第六章胚胎培养 一、胚胎培养的意义 1.概念 胚胎培养指胚及其胚器官（如子房、胚珠）在离体无菌培养条件下，使胚发育成幼苗的技术2.分类 广义: 离体胚培养、胚乳培养、胚珠培养、子房培养、试管受精、胚轴、胚芽等 狭义：离体胚培养（成熟胚培养、幼胚培养） 3.意义 可克服一些早熟品种胚早期败育现象，从而缩短育种周期，增加种子发芽度 可克服远缘杂种的不育性 利用胚乳培养可获得无籽的三倍体果实 可用于研究与胚发育有关的内外因素以及有关的代谢和生理生化变化 4.发展简史 1904年，Hanning培养萝卜、辣根的胚，提前萌发成苗，成为世界上胚胎培养最早成功的一例 30年代，Tudey培养多种果树胚胎获得成功 1942年，Dietrich对十字花科、豆科、菊科、葫芦科和禾本科的多种植物离体胚培养进行研究 二、离体胚培养 （一）成熟胚培养 指子叶期后至发育完全的胚的离体培养 易成功，在含有大量无机无素和蔗糖的培养基上培养即可萌发 培养目的 研究发育过程的形态建成、激素的作用、营养要求等生理问题 培养方法 消毒（种子70%酒精5-30`表面消毒---饱和漂液或0.1%升汞10-30 min----无菌水冲冼3-4次）——取胚（无菌解剖,直接取胚）——培养（置于培养基上培养----萌发成苗） （二）幼胚培养 1.概念 指子叶期以前的具有胚结构的幼小胚培养 2.培养方法 包括消毒(子房)、取胚、接种。需在高倍解剖镜下取胚，操作要细心 3.胚发育方式 a.胚胎发育：即按胚胎的正常发育途径生长发育最后成苗，是最理想的发育方式 b.胚性发育：培养的幼胚可增大，但不能萌发成苗，只呈现胚性生长 克服方法 1.提高渗透压 2.改变激素的种类或浓度 3.加入天然复合物 4.改善培养条件(pH、温度、光） c.早熟萌发：指离体培养的幼胚越过正常胚胎发育阶段,在未达到生理和形态成熟的情况下,萌发长成幼苗。形成畸形、弱苗或死亡. 克服途径:提高培养基渗透压(蔗糖、无机盐、甘露醇) 胚龄越小要求的渗透压（糖浓度）越高。
胚胎培养液 胚胎培养液的主要成分包括：水、离子、能量物质、氨基酸、维生素、核酸前体、蛋白质、生长因子激素、缓冲系统及气体，都有商品化现成的培养液可供购买。 水是组成任何培养液的主要成分，在IVF实验室，一般使用Milipore-Q系统产生无致热原的高质量的水( Mii-o)准备培养液及洗涤所有玻璃制品及设备。目前我们对离子在种植前的作用了解很少，因为在培养液中有许多复杂的相互作用，很难了解一种离子的单独作用。哺乳动物的输卵管液的特征是高钾和高氯化物浓度。Roblero等报告高钾有利于精子获能和胚胎发育，培养液中离子的最大作用是控制培养液的渗透压，而渗透压对于人的胚胎发育是很重要的。 种植前胚胎的营养物质包括丙酮酸、乳酸和葡萄糖，胚胎从2细胞发育至囊胚期的各个阶段所需要的各种营养物质的浓度是不同的。氨基酸在种植前和种植期间对于哺乳动物的发育有生理作用，Hardy和Gardner等观察到在培养液中加入氨基酸可加速小鼠和金黄地鼠胚胎的发育。人IVF中最常用的蛋白质的来源是血清，一般浓度为5%～10%。蛋白质在胚胎培养液中的作用不仅仅是固定的氮的来源，并可作为有害金属离子的整合物。但Caro等发现人胚胎在含有或不含有母亲血清的T6培养液中培养，其受精率、胚胎分裂率和妊娠率无明显差异。 大多数胚胎培养液利用碳酸氢盐／二氧化碳作为缓冲系统以维持培养液的生理pH值为7.2—7.4，这是哺乳动物细胞周围液体的生理性缓冲液。其缺点是若培养液暴露在空气中时间过长，pH值迅速增加可引起胚胎损伤或坏死。在培养液上覆盖一层油可减慢培养液中的气体交换。磷酸盐( HERPES)作为缓冲系统可不需要二氧化碳内环境维持其在空气中的pH 值。胚胎培养液中的两种气体是氧和二氧化碳，二氧化碳不仅维持碳酸氢盐缓冲液的pH值，还可使种植前各个阶段的小鼠胚胎与蛋白质和核酸结合。大多数IVF中心应用5%的二氧化碳。许多作者证明，在培养液中将氧的水平减低至5%～7%时，与空气中20%的氧相比对胚胎发育更有利。
