结合单酶切位点的融合PCR技术对SCN1A基因的定点诱变

各种题型确定题目重要题目候补题目不确定答案的题目试卷与题库重复题目名词解释同裂酶（同切点酶）：有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶序列，这类酶称为同裂酶。

同尾酶：与同裂酶对应的一类限制性内切酶,它们来源各异，识别的靶序列也各不相同,但切割后都能产生相同的黏性末端,特称为同尾酶。

测序酶：是经修饰过的T7噬菌体DNA聚合酶，是采用缺失的方法，从外切核酸酶结构域中除去28个氨基酸，这样使得T7DNA聚合酶完全失去了3~-5~外切酶活性，只有5~-3~聚合酶活性，而且聚合能力很强，测序时常用此酶。

与klenow相比优点是：是双脱氧链终止法对长片段进行测序的理想用酶。

限制性核酸内切酶：是一类能识别和切割双链DNA分子中特定碱基系列的核酸水解酶。

限制-修饰系统中的限制和修饰作用：限制-修饰系统中的限制作用是指一定类型的细菌可以通过限制性酶的作用，破坏入侵的外源DNA(如噬菌体DNA等)，使得外源DNA对生物细胞的入侵受到限制；而生物细胞(如宿主)自身的DNA分子合成后，通过修饰酶的作用，在碱基中特定的位置上发生了甲基化而得到了修饰，可免遭自身限制性酶的破坏，这就是限制-修饰系统中的修饰作用。

5. 限制性片段长度多态性（RFLP）：当DNA序列的差异发生在限制性内切酶的识别位点时，或当DNA片段的插入、缺失或重复导致基因组DNA经限制性内切酶酶解后，其片段长度的改变可以经过凝胶电泳区分，出现的这种DNA多态性称为限制性片段长度多态性。

6. 星号活性：限制性内切核酸酶识别和切割特异性位点是在特定的条件下测定的。

当条件改变时，许多酶的识别位点会改变，导致识别与切割序列的非特异性，这种现象称为星号活性。

（“非最适的”反应条件例如高浓度的核酸内切限制酶、高浓度的甘油、低离子强度、用Mn2+取代Mg2+以及高pH值等。

)克服星号活性的方法：维持反应体系适当的离子强度、较低的温度或酶浓度，尽可能缩短反应时间或DNA 样品的重新处理等。

1.基因操作（Gene manipulation）的核心部分是基因克隆（gene cloning），gene cloning 的基本要点有克隆基因的类型，受体的选择和载体的选择。

2. 基因是遗传物质的基本单位,也是作为遗传物质的核酸分子上的一段片段。

它可以是连续的，也可以是连续；可以是dna，也可以是RNA；可以存在于染色体上，也可以存在于染色体之外3.基因操作并不是一个法律概念，除了包括基因克隆外，还包括基因的表达；调控；检测；改造等与基因研究相关的内容。

4.启动子（Promotor）是指（基因转录过程中控制起始的部位）。

通常一个Gene 是否表达，（转录起始）是关键的一步，是起决定作用的。

在转录过程中，Promoter还是（RNA 聚合酶）的结合位点。

5.原核生物的RNA polymerase 主要由两部分组成：（核心酶）和（σ因子），其中σ-因子并不参与RNA 的合成，它的作用主要是（识别要转录的起始位点）。

6.从（启动区）到（终止区）的这一段距离称为一个转录单位，或者一个转录产物，其中可包括一个或者多个Gene 。

7.转录终止子主要有两种，一种是（依赖ρ因子），另一种是（不依赖ρ因子）。

8.重叠基因（Overlapping gene）是指（一个基因的序列中，单个DNA 序列可编码一个以上的蛋白质），间隔基因（Interrupted gene）是指（在编码序列中间插入的一段无编码作用的碱基序列）1.基因操作（Gene manipulation）的核心部分是基因克隆（gene cloning），gene cloning 的基本要点有克隆基因的类型，受体的选择和载体的选择。

2. 基因是遗传物质的基本单位,也是作为遗传物质的核酸分子上的一段片段。

它可以是连续的，也可以是连续；可以是dna，也可以是RNA；可以存在于染色体上，也可以存在于染色体之外3.基因操作并不是一个法律概念，除了包括基因克隆外，还包括基因的表达；调控；检测；改造等与基因研究相关的内容。

1.1.1基因定点突变简介（INTRODUCTION）定点突变（site-directed mutagenesis）是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化，包括碱基的添加、删除、点突变（单点/多点）等。

