小鼠骨髓干细胞取样制备方法

分离小鼠骨髓间充质干细胞的方法一、分离方法说明及图例A.Ⅰ.取新鲜抗凝血液或脐带血与羟乙基淀粉550（Cat#：HES-TBD550）按1:1比例混合，37℃反应5-10分钟（5ml以下样本反应5分钟，5ml以上样本反应10分钟）；Ⅱ.取新鲜抗凝骨髓，加入一份细胞洗涤液（Cat#：2010X1118），混匀后以400g（约1500转/分）离心5分钟，弃去上清。

沉淀与羟乙基淀粉550（Cat#：HES-TBD550）按1:1比例混合，37℃反应5-10分钟（5ml以下样本反应5分钟，5ml以上样本反应10分钟）；B.加入为步骤A中所得混合液1/2体积的全血及组织稀释液（Cat#：2010C1119）混匀20℃-30℃自然沉降20-30分钟，吸取上清备用；C.向步骤B中所得上清液中加入为其一倍以上体积的细胞洗涤液（Cat#：2010X1118）混匀，以500g（约1800转/分）离心15分钟（半径15cm水平转子），弃去上清保留沉淀细胞；D.向细胞沉淀中加入全血及组织稀释液（Cat#：2010C1119）调整细胞浓度为2×108—1×109个/ml，小心叠加于细胞分离液之液面上（混合液：分离液=2:1）；（本实验采用天津灏洋TBD生物实验室的分离液）E.以400g（约1500转/分）离心20分钟（半径15cm水平转子）；第三层；为透明分离液层。

第四层；为极少数红细胞层。

收集第二层细胞放入约为其5-10倍体积的细胞洗涤液（Cat#：2010X1118）中，充分混匀后以500g（约1800转/分）离心1 5分钟。

沉淀经反复洗涤2次既得所需干细胞。

F.为获得纯度更高的干细胞，在步骤E中离心完成后可吸取第二层干细胞层再与羟乙基淀粉550（Cat#：HES-TBD550）按1:1比例混匀，20℃-30℃自然沉降20-30分钟，收集上清加入细胞洗涤液500g（约1800转/分）离心15分钟。

实验七小鼠骨髓细胞染色体标本的制备一、实验目的1. 学会小鼠骨髓细胞的采集和处理方法。

2. 掌握细胞较好的贴壁与生长条件，以保证细胞的好。

3. 学会最常用的Gimsa染色方法，使出现的幻觉具有明朗的色调，以便细胞的编号与统计。

二、实验原理骨髓细胞是一种多能性细胞，可分化为血液成分或骨骼系统的成分。

骨髓细胞被用于检测细胞遗传学异常，在染色体物质遗传及细胞迁移等方面具有潜在用处，并可为结构遗传学提供信息。

作为染色体标本制备的来源，一般选用小鼠骨髓细胞是最为经常采用的试验模型之一，常常作为各类染色体研究、映射和诊断的标本；其区别如来源易得、繁殖成本低、染色体数量较少，易于研究、成熟度高等因素显得优越。

