蛋白酶活性的测定方法

蛋白酶活性采用茚三酮比色法测定1、试剂配制①1%的酪素溶液：用 pH7.4 的 0.2M 磷酸盐缓冲溶液配制。

PH为7.4的0.2M磷酸盐缓冲溶液：0.2M 磷酸氢二钠（27.8g NaHPO4·2H2O溶于 1L 蒸馏水中）19ml 加 0.2M 磷酸二氢钾（53.65g KH2PO4溶于 1L 蒸馏水中）81ml 即成。

②0.1N 硫酸。

③20%硫酸钠。

④2%茚三酮液：2g 茚三酮溶于 100ml 丙酮。

⑤甲苯。

⑥甘氨酸标准溶液：取 0.1g 甘氨酸溶液水中，定容 1L，则得 1ml 含 0.02mg 氨基氮的标准液。

再稀释 10 倍做成标准液。

标准曲线的绘制：分别吸取工作液 1,3,5,7,9,13ml 移于50ml 容量瓶中，加 1ml 的茚三酮，冲洗瓶颈后在沸水浴上加热10min，将获得的着色溶液用蒸馏水稀释至刻度。

在风光光度计上于 500nm 处比色测定颜色深度。

以光密度为纵坐标，以氨基氮浓度为横坐标，绘制曲线。

2、操作步骤称 4g 风干土，置于 50ml 三角瓶中，加 20ml1%酪素溶液和 1ml 甲苯，小心振荡后用木塞盖紧，在30℃恒温箱中培养 24h。

培养结束后，于混合物中加 2ml0.1N 硫酸和 12ml 20% 硫酸钠液，以沉淀蛋白质，然后离心 15min(6000 转/min)。

取上清液2ml，置于 50ml 容量瓶中，按绘制标准曲线显色的方法进行比色测定。

为了消除土壤中原来含有的氨基氮引起的误差，每一土样需做无基质对照，整个实验需做无土对照。

无土对照：不加土样，其他操作与样品实验相同。

无基质对照：以等体积的水代替基质，其他操作与样品实验相同。

蛋白酶活性，以 24 小时后1g 土壤中氨基氮的毫克数表示。

3、结果计算NH2-N(mg)=a×5式中 a——从标准曲线查的氨基氮毫克数5——换算成 1g 土的系数。

蛋白酶活性的测定方法
蛋白酶活性的测定方法有多种，常见的方法包括：
1. 比色法：基于酶催化底物的产物与染色剂之间发生化学反应的原理。

测定过程中，酶水解底物产生的产物与染色剂发生反应形成有色产物，通过测定产物的吸光度来估计酶活性的强弱。

2. 荧光法：利用荧光底物的酶催化产物发出的荧光信号来测定酶活性。

荧光强度与酶催化产物的浓度成正比，通过测定荧光强度来分析酶活性。

3. 放射性标记法：将底物标记上放射性同位素，使其具有放射性。

通过测定底物放射性崩解的程度来估计酶活性的大小。

4. 免疫学方法：利用特异性抗体与酶结合形成抗原-抗体-酶复合物，测定抗原-抗体-酶复合物的活性来检测酶活性的强弱。

5. 吸收光谱法：利用特定的酶底物，通过测量其吸收光谱的变化来分析酶活性的强弱。

需要根据具体实验目的和条件选择适合的测定方法。

蛋白酶酶活测定方法一、实验原理：一定条件下不仅能够水解蛋白质中的肽键，也能够水解酰胺键和酯键，因此可用蛋白质或人工合成的酰胺及脂类化合物作为底物来测定蛋白酶的活力。

本实验选用酪蛋白为底物，测定微生物蛋白酶水解肽键的活力。

酪蛋白经蛋白酶作用后，降解成相对分子质量较小的肽和氨基酸，在反应混合物中加入三氯醋酸溶液，相对分子质量较大的蛋白质和肽沉淀下来，相对分子质量较小的肽和氨基酸仍留在溶液中，溶解于三氯醋酸（TCA）溶液的肽的数量与酶的数量和反应时间成正比。

