环菌液，在洁净无脂的载玻片上涂一直径约2mm的均匀薄膜。

3、干燥：涂片后待其自然干燥。

4、固定：将以干燥好的涂片标本朝上，在酒精灯火焰上通过2~3次，要求载玻片温度不能超过60度，以手背触载片不烫为宜。

5、染色：滴加一滴结晶紫染液，染色1min。

光学显微镜的使用简单染色及革兰氏染色摘要显微镜的使用在我们学习微生物等课程中非常重要，历史上显微镜的发明和显微镜的每一次创新都给人类的认知带来了飞跃式的发展；给人类的生活带来了空前的拓展。

在提倡科技创新的今天，显微镜的使用已经成为我们的一项基本技能。

本次试验的主要目的是通过用油镜观察经过复染色的细菌玻片，分辨细菌的革兰氏阴阳性。

通过实验学习光学显微镜油镜的使用原理与方法、细菌的革兰氏染色法及分类鉴定的原理。

为了研究细菌的形态，微生物学家发明了对细菌的染色，用两种以上的称复染，革兰氏发明了复染色法；先后用两种染色剂和媒染剂、脱色剂组合，由此而命名为革兰氏染色。

革兰氏染色不仅可以观察细菌的形态，同时将细菌分为两大类。

一类是染色阳性菌是紫色，另一类染色阴性的是红色。

由于细菌的结构上的差异，形成了不同的染色效果。

了解染色性能有助于临床用药和细菌的鉴定。

关键词显微镜的使用（Use of Microscope）革兰氏染色（Gram stain）复染（counterstain）媒染（mordant dyeing）脱色（discoloration）一、实验目的1、了解显微镜的构造及使用2、学习显微镜（特别是白色圈标记的油镜）的使用方法3、学习并掌握微生物制片及简单染色的基本技术4、初步了解不同细菌的形态特征5、了解革兰氏染色原理，并掌握其方法二、实验原理（一）、普通显微镜的基本原理1、基本原理显微镜的放大效能（分辨率）是由所用光波长短和物镜数值口径决定，缩短使用的光波波长或增加数值口径可以提高分辨率，可见光的光波幅度比较窄，紫外光波长短可以提高分辨率，但不能用肉眼直接观察。

所以利用减小光波长来提高光学显微镜分辨率是有限的，提高数值口径是提高分辨率的理想措施。

要增加数值口径，可以提高介质折射率，当空气为介质时折射率为1，而香柏油的折射率为1.51，和载片玻璃的折射率（1.52）相近，这样光线可以不发生折射而直接通过载片、香柏油进入物镜，从而提高分辨率。

细菌的简单染色和革兰氏染色实验报告实验三细菌的简单染色和革兰氏染色实验三细菌的简单染色和革兰氏染色一、目的与要求1、掌握细菌涂片标本的制备2、掌握革兰氏染色法的步骤和关键点3、识别细菌革兰氏染色结果二、实验原理：细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。

为什么要对细菌染色？细菌的细胞小而透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。

用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。

简单染色法可用以观察微生物的形状、大小及细胞排列状态，是微生物技术中应用广泛，操作简便的染色法。

革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G?)和革兰氏阴性菌(G-)两大类，是细菌学上最常用的鉴别性染色法。

其原理是利用细菌的细胞壁组成成分和结构的不同。

革兰氏阳性菌的细胞壁肽聚糖层厚，交联而成的肽聚糖网状结构致密，经乙醇处理发生脱水作用，使孔径缩小，通透性降低，结晶紫与碘形成的大分子复合物保留在细胞壁内使细胞呈蓝紫色，而革兰氏阴性菌肽聚糖层薄，网状结构交联少，且类脂含量较高，经乙醇处理后，类脂被溶解，细胞壁孔径变大，通透性增加，结晶紫与碘的复合物被溶出细胞壁，再经番红复染后细胞呈红色。

三、实验器材1、菌种牛肉膏琼脂斜面28℃培养24h的大肠杆菌(Escherichia coli)斜面菌种，牛肉膏琼脂斜面28℃培养16h的枯草杆菌(Bacillus subtilis)斜面菌种；2、仪器显微镜；3、材料载玻片，香柏油，二甲苯，擦镜纸，吸水纸，染色缸等。