定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。

原理上分两种：1. 搭桥法（重叠PCR）2. 一步法（全质粒PCR）►搭桥法（重叠PCR）定点突变搭桥法共需要两对引物（两端引物，中间引物）,三次PCR，其中前两次PCR可同时完成，原理如图一所示：两次PCR的产物回收，作为模板加上两端引物primer F和primer R 进行PCR3。

搭桥法定点突变PCR1：以primer F 和primer Rm 为引物对扩增PCR2：以primer R 和primer Fm 为引物对扩增实验步骤（PROCEDURE）1.两对引物的Tm值都应相当。

两端PCR引物参照普通引物设计并无特殊要求。

所需引入突变包含在中间引物互补区域内（需要在两条引物上均引入点突变），请勿将突变位点置于引物3’ 末端且突变位点距离3’ 端最少要有15个碱基，因为有非匹配碱基的存在，太短会导致引物与模板无法结合。

2.对于一对中间引物的设计，如左图所示（高亮处是突变碱基），两引物间可以是完全互补，也可是部分互补。

但两引物间互补部分的Tm值不能太低（太低导致PCR3无法配对延伸）。

5’-NNNNNNNNNNNNNNNANNNNNNNNNNNNNNNNN-3’3’-NNNNNNNNNNNNNNNTNNNNNNNNNNNNNNNNN-5’完全互补5’-NNNNNNANNNNNNNNNNNNNNNNN-3’3’-NNNNNNNNNNNNNNNTNNNNNNN-5’部分互补5’-NNNNNNANNNNNNNNNNNNNNNNN-3’3’-NNNNNNNNNNNNNNNT-5’部分互补一对中间位置的点突变引物设计3.PCR：PCR1：以primer F 和primer Rm 为引物对扩增；PCR2：以primer R 和primer Fm 为引物对扩增。

DNA 定点突变实验标签：DNA 定点突变DNA 定点突变可以：（1）研究蛋白质相互作用位点的结构、改造酶的不同活性或者动力学特性；（2）改造启动子或者DNA 作用元件；（3）提高蛋白的抗原性或者是稳定性、活性、研究蛋白的晶体结构，以及药物研发、基因治疗等等方面。

详细实验方法Dpn I 法定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR ）等方法向目的DNA 片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点突变等。

单点突变的原理是从常规E.coli 中经纯化试剂盒（Miniprep）或者氯化铯纯化抽提得到质粒。

设计一对包含突变位点的引物（正、反向），和模版质粒退火后用PfuTurbo 聚合酶“循环延伸”，（所谓的循环延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物5'端终止，再经过反复加热褪火延伸的循环，这个反应区别于滚环扩增，不会形成多个串联拷贝。

）正反向引物的延伸产物退火后配对成为带缺刻的开环质粒。

DpnI 酶切延伸产物，由于原来的模版质粒来源于常规大肠杆菌，是经dam 甲基化修饰的，对DpnI 敏感而被切碎（DpnI 识别序列为甲基化的GATC ，GATC 在几乎各种质粒中都会出现，而且不止一次），而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而实验方法原理不被切开，因此在随后的转化中得以成功转化，即可得到突变质粒的克隆。

多点突变的原理是准备多个带突变的引物（同方向，对同一单链模版），退火后全部突变引物（不超过5个）都结合在同一环状单链模版，PfuTurbo 聚合酶延伸，碰到下一个引物就停止，各片断经连接成环，和单链模版组成杂和环，Dpn I 消化双链模版，也消化杂和环中的模版，只留下新合成的带多个突变的单链环（mutant ssDNA ），得以转化E.coli ，形成双链质粒。

资料表明，引入3个定点突变的效率为60% ，5个定点突变的效率为30% 。

单碱基编辑技术和单碱基定点突变技术单碱基编辑技术和单碱基定点突变技术是基因编辑领域的两项重要技术，它们在基因组中精确地改变单个碱基的序列，从而实现对特定基因的精确修饰和功能调控。

