实验4 细菌革兰氏染色法讲解学习

实验四细菌的革兰氏染色与芽孢染色一、目的要求1.学习并初步掌握细菌的革兰氏染色法。

2.了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。

二、实验材料1.菌种：金黄色葡萄球菌（StapHylococcus aureus）大肠杆菌（E.coli）2.试剂：草酸铵结晶紫、路哥氏碘液、95%乙醇、番红液3.其他：显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、无菌水、香柏油、二甲苯等。

三、实验原理革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。

是1884年由丹麦病理学家Christain Gram创立的。

通过革兰氏染色可把细菌区分为两大类。

革兰氏染色的基本步骤：先用结晶紫初染、次经碘液媒染、再用95%乙醇脱色、最后用蕃红复染。

经过此法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞染上复染的红色的细菌为革兰氏阴性菌。

大肠杆菌是标准的革兰氏阴性菌，金黄色葡萄球菌是标准的革兰氏阳性菌。

革兰氏染色的机理，与细菌细胞壁的化学组成和结构有关。

经结晶紫初染以后，所有的细菌都被染成蓝紫色。

碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合形成复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。

当用乙醇脱色时，两类细菌的脱色效果是不同的，革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、类脂含量低，用乙醇脱色处理时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖层在内层且较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂被乙醇溶解、细胞壁透性增加，使结晶紫-碘的复合物被洗脱出来。

用蕃红复染时染上红色。

四、操作步骤1.细菌的活化：将细菌接种营养琼脂斜面，培养约24h。

2.制片：取菌种培养物常规涂片、干燥、固定。

3.初染：于制片上滴加结晶紫染液，染色1min后，用水洗去剩余染料。

4.媒染：用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，水洗。

5.脱色：用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，直接用95%乙醇从载玻片上端冲洗脱色，直到流下的酒精无明显的紫色时，立即水洗。

实验四细菌的革兰氏染色形态观察，平板及斜面菌落观察一、目的要求学习并初步掌握细菌的革兰氏染色方法；巩固革兰氏染色的原理及G-及G+细菌细胞壁结构的特点；了解革兰氏染色在细菌分类鉴定上的重要性；掌握细菌菌落与菌苔的主要特征。

二、实验原理革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C．Gram所创立的。

革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G+)和革兰氏阴性菌(G-)两大类，是细菌学上最常用的鉴别性染色法。

革兰氏染色法的主要步骤是先用结晶紫初染；再加媒染剂--碘液，以增加染料与细胞间的亲和力，使结晶紫和碘在细胞膜上形成分子量较大的复合物；然后用脱色剂(乙醇或丙酮)脱色；最后用蕃红复染。

凡细菌不被脱色而保留初染剂的颜色(紫色)者为革兰氏阳性菌，如被脱色后又染上复染剂的颜色(红色)者为革兰氏阴性菌。

该染色法所以能将细菌分为G+菌和G-菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。

G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。

G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。

三、实验器材1、菌种牛肉膏琼脂斜面28℃培养24h的大肠杆菌(Escherichia coli)斜面菌种，牛肉膏琼脂斜面28℃培养16h的枯草杆菌(Bacillus subtilis)斜面菌种；2、仪器显微镜；3、材料载玻片，香柏油，二甲苯，擦镜纸，吸水纸，染色缸等。

4、染料草酸铵结晶紫染色液，路哥氏(Lugol)碘液，95%乙醇，0.5%番红染色液。

四、操作步骤1、涂片在一张载玻片上加两滴蒸馏水后，分别涂布枯草芽孢杆菌和大肠杆菌(注意涂片切不可过于浓厚)。

2、固定将制成的涂片干燥固定，固定时通过火焰1-2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。

实验四革兰氏染色法实验教学课题：实验四革兰氏染色法实验教学目的：1学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的革兰氏染色。

2了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。

实验教学重点：细菌革兰氏染色原理和步骤。

实验教学难点：酒精洗脱时间。

实验用品：1大肠杆菌24h的斜面培养物。

2 乳酸菌24h的斜面培养物。

3 简单染色液（美蓝染色液、黑色素液或炭素墨水）4 革兰氏染色液（结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、石碳酸复红）5 载玻片、盖玻片、接种环、镊子、酒精灯、火柴、玻璃铅笔、蒸馏水等。