4、染料草酸铵结晶紫染色液，路哥氏(Lugol)碘液，95%乙醇，0.5%番红染色液；细菌的简单染色步骤：细菌的革兰氏染色步骤：涂片,干燥,固定,结晶紫染色,水洗,碘液媒染,水洗,乙醇脱色,水洗,番红复染,水洗,干燥,镜检.五、实验关键步骤和注意点：1、玻片要洁净无油，否则菌液涂不开。

一、实验题目：微生物的革兰氏染色二、实验目的：1. 学习并初步掌握革兰氏染色法；2. 了解革兰氏染色的原理；3. 巩固显微镜的使用；4. 培养实验操作技能，提高观察和分析能力。

三、实验原理：革兰氏染色是细菌学中最重要的鉴别染色法，根据细菌细胞壁的结构差异，将细菌分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）。

革兰氏阳性菌细胞壁结构致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，乙醇不易渗入；革兰氏阴性菌细胞壁结构疏松，肽聚糖层薄，脂质含量多，乙醇易渗入。

在革兰氏染色过程中，G+菌被染成紫色且不被酒精脱色，而G-菌则被染成红色。

四、实验材料：1. 实验器材：已接种大肠杆菌的培养皿、接种环、酒精灯、玻璃铅笔、显微镜、香柏油、擦镜纸、二甲苯；2. 实验试剂：革兰染色液（结晶紫、卢戈碘液、95%乙醇、稀释复红染液）。

五、实验步骤：1. 涂片制备：取干净载玻片1块，用玻璃铅笔划分加样区域，做好标记，并在各分区分别用接种环取生理盐水2环，置于玻片上，接种环灭菌后，取细菌培养物少许与盐水混匀，并涂成均匀薄膜涂片。

如用液体材料，如痰、尿液、脓汁等可直接涂片，不必加生理盐水。

干燥：涂片最好在室温下自然干燥，必要时可将标本面向上，小心间断地在弱火高处烘干，但切勿紧靠火焰将涂膜烤枯。

固定：涂片干燥后，将标本片在酒精灯上快速的来回通过三次，共约2s～3s，注意温度不可太高，以涂片涂膜的反面触及皮肤觉轻微烫觉即可。

固定目的：杀死细菌；使菌体与玻片粘附较牢，在染色时不致被染液和水冲掉；菌体蛋白变性易着色。

2. 结晶紫初染：将涂片放入含有结晶紫的染液中，染色1分钟；3. 卢戈碘液媒染：将涂片取出，放入卢戈碘液中，媒染1分钟；4. 95%乙醇脱色：将涂片取出，放入95%乙醇中，脱色30秒～1分钟；5. 稀释复红染液复染：将涂片取出，放入稀释复红染液中，复染1分钟；6. 油镜观察：将涂片放入显微镜油镜下观察。

六、实验结果：1. 革兰氏阳性菌：细胞呈紫色，细胞壁较厚，边缘清晰；2. 革兰氏阴性菌：细胞呈红色，细胞壁较薄，边缘模糊。

实验二细菌的分离和革兰氏染色一、实验目的1．掌握细菌涂片标本的制备方法和普通染色的步骤；2．掌握革兰氏染色法的步骤和关键点；3．识别细菌的革兰氏染色结果；4．学习无菌操作技术。

二、实验原理一般认为革兰阳性细菌的肽聚糖层较厚，经乙醇处理后使之发生脱水作用而使孔径缩小，结晶紫与碘的复合物保留在细胞内而不被脱色；而革兰阴性细菌的肽聚糖层很薄，脂肪含量高，经乙醇处理后部份细胞壁可能被溶解并改变其组织状态，细胞壁孔径大，不能阻止溶剂透入，因而将结晶紫与碘的复合物洗去而被脱色。

虽然如此，革兰染色的差异并不能完全认为是化学的差别，也有物理结构不同的结果，因为酵母菌细胞壁的成份完全和细菌不同，但具有革兰染色阳性反应。

三、实验器材载玻片，盖玻片，接种环，酒精灯，显微镜、擦镜纸、镜油、擦镜液；结晶紫、革氏碘染液、95%酒精、番红染液；枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和未知菌的18小时的液体培养液，酵母菌平板，大肠杆菌平板，牙垢。