三、实验步骤1. 实验前准备工作（1）保存干燥灭菌的小鼠骨髓细胞培养基，避免接触灰尘。

（2）检查各种器械的完整性，保证手段的杀菌处理。

（3）使用有缩小五倍功能的显微镜，以确保细胞图片清晰度与细胞形态的准确。

（4）打开红外线灯，以增强视觉效果并避免光损伤。

（5）按实验方案准备各种试剂和设备。

（6）实验室内准备50 mL恒温水浴和常规离心机。

2. 骨髓细胞的采集（1）设备：小鼠解剖刀片、50mL离心试管、海绵、抽管等。

（2）用70%酒精清洗瓶子的注射器，使用注射器收集小鼠间隔内的骨髓，放入存储试管中。

（3）轻轻摇动骨髓，使其中的细胞与上清液充分混合均匀。

3. 细胞的处理（1）细胞浓度的调整：从建立骨髓细胞培养物开始，骨髓细胞培养物可以在50mL培养基中存在。

使用试管取出足量细胞，可用比值0.2 mL的浓度悬液被移入12孔文化板中，吸入的细胞细胞数为2×106个左右。

（2）添加培养基到细胞培养物中，以充分覆盖细胞。

（3）将板加入约为35℃，5%二氧化碳环境下的恒温培养箱中，进行配队。

（4）半小时后使用显微镜检查细胞的附着，然后循环补充适量接种。

在24小时之前，每隔2小时更换于第一个。

4. Gimsa染色法（1）准备细胞标本：从培养基中取出涂片架，然后“组织培养板”模式的检测做法，将液体在上面包括涂片架移至吸满液体。

小鼠骨髓巨噬细胞提取步骤条件大家好，今天咱们聊聊那个让人又爱又恨的“大力士”——小鼠骨髓巨噬细胞。

这些小家伙可是医学研究的得力助手，无论是搞免疫学、肿瘤研究还是药物筛选，它们都少不了。

不过，你知道怎么从那些小不点儿身上提取出健康的巨噬细胞吗？别急，跟着我一起，轻松搞定这个难题！你得准备好你的实验室装备和试剂。

别忘了显微镜啦，这可是捕捉巨噬细胞的神器；还有那试管、离心机、培养皿等等，都是缺一不可的。

对了，别忘了准备一些无菌的操作台和手套，这可是为了保护你免受细菌侵袭哦！接下来，就是开始我们的“捕猎”行动了。

先把小鼠的骨髓抽出来，就像从一个大宝藏里挖宝贝一样。

然后呢，就是把它们放到培养皿里，让它们像小精灵一样自由地游来游去。

这时候，你得用点小技巧，比如轻轻摇晃培养皿，或者在边缘放些糖块，这样巨噬细胞就能自动聚集到一起啦！嘿，你以为这就结束了？No No No！接下来才是重头戏。

你需要给这些小战士穿上“战袍”，也就是让他们变成巨噬细胞。

这可不容易，得经过一番“炼狱”般的过程。

记得要控制好温度和湿度，还要时不时检查一下他们的“装备”，确保一切都完美无瑕。

最后一步，就是把这些“勇士”送到实验室的大舞台上，进行各种测试和分析。

看看他们是不是像你想象的那样勇猛善战，能不能为你的实验提供强大的支持。

当然啦，如果有什么不满意的地方，也别忘了及时调整策略，毕竟“失败是成功之母”嘛！好了，关于小鼠骨髓巨噬细胞提取步骤的条件就讲到这里啦。

你是不是觉得这个过程既神奇又有趣？别急，这只是冰山一角，更多的奥秘等着你去发现呢！记得动手实践的时候，一定要小心谨慎，安全第一哦！。

小鼠原代骨髓细胞提取及诱导骨髓来源的巨噬细胞分化实验前准备：超净工作台、水平式低速离心机、10ml离心管、75cm2细胞培养皿、2mL注射器、无菌40μm尼龙过滤器、细胞吸管、无菌眼科剪、无菌眼科镊、75％酒精溶液、无菌PBS溶液、红细胞裂解液、DMEM细胞培养基、胎牛血清、M-CSF因子、细胞计数版、倒置显微镜等。

操作步骤：（1）C57BL/6小鼠颈椎脱臼处死，用75％酒精溶液对其充分消毒，固定小鼠。

（2）无菌条件下分离并取下小鼠的股骨和胫骨，小心不要打破骨头。

然后放入事先含有75%酒精的75cm2的细胞培养皿中。

（3）移入生物安全柜中，进一步分离去除骨周围组织，然后将其移入含有1×PBS的另一细胞培养皿中清洗，最后再将其转移另一 75cm2细胞培养皿（含有1%双抗的DMEM的细胞培养基）中等待下一步处理。