6 显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸等。

实验教学方法与手段：板书讲解+演示实验＋学生动手实验教学课时：4课时教学过程：一、实验原理1 简单染色的原理大多数微生物细胞质是带负电荷，简单染色时采用已知的、带正电荷的碱性染料。

染料适用于热固定的涂片，染料与菌体细胞质黏附使菌体着色。

经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明对比。

2 革兰氏染色的原理革兰氏阳性菌的细胞壁主要有肽聚糖形成的网状结构组成，在染色过程中，当用95%乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，细胞壁的通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞壁内而不易脱色，因此呈蓝紫色。

革兰氏阴性菌的细胞壁中肽聚糖含量低，脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物容易被乙醇抽提出来而脱色，然后又被染上了复染剂的颜色，因此呈现红色。

二、实验方法和步骤1、简单染色(1) 涂片:取两块干净的载玻片，各滴一小滴生理盐水于载玻片中央，用无菌操作分别挑取金黄色葡萄球菌和大肠杆菌于二载玻片的水滴中（每一种菌制一片），调匀并涂成薄膜。

注意滴生理盐水时不宜过多，涂片必须均匀。

(2) 干燥：自然气干或酒精灯高处微微加热。

(3) 固定:于火焰上通过2—3次。

(4) 染色：在整个涂面上滴加齐氏石炭酸复红，染色１分钟。

（5）水洗：倾去染液，用自来水细流冲洗至流下的水中无染料颜色为止。

细菌的简单染色和革兰氏染色及其注意事项（一）目的：学习细菌的简单染色法和革兰氏染色法。

（二）原理：用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。

碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。

因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。

酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。

当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。

中性染料是前两者的结合物又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。

简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态，简单染色不能辨别细菌细胞的构造。

革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。

革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。

该染色法所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。

G—菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。

G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。

（三）器材1、活材料：培养12-16h的苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis）或者枯草杆菌（Bacillus subtilis），培养24小时的大肠杆菌（Escherichia coli）2、染色液和试剂：结晶紫（附二、（一）、3）、卢哥氏碘液（附二、（一）、4）、95%酒精、蕃红（附二、（一）、5）、复红（附二（一）、2）、二甲苯、香柏油3、器材：废液缸、洗瓶、载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、显微镜（四）方法：1、简单染色：（1）涂片：取干净载玻片一块，在载玻片的左、右各加一滴蒸馏水，按无菌操作法取菌涂片，左边涂苏云金杆菌，右边涂大肠杆菌，做成浓菌液。

实验四、革兰氏染色法研究报告革兰氏染色法是一种常用的细菌分类和鉴定方法。

本实验目的是通过革兰氏染色法观察不同细菌的染色特点，以及细菌的形态结构。

实验材料和方法：1. 细菌培养基：脑心提取物琼脂（Nutrient Agar）。

2. 细菌：选择不同类型的细菌，如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等。

3. 革兰染色试剂：碘酒、靛洋红、碱性甲基蓝。

实验步骤：1. 在脑心提取物琼脂培养基上分别划线培养大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。

2. 制备菌液：取一根无菌草铺，沾于脑心提取物琼脂培养基上的菌落，均匀涂抹于玻璃片上。

3. 将制备好的菌片放于温箱中培养24小时，使细菌生长繁殖。

4. 将细菌片用火焰炙烤，以杀死细菌。

5. 在细菌片上滴加碘酒，静置1分钟。

6. 用水冲洗细菌片，使碘酒冲洗掉。

7. 在细菌片上滴加靛洋红，静置2分钟。

8. 用水冲洗细菌片，使靛洋红冲洗掉。

9. 在细菌片上滴加碱性甲基蓝，静置1分钟。

10. 用水冲洗细菌片，使碱性甲基蓝冲洗掉。

11. 用纸巾将细菌片上的水分吸干，使之变干。

12. 在显微镜下观察细菌片上的染色效果和细菌形态结构，并进行记录和分析。

实验结果：通过革兰氏染色法，观察到大肠杆菌呈现粉红色的染色效果，这说明大肠杆菌属于革兰氏阴性菌。

而金黄色葡萄球菌呈现紫色的染色效果，说明金黄色葡萄球菌属于革兰氏阳性菌。

结论：革兰氏染色法能够根据细菌细胞壁的染色特性，将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。

本实验的结果和观察显示，大肠杆菌为革兰氏阴性菌，而金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性菌。