在280nm波长下测定溶液吸光度的增加，计算酶的活力。

一分钟内1mg牛血清蛋白（BSA）相当的非蛋白性Lowry试液显色物质的增量值定义为一个蛋白酶活性单位（IU）。

二、试剂配制：A溶液：含2%KCl，1%TrltonX-100的50mM磷酸盐缓冲溶液（pH 6.0）试样TG酶溶液：直接取发酵样12000rpm离心5min，取上清测定。

底物溶液：精确称取底物二甲基酪蛋白0.250g，加入50mM PB缓冲溶液（pH 6.0）10mL，常温搅拌30min使其溶解后备用。

三、操作步骤：1. 试样1）将底物溶液放入37℃恒温水浴中预热备用2）试管中加入试样TG酶溶液0.2mL后放入恒温水浴中，10min后加入已预热的底物溶液1mL，立即振荡混合，于37℃反应60min3）反应结束后，加入12% TCA溶液1mL，再于37℃反应30min，使反应终止4）20℃,3000rpm，20min离心后取上清备用。

2.空白1）试管中加入已预热底物溶液1mL，再加入12% TCA溶液1mL，振荡混合后，于37℃反应60min2）加入试样TG酶溶液0.2mL，振荡混合后，于37℃反应30min3）20℃,3000rpm，20min离心后取上清备用。

四、Lowry法显色反应试管中分别加入试样清液和空白清液各0.2mL，加入A溶液1mL，振荡混合后室温下放置10min，然后加入试剂B 0.1mL，振荡混合后，于37℃反，空白的吸应30min。

1 蛋白酶活力的测定1.1 原理采用福林-酚试剂法。

福林-酚试剂在碱性条件下可被酚类化合物还原呈蓝色(钼蓝和钨蓝混合物)，由于蛋白质分子中有含酚基的氨基酸(如酪氨酸、色氨酸等)，可使蛋白质及其水解产物呈上述反应。

因此可利用此原理测定蛋白酶活力。

通常以酪蛋白为底物，在一定pH值和温度条件下，同酶液反应，经一段时间后终止酶促反应，经离心或过滤除去酪蛋白筹沉淀物后取上清液，用Na2CO3碱化，再加入福林-酚试剂显色，蓝色的深浅与滤液中生成产物酪氨酸量成正比;酪氨酸含量用分光光度计在660nm波长处测定，从而计算出蛋白酶的活力。

1.2 试剂1.2.l 福林-酚试剂向2000mL的磨口回流瓶中加入100g钨酸钠(Na2WO4?2H2O)、25g钼酸钠及700mL的去离子水，再加入50mL85%的磷酸及浓盐酸l00mL，充分混合后，接上回流冷凝管，以文火回流10h，结束后再加入150g的硫酸锂(LiSO4)、50mL去离子水及数滴溴水，再继续沸腾15min，以驱除过量的溴，冷却后滤液呈黄绿色(如仍呈绿色，需再重复滴加溴水的步骤)，加去离子水定容至1000mL乱，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中，贮于冰箱中可长期保存备用。

此溶液使用时可按1:3比例用去离子水稀释。

1.2.2 0.4mol/L三氯乙酸(TCA)溶液精确称取TCA65.4g，加去离子水定容至1000mL。

1.2.3 0.4mo1/L碳酸钠溶液精确称取无水碳酸钠42.4g，加去离于水溶解后，定容至1000mL。

1.2.4 pH值3～6醋酸缓冲液精确取NaAc?3H2O16g与268mL浓度为6mol/L醋酸溶液混合，用去离子水稀释定容至1000mL。

1.2.5 2%酪蛋白底物缓冲液1.2.5.1 测试酸性蛋白酶缓冲液精确称取酪蛋白20g，加入0.1mol/L氢氧化钠20mL(用去离子水配制)，在水浴中加热溶解，然后用pH值3.6醋酸缓冲液定容至1000mL。

实验四碱性蛋白酶活力的测定一、实验原理以酪蛋白为底物测定碱性蛋白酶的活力。

酪蛋白经蛋白酶作用后，会降解成相对分子质量较小的肽和氨基酸，在反应混合物中加入三氯醋酸溶液，相对分子质量较大的蛋白质和肽就沉淀下来，相对分子质量较小的肽和氨基酸仍留在溶液中。