四、实验步骤1、涂片左手持菌液EP管，右手持接种环，在火上对接种环灭菌后，从EP管中取一环培养液，于载玻片中央涂成薄层（事先在背面做好标记圆圈），将接种环在火焰上烧灼灭菌。

若是从平板上取材，则事先在载玻片上滴一小滴水，在火焰附近把平板打开一小口，用接种环调取菌落边缘的物质涂于水滴上。

室温下自然干燥。

2、固定手持或镊子夹载玻片一端，标本面朝上，在灯的火焰外侧快速来回移动3~4次，共约3~4秒。

要求玻片温度不超过60℃，以玻片背面触及手背皮肤不觉过烫为宜，放置待冷后染色。

3、初染滴加1滴草酸铵结晶紫染液，染色1分钟，水洗，吸干。

4、媒染用碘液冲去残留水，再加1滴碘液覆盖涂片1分钟，水洗，吸干。

5、脱色用吸水纸吸去玻片上的残留水，滴加95%的乙醇脱色，轻轻摇动玻片，倒掉脱色液，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗，吸干。

脱色时间20~30秒。

6、复染滴加1滴蕃红染液复染1-3分钟以上，水洗。

7、显微镜观察吸干载玻片背面及标本周围水渍，先用4*10的倍数找到合适的视野，再油镜观察。

细菌的简单染色与革兰氏染色实验报告(共4篇)细菌的简单染色和革兰氏染色实验细菌的简单染色和革兰氏染色实验实验目的1. 学习微生物涂片，染色的基本技术，掌握细菌的单染色方法及无菌操作技术。

、2. 巩固显微镜的使用方法。

基本原理1. 简单染色法:用单一染料对细菌进行染色的方法。

此法操作简单，适用于一般形态的观察。

在中性，碱性或酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，所以用碱性染料进行染色。

碱性染料并不是碱，和其他染料一样是一种盐，电离时染料离子带正电，易于带负电荷的细菌结合而是细菌着色。

带正电的染料离子可使细菌细胞染成蓝色。

通常的碱性染料除了美蓝外，还有结晶紫，碱性复红，番红等。

细菌体积较小，较透明，如未经染色常不易识别，而经染色后与背景形成鲜明的对比，是易于在显微镜下观察。

2. 革兰氏染色法:将所有的细菌分成革兰氏阳性菌G+)和革兰氏阴性菌(G-)两大类，是细菌上最常用的鉴别染色法。

该染色法所以将细菌分为G+和G-菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同决定的。

G-菌的细胞壁中含有较多易被乙酸溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄，交联度低，故用乙醇脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使染色的结晶紫和碘的复合物易于渗透，结果细菌被脱色，在经复红染色后就成了红色。

G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时颜色。

革兰氏染色需要四种不同的溶液，碱性染料初染液，煤染剂，脱色剂和复染液。

碱性染料初染液的作用像在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫。

媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或付着力，即已某种方式帮助染料固定在细胞上，是不易脱落，碘是常用的媒染剂。

脱色剂是被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95%的酒精。

复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染剂，复染的目的是使被脱落的细胞染上不同于初染液的颜色，从而将细胞区分成G+和G-两大类群，常用的染色液是复红。

细菌的简单染色和革兰氏染色及其注意事项（一）目的：学习细菌的简单染色法和革兰氏染色法。

（二）原理：用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。

碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。

因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。

酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。

当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。

中性染料是前两者的结合物又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。

简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态，简单染色不能辨别细菌细胞的构造。

革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。

革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。

该染色法所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。

G—菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。

G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。

（三）器材1、活材料：培养12-16h的苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis）或者枯草杆菌（Bacillus subtilis），培养24小时的大肠杆菌（Escherichia coli）2、染色液和试剂：结晶紫（附二、（一）、3）、卢哥氏碘液（附二、（一）、4）、95%酒精、蕃红（附二、（一）、5）、复红（附二（一）、2）、二甲苯、香柏油3、器材：废液缸、洗瓶、载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、显微镜（四）方法：1、简单染色：（1）涂片：取干净载玻片一块，在载玻片的左、右各加一滴蒸馏水，按无菌操作法取菌涂片，左边涂苏云金杆菌，右边涂大肠杆菌，做成浓菌液。

