实验二：细菌涂片的制备和染色镜检

细菌的简单染色和革兰氏染色实验报告实验三细菌的简单染色和革兰氏染色实验三细菌的简单染色和革兰氏染色一、目的与要求1、掌握细菌涂片标本的制备2、掌握革兰氏染色法的步骤和关键点3、识别细菌革兰氏染色结果二、实验原理：细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。

为什么要对细菌染色？细菌的细胞小而透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。

用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。

简单染色法可用以观察微生物的形状、大小及细胞排列状态，是微生物技术中应用广泛，操作简便的染色法。

革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G?)和革兰氏阴性菌(G-)两大类，是细菌学上最常用的鉴别性染色法。

其原理是利用细菌的细胞壁组成成分和结构的不同。

革兰氏阳性菌的细胞壁肽聚糖层厚，交联而成的肽聚糖网状结构致密，经乙醇处理发生脱水作用，使孔径缩小，通透性降低，结晶紫与碘形成的大分子复合物保留在细胞壁内使细胞呈蓝紫色，而革兰氏阴性菌肽聚糖层薄，网状结构交联少，且类脂含量较高，经乙醇处理后，类脂被溶解，细胞壁孔径变大，通透性增加，结晶紫与碘的复合物被溶出细胞壁，再经番红复染后细胞呈红色。

三、实验器材1、菌种牛肉膏琼脂斜面28℃培养24h的大肠杆菌(Escherichia coli)斜面菌种，牛肉膏琼脂斜面28℃培养16h的枯草杆菌(Bacillus subtilis)斜面菌种；2、仪器显微镜；3、材料载玻片，香柏油，二甲苯，擦镜纸，吸水纸，染色缸等。

4、染料草酸铵结晶紫染色液，路哥氏(Lugol)碘液，95%乙醇，0.5%番红染色液；细菌的简单染色步骤：细菌的革兰氏染色步骤：涂片,干燥,固定,结晶紫染色,水洗,碘液媒染,水洗,乙醇脱色,水洗,番红复染,水洗,干燥,镜检.五、实验关键步骤和注意点：1、玻片要洁净无油，否则菌液涂不开。

革兰染色实验报告革兰染色实验报告引言：革兰染色是一种常用的细菌分类和鉴定方法，由丹麦细菌学家克里斯汀·格拉姆于1884年发明。

该实验通过对细菌细胞壁的染色特性进行观察，将细菌分为革兰阳性和革兰阴性两类。

本实验旨在通过革兰染色方法，观察不同细菌的染色特性，从而更好地了解细菌的结构和分类。

材料与方法：1. 细菌培养物：本实验使用了两种细菌培养物，分别为革兰阳性细菌A和革兰阴性细菌B。

2. 玻璃片：用于制作细菌涂片。

3. 革兰染色试剂：包括革兰碘液、乙醇、脱色剂和碱性紫。

实验步骤：1. 准备细菌涂片：取少量革兰阳性细菌A和革兰阴性细菌B，分别在两片玻璃片上均匀涂抹。

2. 固定细菌涂片：将涂片在火焰中迅速加热，使细菌固定在玻璃片上。

3. 染色处理：将革兰碘液滴在细菌涂片上，静置1分钟后用纯净水冲洗。

然后滴加乙醇，使其脱色，再用纯净水冲洗。

最后滴加碱性紫染色剂，静置30秒后用纯净水冲洗。

4. 镜检观察：将涂片放在显微镜下，使用100倍和1000倍的放大倍数观察细菌的染色情况。

结果与讨论：观察了多个视野下的细菌涂片后，得出以下结果：1. 革兰阳性细菌A：在革兰染色后，细菌呈现紫色，细胞壁较厚，能够保留革兰染色的紫色染料。

细菌形状多为球形或椭圆形。

2. 革兰阴性细菌B：在革兰染色后，细菌呈现粉红色，细胞壁较薄，无法保留革兰染色的紫色染料。

细菌形状多样，有球形、杆状等。

通过对实验结果的观察和分析，可以得出以下结论：1. 革兰染色方法能够有效地将细菌分为革兰阳性和革兰阴性两类。

革兰阳性细菌具有较厚的细胞壁，能够保留革兰染色的紫色染料；而革兰阴性细菌则具有较薄的细胞壁，无法保留紫色染料。

2. 革兰染色方法对于细菌的形态和结构有一定的指示意义。

革兰阳性细菌多为球形或椭圆形，而革兰阴性细菌则形态多样，有球形、杆状等。

结论：革兰染色是一种简单而有效的细菌分类和鉴定方法。

通过该方法，可以快速了解细菌的染色特性、形态和结构，为进一步的细菌鉴定和分析提供基础数据。

实验二细菌的形态观察（简单染色法和革兰氏染色法）实验二细菌的形态观察（简单染色法和革兰氏染色法）一目的要求1．了解简单染色法和革兰氏染色法的基本原理，熟练掌握细菌的涂片与革兰氏染色技术。