（4）用眼科组织剪去除股骨和胫骨的骨两端，然后含有2ml DMEM 细胞培养基的注射器从骨的一个断端冲洗骨髓细胞到10ml无菌离心管中，重复 3 次。

（5）1500r/min，离心 8min，弃上清液。

（6）加入5ml红细胞裂解液，吸管反复吹打，然后静置 3min。

（7）1500r/min，离心 8min，弃上清液。

（8）加入5ml DMEM 细胞培养基重悬细胞，然后用40μm尼龙过滤器过滤细胞。

（9）1500r/min，离心 8min，弃上清液，重复 3 次。

（10）a 加入含有 20%FBS/ DMEM 的细胞培养液重悬细胞，到该步骤提取完毕。

b 加入含有 20ng/ml的 M-CSF 的 20%FBS/ DMEM 细胞培养液重悬细胞，诱导骨髓细胞分化为巨噬细胞。

细胞计数，调整细胞浓度至1×106／mL。

接种75cm2细胞培养皿中。

（11）放于37℃、5％二氧化碳饱培养箱中培养，待后续实验研究。

小鼠骨髓细胞染色体标本制作与观察试验目的把握动物骨髓染色体标本制备基本过程，了解操作步骤的原理试验原理小鼠骨髓细胞中的造血干细胞是生成各种血细胞和原始细胞，具有高度的分裂力量，本试验采纳这一材料，通过前处理，低渗，固定，制片，染色等步骤制得染色体标本，可观看到很多处于分裂中期的染色体，可以进行染色体组型分析。

试验原理制备方法包括以下几个要点:1. 用肯定剂量的秋水仙素破坏纺锤丝的形成，使细胞分裂停滞在中期, 使中期染色体停留在赤道面处2. 用低渗法使将细胞膨胀, 以至于在滴片时细胞被胀破, 使细胞的染色体铺展到载玻片上3. 空气干燥法可使使细胞的染色体在载片上展平, 经Giemsa染色后便可观看到染色体的显微图象试验用品1．材料：小白鼠2．器具：注射器（1ml,5ml）剪刀镊子玻璃吸管10ml刻度的离心管离心机载玻片盖玻片显微镜滤纸擦镜纸纱布恒温水浴锅3．药品：0.01%秋水仙素0.075MKCl 固定液（甲醇：冰醋酸=3：1）2%柠檬酸钠改良石炭酸品红试验步骤预处理取股骨冲洗骨髓离心低渗离心固定离心滴片染色观看1．预处理：试验前2.5-3小时，按每克体重注射0.02ml，给小白鼠腹腔注射秋水仙素。

2．取股骨：断颈处死小鼠后，剔去肌肉组织，洗净3．冲洗骨髓：剪去两端的股骨头，吸取10ml 2%柠檬酸钠，注射器针头插入股骨一端,反复冲洗两根股骨，洗液收集到10ml的离心管中4 ．离心：1000r/min 离心10 min ,弃上清5 ．低渗：加入8ml 0.075mol/LKCl溶液,滴管吹散,37℃水浴低渗30 min ，中间（约15 min ）再吹散一次，使细胞分散，悬浮于溶液中6．离心：1000r/min离心10 min，弃上清7．固定：沉淀加8ml固定液，并用吸管轻轻吹匀，进行固定，中间（约15 min ）再吹散一次试验步骤8. 离心：1000r/min 离心10 min ,留1 ml 左右上清，轻轻吹打成细胞悬液9. 滴片：用吸管吸取细胞悬液，高度30-40 cm，滴在预冷的载玻片上，在酒精灯火焰上微微加热，室温晾干10. 染色：改良石炭酸品红染色10-20 min11. 观看：低倍高倍。