本文将详细介绍这两项技术的原理、应用和展望。

一、单碱基编辑技术1.原理：单碱基编辑技术是指在基因组中直接改变单个碱基的序列，通常是通过导入CRISPR/Cas9或其他相似的核酸酶来实现。

这些核酸酶能够在基因组中识别特定的DNA序列，并引导核酸酶对目标碱基进行剪切和修饰。

随后，细胞会通过自身DNA修复机制完成目标碱基的修复，从而实现单碱基的编辑。

2.应用：单碱基编辑技术具有广泛的应用前景，特别是在疾病研究和基因治疗领域。

例如，单碱基编辑技术可用于纠正一些遗传病的突变，如囊性纤维化、血友病等。

此外，该技术还可用于改变基因的表达水平，探究功能未知的基因以及开发新的基因治疗策略。

3.展望：单碱基编辑技术在基因编辑领域具有巨大的潜力，但目前仍面临一些挑战。

首先，编辑效率和精确性需要进一步提升，以确保编辑结果的准确性和稳定性。

此外，对于一些细胞类型和组织，如多能干细胞和神经系统细胞，编辑效率仍然相对较低。

因此，未来需要开发更多针对不同细胞和组织的编辑工具和方法，以满足各种研究和应用需求。

二、单碱基定点突变技术1.原理：单碱基定点突变技术是指在基因组中精确地改变某个特定碱基的序列，而不影响其他碱基的特定位置。

该技术通常使用特异性的核酸酶或DNA聚合酶来引导目标碱基的改变。

其中，最常用的技术包括酵素替代、引入引物和正交DNA复制。

2.应用：单碱基定点突变技术在基因组编辑和分子生物学研究中得到广泛应用。

例如，该技术可用于研究特定碱基的功能和作用机制，以及构建特定突变的模型组织和动物。

此外，单碱基定点突变技术还可用于改变特定基因的表达和功能，从而探究复杂疾病的发病机制。

3.展望：单碱基定点突变技术的发展为基因组编辑和分子生物学研究提供了强有力的工具。

环状定点诱变技术在单碱基定点诱变中的应用[摘要] 目的采用环状定点诱变技术将重组真核表达质粒pcDNA3.1-hTSHR中hTSHR cDNA序列上发生突变的单碱基诱变回正常的序列。

方法设计1对含预期突变的完全互补的诱变引物,以环状质粒为模板进行PCR扩增,得到带缺口的突变质粒,酶消化去除模板质粒,将PCR产物转化DH5α感受态细胞进行缺口修复和克隆。

结果DNA测序表明,在预期位点已成功发生诱变,且目的基因其他部位的碱基序列均未发生随机突变。

结论环状定点诱变技术是一种高效、简便、快捷的诱变方法,通过该方法成功实现了目的碱基的定点诱变,为后续研究奠定了基础。

[关键词] 环状定点突变;聚合酶链反应;质粒;人促甲状腺激素受体采用体外细胞生物法来检测自身免疫性甲状腺疾病(autoimmune thyroid diseases,AITD)患者体内的促甲状腺激素受体抗体(TSH receptor antibodies,TRAb)时,需要应用表达人促甲状腺激素受体(human thyroid stimulating hormone receptor,hTSHR)的细胞株。

国内目前尚没有此类细胞株供应,鉴于此,本课题组尝试进行了这方面的研究,前期在构建pcDNA3.1-hTSHR重组真核表达质粒时,通过DNA测序发现目的基因hTSHR cDNA序列上第256位碱基发生了突变,因此本实验拟采用环状诱变PCR法对该碱基进行诱变,以期获得序列完全正确的重组真核表达质粒。

1 材料与方法1.1 材料Muta-directTM定点突变试剂盒购自北京赛百盛生物工程公司,DH5α感受态细胞、DNA分子质量标准及质粒抽提纯化试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司,pcDNA3.1-hTSHR(-256 C)重组真核表达载体为本课题组前期所构建,限制性内切酶KpnⅠ和XbaⅠ为日本TaKaRa公司产品,胰蛋白胨、酵母提取物为英国Oxoid公司产品,引物由上海生工生物工程技术有限公司合成,其余为国产分析纯。

CRISPR／Cas9：一种新型的基因组定点编辑技术摘要：CRISPR/Cas9系统是原核生物抵御病毒或质粒等外来遗传物质入侵的一种获得性免疫系统，主要由非特异性的Cas9核酸酶和起识别作用的crRNA所组成。

相较于传统的基因组编辑技术，基于CRISPR/Cas9系统的基因组定点编辑技术具有快速、简单、高效等优点，并且几乎可以用于任何物种的基因编辑。

尽管CRISPRJCas9系统的基因组特异性还有待进一步确认，但该系统在基因组编辑方面的简便性和有效性必将促进生物学的研究和人类疾病基因治疗方面的发展。

关键词：人工核酸内切酶：基因编辑：CRISPR/Cas9基因组定点编辑技术是研究基因功能的一种重要手段，同时也是许多基因相关疾病的潜在治疗方法。

早期主要依赖于基因同源重组及体细胞核移植技术来完成对特定基因的改造，然而自然情况下基因重组效率极低，且细胞核移植技术费时费力[1，2]，严重制约了基础研究和临床应用。