溶解于三氯醋酸溶液中的肽的数量正比于酶的数量和反应时间。

因而采用Folin法测定上清液中肽的含量就可以计算酶的活力。

二、试剂和仪器试剂：0.1mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（pH10）、5%三氯醋酸、1%酪蛋白溶液（称取5g酪蛋白置于500mL 0.1mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（pH10）中，加热使其溶解）、0.4mol/L碳酸钠溶液、100μg/mL酪氨酸溶液、Folin试剂，稀释3倍使用仪器：水浴锅、721分光光度计（含比色皿）、秒表、常规玻璃仪器三、实验步骤1、酶液的萃取称取1g粗酶制剂置于研钵中，加少量缓冲液一起研磨，然后定容至100mL，从容量瓶中取出5mL酶液（视酶活而定）再定容至100mL，稀释后的酶液经滤纸过滤后得到澄清的酶液。

2、酶活力的测定样品管：取不同量的酶液（0.1~1.0mL：0.2mL、0.4mL、0.6mL），用0.1mol/L 碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（pH10）（对应为0.8mL、0.6mL、0.4mL）补足体积到1.0mL，然后在每个样品管中再加入1mL预先在40℃保温的1%酪蛋白溶液，混匀，在40℃准确保温10min，加入2mL 5%三氯醋酸溶液，迅速摇匀，于室温静置半小时。

空白管：先在每支试管中各加入1.0mL 1%酪蛋白溶液和2.0mL 5%三氯醋酸溶液，摇匀后，再加入1.0mL的酶液，酶液浓度分别与对应的样品管相同，在40℃下准确保温10min，以下操作同样品管。

将酶反应混合物过滤后收集滤液，在1mL滤液中加5mL 0.4mol/L碳酸钠溶液和1mL Folin试剂，摇匀后在40℃恒温水浴中显色20 min，以相应的空白管中的反应液为对照，在680nm下测定样品管中反应液的吸光度。

蛋白酶活性采用茚三酮比色法测定
称取29过lm二筛的风干土样置于IOOml三角瓶中。

往三角瓶中加入0.5ml甲苯，摇匀后放置15分钟。

再加入10ml用pH7.4磷酸缓冲液配制的白明胶溶液，将瓶塞紧，小心摇荡。

将三角瓶置于30℃恒温箱中，培养24h。

培养结束后，将瓶中悬液用致密滤纸过滤至另一三角瓶中。

吸取sml滤液于一试管中，加 0.5ml0.IN硫酸和 3ml20%硫酸钠以沉淀蛋白质，然后再过滤到另一试管中。

于上述试管中加入lm120/0荀三酮溶液，将混合物仔细摇荡，并在煮沸的水浴上
加热 10min。

将着色液转移到50ml容量瓶中，并用蒸馏水稀释至刻度。

用光电比色计于56Onm处进行比色测定。

实验设无土对照和无基质对照。

蛋白酶活性以24h后19土壤中酶促反应后生成的甘氨酸毫克数表示。

中性磷酸酶活性采用磷酸苯二钠比色法测定
取10.00g新鲜土壤(<lmm)于 100ml容量瓶中，加入1.5ml甲苯，室温下静置15min，然后加 10ml磷酸苯二钠溶液和ZOml柠檬酸缓冲溶液，盖上瓶塞，充分混匀后，37’C下培养3h，用38.C去离子水定容至IOOml，摇匀后迅速过滤。

同时做空白对照，用10ml去离子水代替磷酸苯二钠溶液。

三次重复。

取上述滤液卜4ml于 50ml容量瓶中，加 2.5ml缓冲液，混匀后用去离子水稀释至大约4Oml，再加0.5m12，6一二滇2424酮氯亚按溶液，室温下20一3Omin，定容至50ml，在 600nm处比色测定。