小鼠骨髓巨噬细胞提取步骤条件提到小鼠骨髓巨噬细胞提取，听起来是不是有点高大上？其实没那么复杂，今天咱们就来聊聊这个有趣的过程，让你在实验室里也能当个“高手”。

准备好了吗？咱们一起探讨这段神奇的旅程吧！1. 准备工作在我们正式开始之前，得先做好准备工作。

说到准备，这可不是随便说说。

首先，咱们得确保实验室干净整洁，像个新婚的小屋一样。

再来，准备一些必备的器材，像是无菌的培养皿、移液器、离心管等等。

为了不让自己搞得一团糟，记得提前检查一遍，保证每样东西都在你手边，等着派上用场。

1.1 选小鼠小鼠的选择可是一门学问，嘿嘿！一般来说，咱们选择6到8周大的小鼠比较好，这时候的小家伙正是“青春期”，骨髓里的细胞活力满满。

注意啦，选择健康的小鼠可比挑选水果还重要，生病的小鼠提取出来的细胞就像旧电池，毫无用处。

顺便提一句，实验之前得做好伦理审查，咱们得对小生命有个底线，对吧？1.2 麻醉和取样小鼠准备好后，我们就得给它们麻醉了。

说到麻醉，那可得慎重，不要用家里的香水哦，咱们得用合适的麻醉剂。

然后，用小手术刀轻轻一划，咱们就能看到骨髓啦！其实，取样的过程还是蛮刺激的，就像打游戏一样，手要稳，心要静，别一紧张把鼠标摔了。

2. 骨髓细胞提取好了，接下来就是重头戏了！小鼠的骨髓提取出来后，咱们得进行离心处理。

这个过程听起来复杂，其实就像打蛋一样。

把骨髓放到离心管里，然后送进离心机，调好转速和时间，咔嚓一声就可以开始了。

这时候，可以泡杯茶，放松一下，等着看成果。

2.1 细胞分离离心完成后，细胞会分层。

顶部的液体是我们不需要的，下面的细胞沉淀就是咱们的目标。

小心翼翼地吸取上面的液体，留住底部的细胞，这就像分开面粉和糖，讲究技巧哦！吸取完毕后，加入培养基，让这些细胞在温暖的“家”里好好待着。

2.2 培养细胞现在，细胞进入培养阶段。

要想让它们长得好，咱们可得提供个舒适的环境。

这包括恒温、恒湿，光照条件也要控制好。

别忘了定期更换培养基，就像给植物浇水一样，细胞也需要“吃饭”。

小鼠骨髓细胞染色体标本制备1. 引言大家好，今天我们来聊聊一个听起来可能有点儿复杂，但其实挺有趣的话题——小鼠骨髓细胞染色体的标本制备。

别担心，我会把这些专业术语说得简单明了，让你也能轻松get到这个过程。

说起来，小鼠可真是科学研究中的“常客”，就像饭桌上的米饭，随处可见，缺了它可不行。

这不，今天咱们就来探索一下怎么从小鼠身上提取骨髓细胞，搞个染色体标本，看看这些小家伙们的秘密。

2. 骨髓细胞的来源2.1 小鼠的选择首先，你得找一只小鼠。

挑小鼠可不是随便的，得挑那些健康活泼的小家伙，就像挑选水果一样，选那种又圆又亮的最好。

一般来说，实验室里会用小鼠的某个特定品系，比如C57BL/6，它们可是科研界的明星。

别忘了，鼠鼠们可不是随便抓来的，得遵循一套规矩，确保它们的生活环境干净卫生，毕竟咱们要尊重这些小生命。