因此，在不断寻求高效、简便的基因编辑方法过程中，人工核酸内切酶（engineered endonuclease.EEN）介导的基因定点编辑技术快速发展成为一种主流方法。

人工核酸内切酶进行基因编辑的第一步是在修饰位点诱导产生DNA双链断裂缺口（doublestrand breaks，DSB）。

核酸酶诱导产生的DSBs可借助非同源末端连接（non homologous end-join-ing，NHEJ）机制或同源重组（homologous recombi-nation，HR）机制进行修复。

NHEJ将断裂的双链末端直接连接起来，可有效地引起基因的插入/缺失突变，即inclel突变，从而使基因的功能遭到破坏。

当引入模板DNA序列时，可通过同源重组修复（HR），插入或删除特定的基因序列。

通过人工核酸内切酶介导的DSBs，基因突变的几率大于1010，有时甚至超过50%[3] ，因此，人工核酸内切酶被称为“DNA剪刀”。

基因定点诱变的方法及原理基因定点诱变是指在特定位置引发基因突变的一种技术或方法。

通过基因定点诱变技术，可以精确地改变基因组中特定位置的碱基序列，从而研究或改变目标基因的功能。

目前常用的基因定点诱变方法主要有以下几种：1. CRISPR-Cas9系统：CRISPR-Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR associated protein 9）是一种基于RNA-DNA 相互识别的靶向基因编辑技术。

该系统利用Cas9蛋白通过结合到特定的DNA 序列来导向编辑目标位置，而CRISPR RNA（crRNA）和互补序列的转录过程产生了指导RNA（sgRNA）。

CRISPR-Cas9系统可以通过设计合成特定的sgRNA来诱导Cas9蛋白与目标基因的DNA序列结合，并在目标位点引入双链断裂，通过自然修复过程来实现基因突变。

2. TALEN系统：TALEN（Transcription activator-like effector nuclease）是一种由TAL（Transcription activator-like）蛋白和核酸酶融合而成的基因编辑工具。

TAL蛋白可通过识别和结合特定的DNA序列来实现靶向基因编辑。

TALEN 系统利用设计合成的TAL蛋白与核酸酶的融合体结合到目标基因的DNA序列上，并通过酶活性诱导DNA的双链断裂，从而引发基因突变。

3. ZFN系统：ZFN（Zinc finger nuclease）是由锌指蛋白（Zinc Finger Protein）与核酸酶（nuclease）融合而成的一种基因编辑工具。

锌指蛋白能够识别和结合到特定的DNA序列上，而核酸酶则通过识别锌指蛋白与DNA结合后的底物序列引发DNA的切割。

ZFN系统利用设计合成的锌指蛋白与核酸酶的融合体结合到目标基因的DNA序列上，从而在特定的位置诱导DNA的双链断裂，进而引发基因突变。

谈生物试题中的PCR衍生技术高考考查要点作者：***来源：《黑龙江教育·中学》2021年第10期摘要：PCR技术已被广泛应用于生物的很多领域，也是命制生物高考试题的重要素材来源。

本文从高中生物试题的角度，分析介绍PCR衍生技术的原理、步骤和应用，旨在引导广大教师和学生关心和关注日新月异的生物科技发展，提高学生的生物学核心素养。

关键词：PCR;引物;扩增;考查载体PCR是多聚酶链式反应（polymerase chain reaction）的缩写，该技术是由穆里斯（K.Mullis）等人于1988年发明的。

现已被广泛应用于法医鉴定、环境监测、分子克隆、基因序列分析、考古学等重要领域。

PCR技术促进了分子生物学、遗传学、生物化学等学科的发展，也是高考评价体系中考查载体的重要来源。

目前PCR的衍生技术种类繁多（见表1），本文针对常见的PCR技术在命制高中生物试题中的应用进行了整理和分析。

例1 新冠疫情的快速控制，离不开政府的科学决策和我国对新冠病毒（RNA病毒）的快速检测能力。

荧光定量PCR技术可定量检测样本中DNA含量，其原理是：在PCR反应体系中加入引物的同时，加入与某条模板链互补的荧光探针，当TaqDNA聚合酶催化子链延伸至探针处会水解探针，使荧光监测系统接受到荧光信号，即每扩增一次，就有一个荧光分子生成（如图1）。

随着PCR的进行，荧光信号的强度也等比例增加，可通过荧光强度的变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图（如图2）。