这一结果对于细菌的分类和鉴定具有重要意义。

细菌的革兰氏染色一、目的与要求：1 了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性.2 学习掌握革兰氏染色技术，巩固学习光学显微镜油镜的使用方法。

二、原理：革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家Christain Gram氏创立的，革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类。

革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。

革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染剂结晶紫进行初染，再用碘液媒染，然后用乙醇(或丙酮)脱色，最后用复染剂(如番红)复染。

经此方法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染剂的颜色(红色)，该菌属于革兰氏阴性菌。

革兰氏染色法所以能将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。

实际上，当用结晶紫初染后，像简单染色法一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。

碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫一碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。

当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。

革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇(或丙酮)脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。

革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇(或丙酮)溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。

三实验器材1 菌种：大肠杆菌。

2 染色液和试剂：生理盐水、草酸铵结晶紫染液、碘液、95%乙醇、番红复染液, 香柏油，显微镜擦拭液（二甲苯）.３器材：酒精灯、接种环、镊子、载玻片、擦镜纸、吸水纸、记号笔、试管夹、显微镜等。

四实验方法1 涂片:•取一块干净的载玻片，平放，在载玻片中央滴一小滴生理盐水（或蒸馏水）；•用接种环无菌操作从琼脂培养基上挑取适量菌苔（1－2环）；•将挑取的菌苔沾入载玻片中央生理盐水中混匀并涂成薄膜。

实验四、革兰氏染色革兰氏染色是一种常用于细菌分类和鉴定的染色方法。

该方法分为革兰氏阳性染色和革兰氏阴性染色两种。

革兰氏染色的原理是根据细菌细胞壁的结构差异来进行染色。

革兰氏阳性菌细胞壁主要由厚的层状胞壁和内层的细胞质膜构成，可以被革兰氏染色液染成紫色。

而革兰氏阴性菌细胞壁由较薄的胞壁和外层的膜双层构成，不能被革兰氏染色液染色，需加上其他染色剂才可以被显色。

革兰氏染色方法的操作步骤如下：1.准备好需要染色的细菌培养物，一般建议使用18-24小时老化充分的培养物。

2.将菌液滴于玻片上，覆盖薄片后在空气中晾干。

3.用火将玻片送入火焰中进行加温灭菌，使菌落固定于玻片上。

注意火力不要太大，以免将菌落烧焦。

4.将玻片放入革兰氏染色液中，静置1分钟。

5.用蒸馏水冲洗玻片，使多余的染色液流失。

6.加上碘液，静置1分钟。

8.将玻片放入96%乙醇或酒精醋酸液中，静置数秒钟至10秒钟。

10.将玻片放入甲苯中干燥。

11.观察染色结果，革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。

革兰氏染色适用于大多数细菌的分类和鉴定。

通过观察菌落的形态、大小、色泽、透明度、光泽等特征，再结合革兰氏染色的结果，可以对细菌进行初步鉴定。

革兰氏染色还可以用于临床检测，如分离出的尿液、呕吐物、血液等可通过革兰氏染色结果初步判断细菌是否存在。

革兰氏染色对于细菌形态学和生理学的研究具有重要意义，但也有一些缺点。

例如，一些细菌在革兰氏染色中难以区分其是否为革兰氏阴性菌，此时需要结合其他的鉴定方法进行辅助鉴定。

此外，革兰氏染色只能在细菌培养物中进行，无法对非细菌生物或生长周期长的菌种进行染色。

此时需要采用其他的染色方法或者细胞学技术。

总之，革兰氏染色是一种方便、简单、易于操作的染色方法，是细菌形态学研究和临床检测的常用方法之一。