小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDC)培养

bmdc培养方法BMDC培养方法是一种常用的小鼠树突状细胞(Dendritic Cell, DC)培养方法，主要用于研究DC的功能和调控机制。

以下是关于BMDC 培养方法的详细介绍：1. 实验材料准备：小鼠骨髓细胞RPMI-1640培养基小鼠GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)和IL-4(白细胞介素-4)无菌培养箱、离心机、显微镜等实验设备2. BMDC的获取：从小鼠的股骨和胫骨中提取骨髓细胞，用RPMI-1640培养基洗涤并悬浮。

将骨髓细胞以1×10^6/mL的密度接种到无菌的培养瓶中，加入GM-CSF和IL-4，使其终浓度分别为50ng/mL和20ng/mL。

将培养瓶置于37℃，5%CO2的培养箱中，每两天更换一次培养基。

3. BMDC的成熟：在BMDC培养的第5天，用GM-CSF和IL-4继续诱导BMDC的成熟。

此时，GM-CSF的浓度可以降低至25ng/mL，而IL-4的浓度可以维持在20ng/mL。

在BMDC培养的第7天，观察BMDC的形态变化，成熟的BMDC 呈树突状，表面有丰富的毛刺状突起。

此时，可以收集成熟的BMDC 进行后续实验。

4. BMDC的功能检测：将成熟的BMDC与抗原提呈细胞(如B细胞、T细胞等)共培养，观察BMDC对抗原提呈细胞的激活作用。

将成熟的BMDC与特异性抗体结合，观察BMDC对抗原的识别和摄取能力。

将成熟的BMDC与免疫细胞(如T细胞、NK细胞等)共培养，观察BMDC对免疫细胞的调节作用。

5. BMDC的应用：用于研究DC的功能和调控机制，如DC的抗原提呈、共刺激信号传导、凋亡抑制等。

用于制备疫苗，通过激活T细胞和B细胞，提高机体对病原体的免疫力。

用于研究免疫耐受、自身免疫性疾病等疾病模型。

总之，BMDC培养方法是一种常用的小鼠树突状细胞培养方法，通过诱导骨髓细胞分化为成熟的树突状细胞，可以用于研究DC的功能和调控机制，以及制备疫苗等应用。

专利名称：一种小鼠骨髓来源树突状细胞的培养方法专利类型：发明专利
发明人：国林沛,解晖,杨宪法,王准,彭双鹤,唐慧琴
申请号：CN202111468217.1
申请日：20211203
公开号：CN114058585A
公开日：
20220218
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及细胞培养领域，特别是小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDC)的原代培养。

该细胞培养步骤，包括：步骤A：获取小鼠完整的股骨；步骤B：获取股骨中的骨髓干细胞；步骤C：将骨髓干细胞接种于细胞培养板中，并加入细胞因子，刺激分化为树突状细胞。

本发明提供了一种经济高效的培养小鼠骨髓来源树突状细胞的方法，数十分钟即可获得大量的骨髓干细胞，加入少量的细胞因子培养6‑8天即可获得2×107以上成熟的树突状细胞。

申请人：无锡市第二人民医院
地址：214001 江苏省无锡市梁溪区中山路68号
国籍：CN
代理机构：天津佳盟知识产权代理有限公司
代理人：林玉慧
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小鼠骨髓来源树突状细胞（BMDC）培养小鼠骨髓来源树突状细胞（BMDC）的培养1、取骨髓，对倍稀释2、用滴管沿管壁缓慢加入淋巴细胞分离液(45度角倾斜，尽量产生气泡，起到缓冲作用)3、2000转，离心30分钟4、吸取白膜层，（沿管壁）交替多次吸取，加入5倍体积以上的PBS液5、1500转，离心15分钟（洗掉血小板）6、弃掉上清，留少许回流液，轻弹管壁，加入PBS液至50ml7、800转，离心10分钟，（洗掉红细胞）8、重复两至三次9、加入PBS液至50ml，计数:？个细胞离心后铺板，1X1076孔板培养液，共铺20板。

无血清1640+DNA酶12h后轻晃培养液，洗板后加入完全培养基和GM—CSF(1000U/ml)和IL—4(500U/lml) 10、第三天每孔补加等体积的完全培养基和GM—CSF(1000U/ml)和IL—4(500U/lml) ，这时细胞部分悬浮11、第五天为imDC，+1LPS(1ug/ml),诱导至第七天，为mDC。

参考Inaba等人的方法，并根据本实验室的经验稍作改进。

即：1. 颈椎脱位法处死C57BL/6小鼠，无菌状态下取股骨和胫骨，浸泡在RPMI-1640培养基中。

2. 用1ml注射器吸取RPMI-1640培养液，从骨干的一端刺入骨髓腔，将骨髓冲洗到一无菌培养皿中，每根骨头反复4～6遍，收集培养皿中的骨髓细胞悬液，离心，1500 rpm×10min。