2．初步学习细菌细胞特殊结构的染色方法，并观察细菌的特殊结构。

3．观察细菌的菌落平板，学会识别大肠杆菌、枯草杆菌和金黄色葡萄球菌的菌落特征，学会初步鉴别微生物的种类的方法。

二实验内容与原理1．简单染色法原理简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法，一般用于观察个体形态与细菌排列。

由于细菌在中性、碱性或弱酸性环境中带负电荷，所以通常采用一种碱性染料如美蓝、碱性复红、结晶紫对细菌进行染色。

美蓝是美蓝的盐酸盐，可解离为带正电荷的美蓝，很容易与细菌结合使菌体着色。

染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。

简单染色过程：涂片→固定→染色→水洗→干燥→镜检涂片→ 固定→ 干燥→ 水洗、吸干→镜检→染色 1mim2．革兰氏染色法原理革兰氏染色法是由丹麦医生 Hans Christian Gram于 1884 年创立。

它是细菌学中很重要的鉴别染色法，因为通过此法染色，可将细菌鉴别为革兰氏阳性菌（G + ）和革兰氏阴性菌（G －）两大类。

革兰氏染色过程：涂片→固定→结晶紫初染（1min）→碘液媒染（1min）→乙醇脱色（95% 酒精,30s）→番红复染（30 秒）→干燥→镜检阳性菌：紫色阴性菌：红色革兰氏染色要点：（1）初染：用结晶紫，染色 1 分钟，水洗。

（2）媒染：加碘液覆盖 1 分钟后水洗。

（3）脱色：连续滴加 95％乙醇，约 30 秒，直到滴下的乙醇无色为止，水洗。

（4）复染：加番红染色 1 分钟，水洗。

（5）干燥。

（6）镜检：先低倍镜，后油镜观察。

注意：涂片要薄而均匀，脱色程度要控制得当。

学生做大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，枯草杆菌的革兰氏染色。

观察细菌个体形态与排列，绘图。

3．芽孢染色原理细菌的芽孢壁比营养细胞壁厚，致密，透性差，着色和脱色都比营养细胞困难，故一般采用一种碱性染料并在微火上加热，或延长染色时间，使菌体和芽孢都染上颜色以后水洗或稀酸冲去菌体的染料，芽孢仍保留颜色，再用另一种对比鲜明的染料使菌体着色，如此可明显区分芽孢和营养体结构。

细菌的革兰氏染色实验操作步骤流程革兰氏染色是一种常用的细菌分类方法，通过染色技术可以将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。

这种染色方法简单快捷，对细菌的形态特征有着重要的观察作用。

本文将介绍细菌的革兰氏染色实验的详细操作步骤流程。

实验所需材料1.革兰氏染色试剂盒：–革兰碘液–革兰染色液–醇解液–洗涤液–脱水液2.细菌培养液3.玻璃载玻片4.导览盖玻片5.消毒棉球6.显微镜实验步骤1.预处理玻片和试管–用肥皂水洗净手并彻底冲洗干净。

–取一块干净的抹布或纸巾，将玻璃载玻片擦拭干净。

–取一块干净的纸巾蘸取少量醇解液擦拭玻璃载玻片表面，以去除可能存在的杂质。

–将试管清洗干净，用蒸馏水冲洗干净，并放置在烘箱中晾干。

2.制备细菌涂片–打开培养液管，将一滴细菌培养液滴在玻璃载玻片上，可略带颜色。

–将玻璃载玻片侧倾45度，用细胞棉棒轻轻均匀地将细菌培养液涂抹在玻璃载玻片上，尽量避免涂片过厚。

–将涂片晾干。

3.固定细菌涂片–将制备好的细菌涂片放入烘箱中，用50摄氏度温度固定5分钟。

–取出固定的细菌涂片，待冷却后准备进行染色处理。

4.革兰氏染色处理–取一滴革兰碘液，滴在细菌涂片上，静置1分钟。

–洗涤液冲洗：将细菌涂片放入洗涤液中，静置20秒，然后将涂片提起，用自来水轻轻冲洗10秒。

–脱水液处理：将细菌涂片放入脱水液中，静置20秒。

–将细菌涂片提起并用洗涤液清洗3次，每次间隔10秒。

–将细菌涂片放入洗涤液中，静置20秒。

–用细胞棉棒从上到下蘸取革兰染色液，均匀地在细菌涂片上涂抹。

–将细菌涂片放入革兰染色液中，静置1分钟。

–将细菌涂片提起并用洗涤液轻轻冲洗10秒。

–将细菌涂片放入醇解液中，静置1分钟。

–将细菌涂片提起并用洗涤液轻轻冲洗10秒。

5.干燥和观察–用吹风机或自然风将细菌涂片吹干。

–涂片完全干燥后，将其放置在显微镜载片夹上。

–用显微镜在低倍镜下观察涂片，然后转换到高倍镜下观察。

观察细菌在镜片上的染色结果和细菌形态。

技能训练2 细菌标本片的制备和染色法一、目的要求：正确掌握细菌培养物涂片的制作和常用染色法二、设备材料病料、细菌培养物、接种环、玻片、酒精灯、染色缸、染色架、染色液等。