结果以24h后19土壤中释放出的酚的mg数表示。

蛋白酶体的检测方法
蛋白酶体是细胞内的重要器官，它在细胞内起着分解和降解蛋
白质的作用。

检测蛋白酶体的活性对于研究细胞的生物学功能和疾
病的发生具有重要意义。

目前，有多种方法可以用于检测蛋白酶体
的活性，以下是其中一些常用的方法：
1. 荧光显微镜观察，荧光显微镜可以观察蛋白酶体的形态和分布，结合荧光标记的蛋白质底物，可以直接观察蛋白酶体的活性和
分解过程。

2. 蛋白酶体活性检测试剂盒，商业化的蛋白酶体活性检测试剂
盒可以通过荧光或发光信号来检测蛋白酶体的活性，这些试剂盒通
常包含底物和检测试剂，操作简便，适用于高通量筛选和实验室研究。

3. 蛋白酶体特异性抑制剂，通过使用特异性的蛋白酶体抑制剂，可以抑制蛋白酶体的活性，从而间接检测蛋白酶体的功能。

4. 免疫印迹分析，利用特异性抗体对蛋白酶体相关蛋白进行免
疫印迹分析，可以检测蛋白酶体的相关蛋白表达水平，间接反映蛋
白酶体的活性。

总的来说，蛋白酶体的检测方法多种多样，可以根据实验需要选择合适的方法进行检测。

这些方法的应用可以帮助研究人员更好地理解蛋白酶体在细胞内的功能和调控机制，为相关疾病的研究和治疗提供重要的参考。

蛋白酶活性的测定方法(GB/T23527-2009)1 原理蛋白酶对酪蛋白、乳清蛋白、谷物蛋白等都有很好的水解作用。

磷钨酸和磷钼酸混合试剂，即福林-酚试剂，碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原而呈蓝色反应（钨兰和钨兰混合物）。

由于蛋白质中含有具有酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），因此，蛋白质及其水解产物也呈此反应。

利用蛋白酶分解酪素（底物）生成含酚基氨基酸的呈色反应，来间接测定蛋白酶的活力。

2 仪器和设备2.1 分析天平：精度0.0001g2.2 恒温水浴：精度±0.2℃2.3 计时表2.4 分光光度计2.5 沸水浴器2.6 振荡混合器2.7 pH计: 精度0.01pH单位3 试剂和溶液3.1 乳酸缓冲液（pH=3.0）适用于酸性蛋白酶甲液：称取乳酸（80%-90%）10.6g,加水溶解并定容至1000ml。

乙液：称取乳酸钠（70%）16g,加水溶解并定容至1000ml.使用溶液：取甲液8ml,加乙液1ml,摇匀，稀释一倍，即成0.05mol/L乳酸缓冲溶液。

3.2 磷酸缓冲液的制备（pH=7.5）适用于中性蛋白酶准确称取磷酸氢二钠（Na2HPO3.12H2O）6.02和磷酸二氢钠（NaH2PO3.2H2O）0.5g,加水定容至1000ml3.3 硼酸缓冲液(pH=10.5) 适用于碱性蛋白酶甲液：称取硼酸钠19.08g,加水溶解并定容至1000ml。

乙液：称取氢氧化钠4.0g,加水溶解并定容至1000ml.使用溶液：取甲液500ml,加乙液400ml,摇匀，用水稀释至1L。

3.4 0.4mol/L碳酸钠溶液：准确称取无水碳酸钠42.4g,以蒸馏水溶解定溶至1000ml.3.5 0.4mol/L的三氯醋酸液：准确称取65.4三氯醋酸,以蒸馏水溶解定溶至1000ml3.6 0.5mol/L的NaOH：准确称取2g NaOH溶解并定至100ml3.7 10.00mg/ml酪素溶液称取酪素1.000g,准确至0.001g,用少量的0.5mol/L的氢氧化钠溶液(若为酸性蛋白酶则用浓乳酸2-3滴)润湿,,加入适量的各适宜的缓冲液约80ml,在沸水浴中边加热边搅拌,直至完全溶解,冷却后,转入100ml容量瓶中,用适宜的缓冲液稀释至刻度,此溶液在冰箱内贮存,有效期为三天.3.8 100μg/ml酪氨酸标准溶液3.8.1 准确称取预先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g ,用1mol/L 的盐酸60ml 溶解后定容至100ml,即为1.00mg/ml的酪氨酸溶液.3.8.2 吸取1.00mg/ml酪氨酸标准溶液10.00ml,用0.1mol/L盐酸定容至100ml,即得100.0μg/ml L-酪氨酸标准溶液.3.9 酶样的制备准确称取1.000g固体酶或移取1ml液体酶样，用少量的适宜缓冲液溶解并用玻璃棒捣研,然后将上清液倒入100ml容量瓶,沉渣中再添入少量缓冲液捣研多次,最后全部移入容量瓶,稀释到刻度,用四层纱布过滤。