囊胚培养 北京协和医院妇产科生殖中心 孙正怡 前言 世界首例试管婴儿成功妊娠的患者，移植的胚胎就是囊胚期胚胎。但是多年来IVF实践中，大多数医生仍然选择在卵裂期进行移植。这么做的主要原因是无法确保将胚胎进行培养后能否形成囊胚。上世纪九十年代后，通过动物胚胎的研究，人们对胚胎的营养需求有了更深刻的理解，建立了序贯培养的概念，从而使得囊胚形成率有了大幅度改善，接受IVF治疗的患者更易于从囊胚培养中获益。 囊胚培养的目的 囊胚培养的最主要目的是改善IVF治疗的妊娠率IVF。囊胚培养具有筛选胚胎的作用。经过较长时间的培养后，形成囊胚的胚胎，非整倍体比例明显低于第三天胚胎。另外由于胚胎与子宫内膜的同步性更好，也有利于提高妊娠率。对于一名妇女经过IVF治疗得到的一批胚胎，进行囊胚培养可以筛选出发育潜能最好的一部分胚胎，从而使妊娠率保持一定水平的基础上，减少移植和冷冻胚胎的数量，减少多胎的发生，并降低治疗费用。 囊胚培养的优势与风险 优势 囊胚的种植率高于卵裂期胚胎，从而可以减少移植胚胎数量，移植时内膜与胚胎发育更为同步，Papanikolaou 等发现HCG日P值升高对第三天的植入率有不良影响，而到了第5天，影响明显减小。第三天极度黄素化的内膜状态会影响卵裂期胚胎发育到囊胚。而囊胚受这种影响则较小。子宫腔内pH值较输卵管内低。早期胚胎对酸度的适应能力较差，而囊胚对酸度的适应功能较好。因此在囊胚期时移植，胚胎的存活率较高。染色体异常比例下降。Day3的“优质胚胎”，有60％左右发育为囊胚，40％不能发育为囊胚，卵裂期的优质胚胎，有60％可能为非整倍体，而发育到囊胚的胚胎，非整倍体率降为30％左右。进行囊胚培养由于培养时间延长，利于PGD的进行，尤其是结合使用array CGH等较为先进的诊断技术，可以大大提高胚胎的种植率。 风险 取消移植：由于至今仍缺乏有效的指标判断卵裂期胚胎发育成囊胚的能力，所以，即使卵裂
动物细胞培养时对培养基的要求： 培养基按其来源可分为天然培养基和合成培养基。天然培养基的营养成分与细胞在体内所需条件比较接近，但就细胞在体外生存的环境来说，合成培养液也有其独特之处，譬如成分便于控制和标准化。体外培养的细胞直接生活于培养基中，无论何种培养基都应该能满足细胞生长所需的营养与生理的基本要求。 (1)营养成分： 1）氨基酸合成培养液中的氨基酸以12种必需氨基酸为主，这些氨基酸不能由细胞自身合成，必需由培养液供给。在氨基酸的成分中谷氨酰胺的作用特别重要，细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，在配制各种培养液中应补加一定量的谷氨酰胺。 2）单糖葡萄糖是最常用和最好的单糖 3）维生素维生素在细胞代谢过程中必不可少，主要可以提供辅酶和辅基。生物素、叶酸、泛酸、核黄素、维生素B12等等 4）其他成分：细胞生长过程中除需钠、钾、钙、镁、氮和磷等基本元素外，还需要一些微量元素，如铁、锌、硒、铜、锰、钼等。此外，为优化细胞生存环境，合成培养基中有时还添加些其他成分，包括核酸降解物、抗氧化剂等。 （2）促生长因子及激素 各种激素、生长因子对于促进细胞生长、维持细胞功能、保持细胞的状态具有十分重要的作用。如胰岛素能促进细胞利用葡萄糖和氨基酸，泌乳素可促进乳腺上皮细胞生长的作用。各种生长调节因子的作用更加明显并具有特异性。 （3）pH 大多数细胞的适宜pH为7.2-7.4，偏离此范围对细胞将产生有害影响。造成培养基pH 波动的主要物质是细胞代谢产生的二氧化碳。解决这一问题可采取两种方法：一是用具有一定缓冲能力的培养基，如使用NaHCO3-CO2缓冲系统，二是采用开放式培养的方法，使细胞代谢产生的二氧化碳及时逸出培养皿。 （4）渗透压 细胞必须生活在等渗的环境中，大多数培养细胞对渗透压有一定的耐受性。 注：天然培养基主要指来自动物体液或利用组织分离提取的一类培养基，如血浆、血清、淋巴液、鸡胚浸出液等。 合成培养基是人工配制的培养基，给细胞提供一个近似体内生存的环境，又便于控制和标准化的体外生存环境，但合成培养基尚未成为十分完全的培养基。只能维持细胞不死，不能促进细胞增殖生长，使用时还需要添加一定比例的天然培养基（如小牛血清） 早期胚胎的体外培养 体外受精的早期胚胎在体外发育的中，往往会停止在某一阶段不再发育，这种现象称为：发育阻滞。此外体外培养环境下不能及时清除有害物质（如细胞内H2O2），不断积累也会造成细胞中毒，使胚胎阻滞。 发育阻滞是体外培养中的一个主要障碍，通过改进培养液成分和建立体细胞共同培养体系，在不少动物中已克服，使胚胎顺利发育到囊胚阶段。 1.培养条件： （1）能量底物 胚胎培养液一般不含葡糖糖，代之以乳酸和丙酮酸为能量供应物。研究表明早期胚胎对葡萄糖的利用是有限的，而主要以乳酸和丙酮酸为能量代谢的底物，所以，培养液中低剂量葡萄糖的添加是必需的。