三、操作方法细菌标本片制作的基本步骤为：涂片或触片→干燥→固定→染色→镜检。

(一)细菌涂片的制备1．液体培养物及液体病料(1)涂片用接种环取一滴培养液或液体病料，于玻片的中央均匀地涂布成适当大小的薄层。

(2)干燥一般采用自然干燥，天气较冷时也可于酒精灯火焰上方30～40cm处适当加热干燥。

(3)固定分为火焰固定和化学固定两种。

火焰固定时，将干燥好的玻片涂面朝上，以其背面在酒精灯火焰上来回通过数次，略作加热，以不烫手背为度；化学固定时，可将干燥好的玻片浸入甲醇中2～3min后取出晾干，或在涂片上滴加数滴甲醇使其作用2～3min后自然挥发干燥。

此外，丙酮和酒精也可用作化学固定剂；作瑞特氏染色的涂片不需固定，因染色液中含有甲醇，有固定作用。

(4)染色根据不同的材料和菌种选择不同的染色法。

2．固体培养物用接种环取一滴生理盐水于玻片的中央→用接种环挑取一个菌落于生理盐水中混合→均匀地涂布成适当大小的薄层→干燥→固定→染色。

(二)细菌触片的制备将固体病料(病变组织)作无菌切开→用切面在玻片的中央接触一下或稍用力印压成一薄层→干燥→固定→染色。

(三)细菌的染色法1．单染色法又称简单染色法，即只应用一种染料进行染色的方法。

(1)美蓝染色法在已干燥、固定好的涂片或触片上滴加适量的美蓝染色液1—2min后，水洗，干燥(吸水纸吸干或自然干燥)，镜检。

(2)瑞特氏染色法在已干燥、固定好的涂片或触片上滴加瑞特氏染色液，为避免干燥，可适当多加一些，或视情况补充滴加，1—3min后再加与染液等量的中性蒸馏水或缓冲液，轻轻晃动玻片，使之与染色液混合均匀，再经3—5min后，直接用水冲洗，吸干或烘干后镜检。

也可在玻片上的涂抹处盖一适当大小的滤纸，然后再在滤纸上轻轻滴加瑞特氏染色液，至略浸过滤纸，视情况补充滴加，维持不干，3—5min后直接用水冲洗，吸干或烘干后镜检。

实验二细菌抹片的制备及染色一、提前十分钟进入实验室，抄写板述。

上课，点名入座。

板述内容：一）、目的要求1、掌握细菌抹片的制备方法2、掌握细菌的革兰氏染色法二）、实验内容1、每人做一张葡萄球菌的固体抹片，用美兰染色。

2、每人做一张大肠杆菌与葡萄球菌的混合抹片，并用革兰氏法染色。

3、油镜观察自制的玻片及真菌标本片，（烟曲霉、黄曲霉、酵母菌）4、组织抹片，并用瑞氏染色液染色（示教）三）作业1、叙述细菌抹片的制备方法2、叙述革兰氏染色的方法3、绘出细菌形态图并注明染色方法二、总结上次实验作业，有两个突出问题。

1、多数同学画的是书上的细菌图，细胞臂、荚膜清晰可见，而镜检时只能看到细菌的大致形态，如大肠杆菌是一个两端钝圆的杆状轮廓，另外，镜检时菌毛和鞭毛是不能观察到的，除非用特殊的染色方法。

2、有的同学没有用圆规画图，图片绘制得过大或过小。

三、实验第一部分：抹片的制备1、实验的目的和意义细菌细胞微小，无色而半透明，原样直接在普通光学显微镜下观察，只能大致见到其外貌，制成抹片和染色之后，则能较清楚地显示其形态和特殊构造，也可以根据不同的染色反应，作为鉴别细菌的一种依据。

2、细菌抹片的制备进行细菌染色之前，须先作好细菌抹片，其方法如下：（1）玻片准备载玻片应清晰透明、洁净而无油渍，滴上水后，能均匀展开，附着性好。

如有油渍，可按下列方法处理：A、滴上95%酒精2-3滴，用洁净纱布揩擦，然后在酒精灯火焰上轻轻拖过几次。

B、若上法仍未能去除油渍，可再滴上1-2滴冰醋酸，用纱布擦净，再在酒精灯火焰上轻轻通过。

（2）抹片所用材料情况不同，抹片方法亦有差异。

A、液体材料（如液体培养物、血液、渗出液、乳汁等）可直接用灭菌接种环取一环材料，于玻片的中央均匀地涂布成适当大小的薄层。

B、非液体材料（如菌落、脓、粪便等）则应先用灭菌接种环取少量生理盐水或蒸馏水，置于玻片中央，然后再用灭菌接种环取少量材料，在液滴中混合，均匀涂布成适当大小的薄层。