2000-14615-01页1:7DMC手动方法测定蛋白酶的活性1.适用范围本方法适用于测定纯蛋白酶或蛋白酶混合样品中蛋白酶的活性。

本方法还适用于测定洗涤剂中Savinase或Esperase蛋白酶的活性。

2.原理底物NN-二甲基酪蛋白（DMC）在实验条件下被Savinase蛋白酶水解生成小分子的多肽。

水解中形成的自由氨基酸基团与2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）有显色反应。

在425 nm下测定体系的吸光值，然后根据标准曲线计算样品的活性。

反应条件：温度： 50°C±1.0°CpH：8.3反应时间： 25分钟底物： NN-二甲基酪蛋白（DMC）3.单位定义酶活的单位相对于所用的标准品，具体请参见附件A-C。

4.专一性和灵敏度方法的检测限为标准曲线的最低点。

精确度约为5-6%。

5.仪器水浴，50°C ±0.1°CpH计漩涡振荡器16×150 mm试管精确计时器分光光度计6.试剂和底物6.1 化学试剂NN-二甲基酪蛋白（DMC）二水合磷酸二氢钠，NaH2PO4 2H2O十水合硼酸钠，Na2B4O7 10H2O硼酸，H3BO3氯化钾，KCl亚硫酸钠，Na2SO32,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）6.2 溶液6.2.1 0.4%DMC底物例如：配制 1 LNa2B4O7 10H2O …………………………32.40 gNaH2PO4 2H2O …………………………16.63 g去离子水………………………………400 mL再加热200 mL去离子水至沸腾，加入4.00 g DMC。

搅拌20分钟使之充分溶解，然后冷却到室温。

将以上两种溶液混合，转移到1000 mL的容量瓶中并混合均匀。

将配制好的底物过滤（Whatman 54号滤纸）后，调节pH到8.00±0.05，定容。

贮存：冰箱中7天。

6.2.2 BB9缓冲液例如：配制 1 LKCl……………………………………11.184 gNa2SO3………………………………20.00 gH3BO3……………………………………3.092 g去离子水……………………………加至1000 mL用浓NaOH调节pH到9.00±0.05。

水产动物酶活性测定方法一、分析样品的采取与处理每箱随机各取3尾异育银鲫，称重,于冰盘上解剖，取出肠道和肝胰脏,测定肠道长度，剔除脂肪组织，用4℃冷却的去离子水冲洗；然后用滤纸轻轻吸去水分，放入—26℃冰箱中迅速冷却保存，供测酶活性用。

二、酶液的制备将肝胰脏及肠组织缓慢解冻后，肠道匀分三等份，从前、中、后肠分别取有代表性食靡0.5g，放入离心塑料管中，加4ml，4℃冷却去离子水稀释，4℃下离心20min（13，000g），上清液标号分装，并与4℃冰箱中冷却保存，24Hr待测。

将肝胰脏及肠道组织用4℃去离子水清除肠道内容物后，用滤纸吸去表面水，取样各1.0g。

按样品重量加10倍的4℃冷却去离子水在冰浴下匀浆（稀释匀浆液匀浆4min,800rpm 匀浆玻璃管外设冰浴）。

匀浆液在4℃下离心20分钟（13，000g），上清液标号分装，并于4℃冰箱冷却保存，24Hr内测定完毕。

酶粉及饲料：取2．0克酶粉，先用10倍PH7.0缓冲液溶解，并放在40℃水浴中恒温30分钟，过滤留置滤液待测。

测定前再稀释10倍，20倍，100倍即可。

取2.0克饲料，加PH7.0缓冲液20ml溶解, 并放在40℃水浴中恒温30分钟，过滤留置滤液待测。

三、酶活性测定1.蛋白酶测定：前、中、后肠，肝胰脏。

方法：福林—酚试剂法1.1原理：蛋白酶从变性的酪蛋白中分解出可溶于三氯乙酸（TCA）的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等），这些氨基酸可用福林试剂使之发色（蓝色反应），用分光光度计测定。