3. 弃去上清，加入5 ml无菌Tris-NH4Cl溶液悬浮细胞溶解红细胞，于室温下静置2分钟溶解红细胞后，再次离心，1500 rpm×5min，弃上清。

4. 用RPMI-1640培养液洗涤后将细胞用完全培养基悬浮，分至6孔培养板中，并在每孔中加入完全培养基至4 ml，再加入rmGM-CSF 至终浓度10 ng/ml，IL-4终浓度10ng/ml。

5. 将细胞培养板放入37℃，含5% CO2的孵箱中培养48小时。

bmdc细胞提取步骤BMDC（骨髓源性树突状细胞）的提取步骤通常包括以下几个步骤：1.准备工作：a.高效细胞培养基：根据实验要求选择适合的培养基，常见的包括RPMI-1640培养基、DMEM等。

b.包含20%胎牛血清（FBS）的细胞培养基。

c.手术器械：包括手术刀、剪刀、镊子和注射器等。

d.消化酶：常用的有胰蛋白酶和胶原酶等。

e.细胞培养条件：包括恒温恒湿的细胞培养箱以及含5%CO2的细胞培养箱。

2.动物准备：a.选择符合实验要求的动物（常用小鼠）。

b.按照实验室动物管理规定进行麻醉和安乐死操作。

c.用70%乙醇对动物表面进行消毒。

3.BMDC提取：a.彻底消毒动物表面后，在操作实验纸上将动物放置在耳板的背面。

b.使用消毒的剪刀和镊子，从动物的骨髓中提取骨骼。

c.将提取的骨骼置于含有培养基的试管中，并用注射器吸入10mL的培养基，将髓腔彻底清洁。

d.将清洗后的骨骼放在含有培养基的培养皿中，在恒温恒湿的培养箱中孵育24小时。

4.BMDC筛选和分离：a.24小时后，将培养皿中的骨骼取出，用胰蛋白酶和胶原酶进行胶原酶消化处理。

b.消化结束后，用细胞培养基将胶原酶停止消化，并通过筛选筛除未消化的骨骼颗粒。

c.将筛选后的纯化细胞放入含有培养基的96孔培养板中，每孔种植一定数量的细胞。

d.将种植后的培养板放入恒温恒湿的培养箱中进行细胞培养和观察。

5.细胞培养和扩增：a.用培养基进行细胞培养，每2-3天更换一次培养基。

b.确保培养皿内有适当的氧气和营养物质。

c.观察细胞的生长情况，密度达到一定程度后，用胰蛋白酶进行细胞裂解。

d.细胞数目达到要求后，用所需的方式进行实验或培养。

BMDC的提取过程需要严格的操作和分离步骤，确保获取纯化的树突状细胞，这对进一步的实验研究是非常重要的。

中国组织工程研究与临床康复第14卷第45期 2010–11–05出版Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research November 5, 2010 Vol.14, No.45 ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH8455 Department ofUrinary Surgery, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei Province,ChinaZhu Guo-hui★, Studying for master’s degree, Departmentof Urinary Surgery, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei Province,Chinadrzhugh@hotmail.com Correspondence to:Liu Xiu-heng, Professor, Chief physician, Doctoral supervisor, Department ofUrinary Surgery, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei Province,Chinadrliuxh@Supported by: the National Natural Science Foundationof China, No. 30672107*Received: 2010-05-01 Accepted: 2010-06-30小鼠骨髓源性树突状细胞培养与冻存*★朱国辉，翁小东，刘修恒，匡幼林Culture and cryopreservation of mouse bone marrow-derived dendritic cellsZhu Guo-hui, Weng Xiao-dong, Liu Xiu-heng, Kuang You-linAbstractBACKGROUND: Dendritic cell is an ideal carrier of tumor antigen due to the presenting function and the promotion of T cell proliferation. How to obtain large numbers of dendritic cells is important for producing tumor vaccine.OBJECTIVE: To induce, culture, amplify and cryopreserve dendritic cells derived from mouse bone marrow, then compare the biological characters of cryopreserved dendritic cells with the fresh dendritic cells, than find an effective method to obtain and store large numbers of dendritic cells.METHODS: Dendritic cells from mouse bone marrow cells were induced, cultured and amplified in complete medium with recombinant mouse granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (rmGM-CSF) (10 μg/L) and recombinant mouse interleukin 4 (rmIL-4) (5 μg/L). On day 6, the dendritic cells were frozen in complete medium with dimethyl sulphoxide. After thawing, lipopolysaccharide was added to induce the maturation. At last, large number of mature dendritic cells was obtained. Then the viability, morphology, dendritic cells markers and mixed lymphocyte reaction were compared between the thawed cells and fresh cells.RESULTS AND CONCLUSION: After thawing, the recovery rate of cells was (82.2±4.73)%. The survival cells became mature dendritic cells induced by lipopolysaccharide. Compared with fresh dendritic cells, there was no significant difference in morphology, dendritic cells markers and mixed lymphocyte reaction. Results suggest that there was no significant difference in biological characters between frozen-thawed dendritic cells and fresh dendritic cells. To store dendritic cells through cryopreservation can avoid repeating culture in different times and can obtain large numbers of dendritic cells.Zhu GH, Weng XD, Liu XH, Kuang YL.Culture and cryopreservation of mouse bone marrow-derived dendritic cells.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2010;14(45): 8455-8459. [ ]摘要背景：树突状细胞因其良好的抗原提呈功能及促T细胞增殖功能，成为肿瘤抗原的良好载体。