第4章《胚胎培养》复习题参考答案 一、填空： 1、胚胎培养包括幼胚培养、成熟胚培养、胚乳培养、胚珠培养以及子房培养。 2、离体胚的培养分为二种类型：成熟胚培养和幼胚培养。 3、幼胚培养时，其发育过程有三种方式：胚性发育、早熟萌发、产生愈伤组织。 4、由胚乳培养得到的植株，除少数是三倍体外，多数是由各种倍性细胞组成的嵌合体。 5、胚珠培养分二类：受精胚乳的培养和未受精胚珠的培养。受精胚珠培养的目的：一是用来打破种 子的休眠，二是挽救胚的发育，以获得杂交种。未受精胚珠培养的目的是获得单倍体植株。 6、子房培养分授粉子房培养和未授粉子房的培养。前者培养的目的是挽救杂种胚，后者培养的目的是 获得单倍体植株。 二、名词解释： 1、胚胎培养（embryo culture）：是指将植物的胚胎与母体分离，培养在人工的培养基上形成幼苗的过程， 包括幼胚培养、成熟胚培养、胚乳培养、胚珠培养以及子房培养。 2、胚性发育(embryonal development)：植物幼胚接种到培养基上以后，仍然按照在活体内的发育方式发育，最后形成成熟胚(有时甚至可能类似种子)，然后再按种子萌发途径出苗形成完整植株，这种途径发育的幼胚一般一个幼胚将来就是一个植株。 3、早熟萌发(early mature sprouting): 幼胚接种后，离体胚不继续胚性生长，而是在培养基上迅速萌发成幼苗，通常称之为早熟萌发。 4、胚培养（embryo culture）：是指将胚从种子、子房或胚珠中分离出来，在进行组织培养，使其生长发育形成幼苗的过程。 5、胚乳培养（endosperm culture）：是指将胚乳从母体上分离出来，放在无菌的人工环境条件下，让其进一步生长发育，以至形成幼苗的过程。 6、胚珠培养（ovule culture）：是指将胚珠从母体上分离出来，在无菌的人工环境条件下培养，使其生长发育形成幼苗的过程。 7、子房培养（ovary culture）：是指将子房从母体上分离出来，在无菌的人工环境条件下培养，使其生长发育形成幼苗的过程。 三、问答题： 1、胚培养的作用有哪些？ 1)在远缘杂交育种中的应用:克服杂种胚不能正常发育 2)克服珠心胚的干扰,提高育种效率 3)缩短育种周期 4)测定休眠种子的萌发率 5)理论研究中的应用 2、胚乳培养的作用有哪些？ 1）通过胚乳培养可得到三倍体植株，产生无籽果实。或加倍形成六倍体植株进行育种。 2）胚乳培养可得到倍性不同的愈伤组织，可分离和筛选各种类型的非整倍体植株。 3、如何检查胚乳植株的染色体数目？ 取植株根尖或幼叶或胚乳愈伤组织,用0.2%-0.5%的秋水仙素碱溶液或对二氯苯饱和水溶液在25℃下浸泡处理4-8h后,再用流水冲洗5-10min.以卡诺氏溶液或FAA液固定.用1mol的盐酸,在60℃水浴下水解8-10min.然后染色,压片,镜检和计数. 4、分析胚珠培养和子房培养的发育途径 胚珠发育：A 受精胚珠：一是形成种子；二是形成愈伤组织 B 未受精胚珠：形成单倍体植株。
美国试管婴儿优质囊胚的四大评判标准 美国试管婴儿技术的飞速发展，渐渐地为辅助生殖技术和人类基因序列搭建起了桥梁，并且一系列相关的辅助生殖技术，如精原细胞体外培育、培养液、囊胚培养及囊胚移植等技术的改进，使得试管婴儿成功率得到空前地提升。尤其是囊胚培养技术+PGS/PGD基因筛查技术的临床应用，有效避免了遗传疾病和染色体异常对胎儿的影响，更大程度地保障宝宝出生后的健康。 众所周知，美国试管婴儿成功率是全世界最高的，探究背后的奥秘，囊胚可谓是最大的功臣。美国梦美HRC专家说，囊胚的质量是试管婴儿能否成功的关键。临床统计，美国梦美HRC已帮助数万个家庭实现生育梦想，之所以有如此惊人的成果，主要是因为美国梦美HRC生殖医疗集团把“确保囊胚质量”作为工作的重心，挑选优质囊胚进行移植。 那么，怎样的囊胚才是优质囊胚呢？优质囊胚的评判标准又有哪些？