1.2蛋白酶活性单位：1克食靡或组织在30℃，PH在7.0的条件下，每分钟水解酪蛋白产生1微克酪氨酸的酶量为1个酶活力单位。

1.3试剂1.福林试剂（已配）2.0.4M 碳酸钠溶液：取无水碳酸钠（Na2CO3）42.4g用水溶解和定容至1，000ml，存放与具胶塞的试剂瓶中。

3.0.1M三氯醋酸（TCA）：用小烧杯称取65.4g三氯醋酸，加水溶解后定容为1，000ml。

华南农业大学综合实验报告实验项目名称：酶活力测定实验项目性质：综合实验计划学时：所属课程名称：食品与发酵工业分析实验完成时间：2013.05.10糖化酶活力测定（直接滴定法）1、原理采用可溶性淀粉为底物，在一定的pH值与温度下，使之水解为葡萄糖 (还原糖)，以直接滴定法测定。

2、试剂及仪器（1）碱性酒石酸铜钾溶液（使用时等体积混合甲、乙溶液）：甲液：称取15.693g硫酸铜(Cu2SO4·5H2O)，0.05g次甲基蓝，用水溶解并稀释定容至1000mL；乙液：称取50g酒石酸钠钾，54g氢氧化钠，4g亚铁氰化钾，用水溶解并稀释定容至1000mL（2） 0.1%标准葡萄糖溶液：准确称取1g无水葡萄糖（预先在100-1050C 烘干），用水溶解，加5mL浓盐酸，用水定容至1000mL。

（3） pH4.6乙酸-乙酸钠缓冲溶液：0.2mol/L乙酸溶液：量取11.8mL冰乙酸，用水稀释至1000mL；0.2mol/L 乙酸钠溶液：称取27.2g乙酸钠（CH3COONa·3H2O），用水定容至1000mL；pH4.6乙酸-乙酸钠缓冲液：取0.2mol/L的乙酸溶液和0.2mol/L的乙酸钠溶液等体积混合。

（4） 0.1mol/L氢氧化钠溶液：称取4g氢氧化钠，用水溶解并定容至1000mL。

（5） 2%可溶性淀粉溶液：准确称取2g可溶性淀粉（预先于10-105 0C烘干），加少量水调匀，倾入80mL沸水中，继续煮沸至透明，冷却后用水定容至100mL。

（6）固体曲（7）滴定管、电子天平、烧杯、恒温水浴锅、脱脂棉、容量瓶、移液管、三角瓶3、测定步骤（1） 5%固体曲浸出液制备：称取5.0g固体曲（以绝干曲计），置于250mL 烧杯中，加90mL水和10mL pH4.6乙酸－乙酸钠缓冲溶液，搅匀，于30℃水浴中保温浸1小时，每隔15min搅拌一次。

用脱脂棉过滤，滤液为5％固体曲浸出液。

（2）固体曲糖化液的制备：吸取25mL 2％可溶性淀粉溶液，置于50mL容量瓶中，于30℃水浴预热10min。

蛋白酶检测操作1. 概述蛋白酶检测是一种用于检测样品中蛋白酶活性和浓度的实验操作。

蛋白酶是一类能够降解蛋白质的酶，其活性和浓度的检测对于许多生物学和生化学研究非常重要。

本文将介绍蛋白酶检测的基本原理、常用的实验方法和操作步骤，并简要介绍一些常见的蛋白酶检测试剂和设备。

2. 基本原理蛋白酶检测的基本原理是通过特定的底物或试剂与蛋白酶发生反应来间接或直接测定蛋白酶的活性或浓度。

常用的蛋白酶检测方法包括颜色反应法、荧光法和质谱法等。

2.1 颜色反应法颜色反应法是一种常用的蛋白酶活性测定方法，其原理是将蛋白酶作用于特定的底物后，产生的产物与某些指示剂发生颜色变化，并通过测定颜色的强度来间接测定蛋白酶的活性。