Ct值（循环阈值）的含义为：每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。

下列说法不正确的是（C）A.检测新冠病毒时，需加入逆转录酶将新冠病毒RNA转化为cDNAB.PCR的每个循环包括变性、复性和延伸3个阶段C.Ct值越大表示被检测样本中病毒数目越多，患者危险性越高D.图2出现平台期的最可能原因是反应体系中的引物、探针数量一定1.逆转录PCR技术（RT-PCR）新冠病毒属于RNA病毒，在例1的检测中涉及到逆转录PCR技术。

陈颉摘要在以科研实际应用为背景的高考命题中，PCR 技术相关知识点的考查也层出不穷。

PCR 技术的操作与应用是学生普遍反映的基因工程考题的难点之一。

高三一轮复习具有承上启下的特点。

在高三一轮复习中，针对PCR 技术，教师可通过微视频讲解、数形结合、节选例题、引导学生小组讨论等手段，夯实基本概念，探讨条件优化，拓展应用类型，层层递进，突破教学重难点。

关键词高中生物一轮复习PCR聚焦“PCR 技术技术””突破一轮复习重难点作者简介：陈颉（1981—），男，江苏南通人，江苏省南通中学一级教师，硕士，研究方向：高中生物教学。

基金项目：本文系第二届江苏省教育考试招生研究课题“基于生物学核心素养的高考命题创新研究”（课题编号：K-e/2018/07）的阶段性研究成果。

自20世纪80年代多聚酶链式反应（PCR ）与热稳定型DNA 聚合酶（Taq 酶）被发现以来，DNA 扩增技术有了突破性的进展，PCR 技术在现代基因工程操作中的应用也越来越广。

在以科研实际应用为背景的高考命题中，PCR 技术相关知识点的考查也层出不穷。

学生普遍反映基因工程考题的难点之一为PCR 技术的操作与应用。

因此，笔者在一轮复习中就如何突破PCR 技术的教学重难点作了以下的尝试。

一、PCR 技术的知识点架构高三一轮复习具有承上启下的特点。

在复习中教师既要帮助学生对所学知识进行提炼，又要注重学生在学科核心素养方面的提升。

基于维果斯基的最近发展区理论，笔者把高中生物有可能涉及的PCR 技术知识点做了如图1所示的架构设计。

在这个知识点架构中，“基本概念”和“条件优化”两部分间是递进关系，都是重要的基础性知识。

只有深刻理解和掌握这两部分内容，才能完成“应用类型”这一学生难于理解和运用部分的学习。

而“应用类型”的知识点之间也是递进关系。

笔者通过适当选取与之相关的高考试题，依据这种递进关系把一道试题拆解成梯度难度的多个问题，帮助学生突破这一难点。

图1PCR 技术知识点架构二、PCR技术重难点的突破在突破PCR技术重难点的教学实践中，笔者是通过适当采用微视频讲解、数形结合、节选例题、引导学生小组讨论等教学手段来达成的。

植保所研发出水稻靶标基因单碱基定向替换技术
近日，中国农业科学院植物保护研究所植物基因组定点编辑研究组成功地在水稻中开发出靶标基因单碱基定向替换技术。

该技术与传统CRISPR技术实现的基因敲除技术不同，可成功创制了水稻靶标基因的功能获得性突变体，因此对植物功能基因组学和现代分子育种研究具有重大推进作用。

相关研究成果于2016年12月26日在线发表在《中国科学生命科学版（Science China Life Sciences）》杂志上。

据悉，该所植物基因组定点编辑研究组与四川大学林宏辉教授实验室合作，利用人工密码子优化的CRISPR/Cas9切口酶基因，与大鼠APOREC1基因和来源于Bacillus subtilis噬菌体PBS1的尿嘧啶糖基化酶UGI基因进行融合，构建了一套gateway植物表达载体rBE3，对水稻基本性抗性途径中的两个关键基因OsSERK1和OsSERK2，以及水稻理想株型IPA1基因实现了靶位点碱基的特异替换，成功获得了预期有重要价值的水稻突变体种质。

为了进一步扩展此技术在水稻中的应用，该团队发展了Cas9（VQR）版本的rBE4载体，并成功地在水稻中对隐性抗稻瘟病基因pi-ta中对关键氨基酸进行了人工改造。

该系统在水稻中的成功利用，对水稻基因剪接，小RNA靶标基因，激酶，泛素连接酶等酶类基因研究具有巨大推动作用。

另外，通过此技术对农作物进行缺陷型基因矫正，可大大加快农作物育种过程以及延长现有品种的商业周转期。

植保所客座博士研究生任斌和博士后严芳为本文共同第一作者，周焕斌研究员和林宏辉教授为本文的共同通讯作者。

本研究得到了中国农科院创新工程和植物病虫害国家重点实验室开放基金资助。

论文链接：。