实验六微生物的简单染色及革兰氏染色利用显微镜对微生物细胞形态、结构、大小和排列进行观察前，首先要将微生物样品置于载玻片上、染色，为观察到真实、完整的生物形态结构，根据不同微生物的特点采取不同的制片及染色方法。

微生物细胞个体微小且较透明，在光学显微镜下难以将其与背景区分开而看清。

所以，在利用光学显微镜对微生物进行观察前，需要利用染料对微生物进行染色，使着色细胞或结构与背景形成鲜明对比，以便更清晰地观察微生物细胞形态及结构特征。

微生物的另一个特点是种类繁多，不同微生物细胞结构各异，对各类细胞染料的结合能力不同，研究者必须根据所要观察的微生物特点及观察目标，选用适宜的染色技术。

（一）细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的制片和简单染色一、目的要求1.学习并掌握微生物制片及简单染色的基本技术。

2.初步了解细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的形态特征和相互区别。

3.巩固显微镜操作技术及无菌操作技术。

二、基本原理对个体较小的细菌进行制片时采取涂片法，通过涂抹细胞个体在载玻片上均匀分布，避免菌体堆积而无法观察个体形态，通过加热固定使细胞质凝固，使细胞固定在载玻片上，这种加热处理还可以杀死大多数细菌而且不破坏细胞形态。

利用单一染料对菌体进行染色的方法称为简单染色。

用于染色的染料是一类苯环上带有发色基团和助色基团的有机化合物。

发色基团赋予染料颜色特征，而助色基团使染料能够形成盐。

不含有助色基团而仅具有发色基团的苯化合物（色原）即使具有颜色也不能用作染料，因为它不能电离，不能与酸或碱性成盐，难以与微生物细胞结合使其着色。

常用的微生物细胞颜料都是盐，分碱性染料和酸性染料，前者包括美蓝（亚甲蓝）、结晶紫、碱性复红、沙黄（番红）及孔雀绿等，后者包括碱性复红、伊红及刚果红等。

通常采用碱性染料进行染色，原因在于微生物细胞在碱性、中性及弱酸性溶液中常带负电荷，而染料电力红染色部分带正电荷，很容与细胞结合使其着色；当细胞处于弱酸条件下（如细菌分解糖类产酸）所带正电荷增加时，可采用酸性染料染色。

实训五细菌的简单染色和革兰氏染色一、实验目的1. 掌握染色的原理和操作过程2. 掌握简单染色和革兰氏染色方法与规范操作3. 规范正确使用普通光学显微镜二、实验原理由于细菌菌体极小，折光率低，在显微镜下不容易看清，如将其染色，使菌体和背景之间反差增大，折光率增强，就容易看清，简单染色法只用一种染料着色。

革兰氏染色法是细菌染色中一种重要的鉴别染色法。

通过此法染色，可将细菌鉴别为革兰氏阳性菌和阴性菌两大类。

其过程是：草酸铵结晶紫初染→路哥氏氏碘液媒染→95%乙醇脱色→蕃红花红复染。

若细胞能保持结晶紫与碘所形成的复合物而不被乙醇脱色，则细菌呈紫色，称革兰氏阳性菌，若被乙醇脱色而被蕃红复染成红色，则称革兰氏阴性菌。

革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。

实际上，当用结晶紫初染后，象简单染色法一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。

碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫一碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。

当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。

革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、类脂质含量低，用乙醇（或丙酮）脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。

革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄，类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇（或丙酮）溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。

三、实验器材显微镜、载玻片、盖玻片、酒精灯、废液缸、洗瓶、吸水纸、接种环、镊子、草酸铵结晶紫色液、路哥氏碘液、95%乙醇、蕃红花红染色液、菌落培养物（培养18～24小时）、二甲苯、香柏油四、操作步骤（一）简单染色法1．涂片取洁净载玻片，在中央滴一滴生理盐水（或无菌水），用接种环以无菌操作挑取欲观察菌体，和水充分混匀，涂成极薄的菌膜。