常用的颜色反应法有Bradford法、Lowry法和BCA法等。

这些方法的原理相似，底物与蛋白酶作用后产生巯基体系或受酸水解而形成可着色反应产物，其颜色强度与酶活性成正比。

2.2 荧光法荧光法是一种直接测定蛋白酶活性的方法，其原理是利用荧光探针与蛋白酶反应后荧光强度的变化来测定酶活性。

荧光法具有高灵敏度、高选择性和实时监测的优点。

常用的荧光法有AF488-Casein法和AF488-Gelatin法等。

这些方法的原理是荧光探针与蛋白酶结合后产生荧光信号，可以通过荧光显微镜或荧光光度计进行测定。

2.3 质谱法质谱法是一种直接测定蛋白酶活性和浓度的方法，其原理是利用质谱仪对蛋白酶水解产物进行检测和定量分析。

质谱法具有高灵敏度、高分辨率和高通量的优点。

常用的质谱法有MALDI-TOF法和LC-MS法等。

这些方法的原理是将蛋白酶水解产物通过质谱仪分析和测定，可以得到酶活性和浓度的相关信息。

3. 实验方法和操作步骤3.1 颜色反应法3.1.1 Bradford法材料准备•Bradford试剂•蛋白质标准溶液•待测样品实验步骤1.准备一系列不同浓度的蛋白质标准溶液，浓度范围覆盖待测样品的浓度。

2.取一定量的标准溶液和样品，分别加入试管中。

实验四蛋白酶活力得测定一、实验目得1、了解蛋白酶活力测定得原理;2、掌握蛋白酶活力测定得方法。

二、实验原理蛋白酶在一定条件下不仅能够水解蛋白质中得肽键,也能够水解酰胺键与酯键,因此可用蛋白质或人工合成得酰胺及酯类化合物作为底物来测定蛋白酶得活力、本实验选用酪蛋白为底物,测定微生物蛋白酶水解肽键得活力。

酪蛋白经蛋白酶作用后,降解成相对分子质量较小得肽与氨基酸,在反应混合物中加入三氯醋酸溶液,相对分子质量较大得蛋白质与肽就沉淀下来,相对分子质量较小得肽与氨基酸仍留在溶液中,溶解于三氯醋酸溶液中得肽得数量正比于酶得数量与反应时间。

在２８0ｎm波长下测定溶液吸光度得增加,就可计算酶得活力。

三、实验试剂①微生物蛋白酶萃取液(0、01g/ml):称取１。

0ｇ酶制剂,加１00ｍl蒸馏水搅拌30min,在4℃下离心分离后,将上层清夜置于冰箱中保存,使用前稀释一定倍数;② 0。

０2mol/L磷酸盐缓冲液(ｐH7.5);③ 1％酪蛋白溶液:取1、0g酪蛋白,加10０ml 0。

2mｏl/L磷酸盐缓冲液(PＨ7。

５),加热并搅拌使它完全分散,然后置于冰箱中保存;④ 5%三氯醋酸(TCA)溶液。

四、实验步骤1、将5％TCA溶液与1％酪蛋白溶液在37℃下保温。

２、取四支1５ml具塞试管,分别标上记号A1、Ａ０、Ｂ1与B０、在A１与A ０试管中各吸入0、20ml酶液,在Ｂ１与B0试管中各吸入0.４0ml酶液,分别用0.2mｏl/L磷酸盐缓冲液定容至２、00ml。

在A0与B0试管中各吸入6.00ml5%三氯醋酸溶液,上述四支试管都置于37℃水浴中保温、3、在各试管中吸入2。

00mｌ1％酪蛋白溶液,在３7℃下保温10ｍin(准确计时)后,再向A1与Ｂ1试管中吸入6。

00ml５％三氯醋酸溶液。

4、将试管从水浴中取出,在室温下放置1h,用少量上清液润湿滤纸后过滤,保留滤出液。

5、在2８０ｎｍ波长下,分别以A0与B0滤液为空白,测定A1与B１滤液得吸光度。