2.2 获取骨髓细胞接下来，就是动手获取骨髓细胞的环节了。

首先，要麻醉小鼠，这一步可不能省，麻醉得当才能让它们安静下来，不然你想抓取细胞，它们可是不会轻易妥协的。

麻醉之后，小心翼翼地取出小鼠的骨髓，这个过程就像是在做外科手术，要有点儿医生的范儿，稳重些。

骨髓一般是在鼠鼠的股骨和胫骨里，捣鼓的时候要小心别伤到周围的组织。

3. 细胞制备过程3.1 细胞分离一旦取出骨髓，你会发现那里面的小细胞们就像一群调皮的孩子，四处乱窜。

我们要做的就是把它们从骨髓中分离出来。

这个过程通常会用到生理盐水，简单说就是把骨髓和盐水混合，轻轻摇晃，让细胞们游出来。

记住，摇晃的时候要轻柔，别像个暴徒一样，细胞们可是很娇嫩的！3.2 染色体制备接下来就是最神奇的部分——染色体的准备。

我们需要把这些细胞放到培养基里，让它们再长一段时间，这样细胞会分裂得更多，染色体也会更加明显。

等到细胞生长到一定程度，我们就可以通过加一些化学药剂，比如秋水仙素，来阻止它们的分裂，准备好进行染色。

4. 染色体的染色与观察4.1 染色过程染色这个步骤可有意思了！我们要用一种专门的染色液，把这些细胞染上色。

小鼠骨髓细胞染色体标本的制备The final revision was on November 23, 2020小鼠骨髓细胞染色体标本的制备【目的要求】1.掌握小鼠细胞染色体标本制备方法。

2.计数并观察小鼠骨髓细胞分裂中期染色体的数目及特点【基本原理】在骨髓细胞中，有丝分裂旺盛，因此不需要体外培养就可以直接得到中期细胞。

骨髓细胞具有高度的分裂活性，经秋水仙素或秋水酰胺处理后，使分裂细胞阻断在有丝分裂中期，再经低渗处理、固定、滴片、染色等步骤，可制作较好的骨髓细胞的染色体标本。

【实验用品】1．器材：解剖刀、剪刀、镊子、注射器、离心机、离心管、恒温水浴箱、冰冷载玻片、酒精灯、大培养皿、显微镜、纱布,标签纸，记号笔等；2．试剂%秋水仙素溶液、Carnoy’s固定液（甲醇：冰醋酸＝3：1）、 mol / L KCI溶液、Giemsa 染液等。

3．材料：65-90天健康小鼠（生技09级72人，新华09生物技术36人，生科08级75人，生技08级70人，共253人，需购小鼠110只）【方法与步骤】1．前处理取材前3～4 h，向腹腔内注射秋水仙素。

注射浓度随动物种类不同而异，一般每克体重注射2～6μg，注射总量不宜超过2 ml（例如一只体重50 g 的蟾蜍，若按4μg / g注射，需注射浓度为％的秋水仙素溶液 ml ）。

秋水仙素的主要作用是使分裂细胞阻断在有丝分裂中期，增加中期分裂相的比例。

2．取骨髓细胞处死动物，用装有生理盐水的注射器反复冲洗出骨髓细胞，并用注射器筒轻轻吹打，使细胞团块分散，静置片刻、待大组织团块沉淀后，用吸管将骨髓细胞悬浮液移至离心管中，以1000 r / min 离心5~10 min，弃去上清液。