小鼠骨髓源树突状细胞体外诱导培养及初步鉴定刘铮;代继宏;符州;冯琳琳【摘要】To establish a method of cultivation and purification of dendritic cells ( DC) from mouse bone marrow in vitro and observe their morphology, recombinant mouse granulocyte and macrophage colony stimulus factor( GM-CSF) and interleukin-4( IL4) induction were used to induce mouse bone marrow cells to form dendritic cells in vitro. After 9 days , the percentage of the cultured DCs was more than 80％ with typical morphology of DCs under light microscope. The mature cells had clear marker on their surface. This meant that these used substances could stimulate allogenic mixed lymphocyte proliferation.%用重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)和重组小鼠白细胞介素4(rmIL-4)体外诱导小鼠骨髓细胞分化为树突状细胞,进行形态学变化观察,分析细胞表面分子,刺激T细胞增殖,探讨小鼠骨髓源树突状细胞(BMDC)体外诱导培养并进行初步鉴定.体外培养9d后BMDC可达80%以上m,光镜下可见典型的树突状细胞形态.清楚表达成熟期主要表面标志物,可显著刺激同种异体混合淋巴细胞增殖.获得了较高纯度的BMDC,避免了使用传统磁珠分离方法所带来的成本高,操作复杂,产出率低的弊端,为研究BMDC功能以及运用开展下游实验提供材料.【期刊名称】《生物学杂志》【年(卷),期】2011(028)002【总页数】4页(P25-27,31)【关键词】树突状细胞;体外诱导培养;初步鉴定【作者】刘铮;代继宏;符州;冯琳琳【作者单位】儿童发育疾病研究省部共建教育部重点实验室儿科学重庆市重点实验室重庆市(儿童发育重大疾病诊治与预防)国防科技合作基地;重庆医科大学附属儿童医院呼吸中心,重庆,400014;重庆医科大学附属儿童医院呼吸中心,重庆,400014;儿童发育疾病研究省部共建教育部重点实验室儿科学重庆市重点实验室重庆市(儿童发育重大疾病诊治与预防)国防科技合作基地【正文语种】中文【中图分类】Q813.5Abstract:To establish a method of cultivation and purification of dendritic cells(DC)from mouse bone marrow in vitro and observe theirmorphology,recombinantmouse granulocyte and macrophage colony stimulus factor(G M-CSF)and interleukin-4(I L4)induction were used to inducemouse bonemarrow cells to for m dendritic cells in vitro.After9 days,the percentage of the culturedDCswasmore than 80%with typicalmorphology ofDCs under lightmicroscope.The mature cells had clearmarker on their surface.Thismeant that these used substances could stimulate allogenic mixed lymphocyte proliferation.Keywords:dendritic cells;culture in vitro;initial appraisal树突状细胞(dendritic cell,DC)是一种专职性抗原提呈细胞,在肿瘤、抗感染免疫、移植排斥等方面起着关键的引导和调节作用,并能显著激活初始型 T淋巴细胞并诱导其增殖,处于免疫应答过程的中心环节。

bmdms培养方法
BMDMS是指骨髓来源的巨噬细胞（Bone Marrow-Derived Macrophages）。

它们是一种重要的免疫细胞，常被用于研究免疫学、生物学和疾病模型等方面。

下面我将从多个角度介绍BMDMS的培养
方法。

1. 材料准备。

常用培养基包括DMEM（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）或RPMI 1640培养基，其中含有10%胎牛血清（FBS）或去
血清培养基，还有抗生素如青霉素/链霉素。

2. 培养骨髓细胞。

首先需要从小鼠或大鼠的骨髓中分离细胞。

通常使用灭菌的
方式，将小鼠或大鼠的胫骨和腓骨取出，用培养基冲洗骨髓腔，将
细胞悬浮液通过滤网筛选，得到单个的骨髓细胞。

3. 培养和分化。

将分离得到的骨髓细胞接种在培养皿中，培养基中含有巨噬细胞分化因子如M-CSF（巨噬细胞集落刺激因子）。

细胞培养在37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中，每隔2-3天更换一次培养基，培养7-10天左右，即可得到成熟的BMDMS。

4. 细胞纯化。

有时为了得到更纯净的BMDMS，可以利用差速贴壁法（adherence method）或密度梯度离心分离等技术进行细胞纯化。

总之，BMDMS的培养方法是一个复杂而精细的过程，需要严格控制培养条件和培养基的配方，以确保得到高质量的巨噬细胞。

同时，培养过程中的细胞分化、纯化等步骤也需要根据具体实验的要求进行调整和优化。

希望以上信息能够对你有所帮助。