3．低渗根据骨髓细胞液的多少，加 mol / L的 KCI液5～6 ml，在37℃水浴箱中或室温下低渗20～30 min。

低渗时间过长，易造成细胞破裂；时间过短，则染色体难以分散。

4．预固定低渗完毕，立即加入1 ml 新配制的预冷Carnoy’s固定液，用吸管将细胞轻轻吹打均匀，进行预固定。

实验二小鼠骨髓细胞染色体标本制备实验目的：通过制备小鼠骨髓细胞染色体标本，了解染色体结构、形态和变异等方面的知识，为后续核型分析、染色体异常检测等实验打下基础。

实验原理：小鼠骨髓细胞染色体标本制备是指将小鼠骨髓组织中的细胞进行处理后制备成适合观察的染色体标本。

该标本制备方法包括细胞处理，染色体制备和染色体观察等环节。

1.小鼠骨髓细胞处理将小鼠放入固定夹，使用无菌注射器向小鼠腹腔注入适量的钾盐缓冲液（KCl，0.074mol/L）。

钾盐缓冲液的功能是使细胞发生肿胀，探头区别正常细胞和异常细胞。

此外，钾盐缓冲液也有不利的作用，可以导致一些染色体脱落或断裂。

接下来，在小鼠固定夹上进行剖腹，取出骨髓。

骨髓组织放置在一滴含有10%甘露醇的氯仿中进行易位。

在显微镜下观察细胞的形态结构，进行可行性检测。

2.染色体制备取干净的药片，滴入细胞悬液，热外片变性塔。

药片的材料使用高价值玻璃药片，这样可以保证药片平整和染色体不能和药片表面黏附。

加入甘醇一定要多加就能快速促进水分的蒸发，避免液体反应产生气泡而影响结果。

不需要太用力，在药片的表面轻轻涂抹，使液体均匀分布。

接下来，将药片吸入液、95%甲醇，以及3%乙酸中每个5分钟，直到药片完全干燥。

3.染色体观察将药片上的细胞标本置于显微镜上，根据染色体数目和形态等信息进行染色体分析。

在显微镜下观察染色体的特征，包括染色体数量、形态、大小、位置以及异常情况等。

对观察到的染色体进行记录和描述。

实验结果：通过对小鼠骨髓细胞进行染色体制备和检测，我们可以观察到染色体的结构、形态等方面的特征。

此外，通过对染色体的数量和形态进行观察，还可以发现染色体的变异情况，进一步了解染色体的异常情况。

在实际操作过程中，需要注意细胞处理和染色体制备的每一个环节，以保证实验的准确性和可靠性。

实验五、小鼠骨髓细胞染色体标本的制备【目的要求】1.掌握小鼠细胞染色体标本制备方法。

2.计数并观察小鼠骨髓细胞分裂中期染色体的数目及特点【基本原理】在骨髓细胞中，有丝分裂旺盛，因此不需要体外培养就可以直接得到中期细胞。

骨髓细胞具有高度的分裂活性，经秋水仙素或秋水酰胺处理后，使分裂细胞阻断在有丝分裂中期，再经低渗处理、固定、滴片、染色等步骤，可制作较好的骨髓细胞的染色体标本。

【实验用品】1．器材：解剖刀、剪刀、镊子、注射器、离心机、离心管、恒温水浴箱、冰冷载玻片、酒精灯、大培养皿、显微镜、纱布,标签纸，记号笔等；2．试剂0.1%秋水仙素溶液、Carnoy’s固定液（甲醇：冰醋酸＝3：1）、0.075 mol / L KCI 溶液、Giemsa染液等。

3．材料：65-90天健康小鼠【方法与步骤】1．前处理取材前3～4 h，向腹腔内注射秋水仙素。

注射浓度随动物种类不同而异，一般每克体重注射2～6μg，注射总量不宜超过2 ml（例如一只体重50 g的蟾蜍，若按4μg / g注射，需注射浓度为0.1％的秋水仙素溶液0.2 ml ）。

秋水仙素的主要作用是使分裂细胞阻断在有丝分裂中期，增加中期分裂相的比例。

2．取骨髓细胞处死动物，用装有生理盐水的注射器反复冲洗出骨髓细胞，并用注射器筒轻轻吹打，使细胞团块分散，静置片刻、待大组织团块沉淀后，用吸管将骨髓细胞悬浮液移至离心管中，以1000 r / min 离心5~10 min，弃去上清液。

3．低渗根据骨髓细胞液的多少，加0.075 mol / L的KCI液5～6 ml，在37℃水浴箱中或室温下低渗20～30 min。

低渗时间过长，易造成细胞破裂；时间过短，则染色体难以分散。

4．预固定低渗完毕，立即加入1 ml 新配制的预冷C arnoy’s固定液，用吸管将细胞轻轻吹打均匀，进行预固定。

然后以1000 r / min 离心8 min。

5．固定弃去上清液，加5～6 ml Carnoy’s液，轻轻吹打细胞，静置固定20 min。