下面让我们一起来解读。 标准一：囊胚培育的原材料—精卵质量 健康的生命源于健康的精子和卵子，精卵结合后也就代表了生命的开始，所以健康的精子和优质的卵子是保障试管助孕周期能否成功的先决条件。如果精子和卵子质量出现问题，就不能形成优质健康的囊胚，即便女性的子宫内环境、身体内分泌都非常好，此次试管婴儿治疗周期成功的几率也非常渺茫。 标准二：囊胚培育的环境—培养液 只有顶尖的技术和实验室水平才能把受精卵培育成优质健康的囊胚，美国梦美HRC专家介绍说，囊胚培育的关键是把培养液的成分控制在更加接近人体子宫内环境的状态，包括培养皿的温度、二氧化碳、氧气浓度等，尤其是囊胚培养的第四天开始（8个细胞左右），胚胎细胞会开始急速的分裂，直到第五天就会形成一百多个细胞，若期间培养液达不到要求或是有任何一个环节出现了偏差，就会造成囊胚培育的失败，从而导致试管周期的失败。所以患者在选择医院的时候一定要慎重，否则不仅浪费金钱、时间，还可能给自己的身体带来巨大伤害。 标准三：囊胚培育的等级—5AA级 美国梦美HRC上万例数据证明：通过基因筛查的5AA级囊胚是最为优质的，其接近子宫内环境的状态，更能适应子宫内的环境，着床能力也最强，且继承了父母最优秀的基因，无论是宝宝未来的发育，还是智商情商方面都是非常优秀的。（注：5AA级为囊胚发育到第5期全部从透明带中逸出的囊胚，内围细胞和外围细胞均为A级，细胞数目多，结构致密，排列紧密） 标准四：囊胚培育的技术—PGS/PGD
囊胚培养及移植在体外受精周期中的应用 杨世俊 【期刊名称】《中外医疗》 【年(卷),期】2016(035)001 【摘要】目的探讨囊胚培养及移植在体外受精周期中的应用. 方法整群选取2012年1月—2014年12月期间来该院接受体外受精-胚胎移植的64例患者作为该次研究对象,按照选择胚胎培养及移植时期的不同将64例体外受精-胚胎移植患者分成研究组和对照组,研究组为选择囊胚期胚胎培养及移植的患者,共33例,对照组为选择卵裂期胚胎培养及移植的患者,共31例. 受精成功后采用G1进行早期胚胎培养,采用G2进行囊胚培养. 结果两组患者中各有1例消移植周期病例, 实际移植周期数分别为32个和30个, 研究组患者的胚胎植入率为37.1%, 妊娠率为53.1%,与对照组患者的19.4%和33.3%比较,差异有统计学意义(P<0.05).两组患者的流产率和异位妊娠率比较差异无统计学意义(P>0.05),但对照组患者的多胎率明显高于研究组患者(P<0.05). 结论选择囊胚期胚胎培养及移植可有效提高胚胎植入率和妊娠率,降低不良妊娠结局发生率和移植周期取消率.%Objective To study the application of culture and transplanting in blastocyst stage in the in vitro fertilization cycle. Methods 64 cases of patients receiving in vitro fertilization-embryo transfer in our hospital from January 2012 to December 2014 were selected as the research object and divided into research group (33 cases) and control group (31 cases) according to the different embryo culture and transplanting stages, patients with embryo culture and transplanting in blasto-cyst
移植冷冻后剩余可利用胚胎继续囊胚培养的潜在价值分析 发表时间：2017-10-24T14:45:33.210Z 来源：《医药前沿》2017年10月第28期作者：徐娇燕 [导读] 在常规IVF/ICSI－ET工作中通常根据D3胚胎形态学分级结合原核评分来选择移植和冷冻胚胎。 （佛山市妇幼保健院生殖中心广东佛山 528000） 【摘要】目的：观察IVF/ICSI-ET治疗周期中第三天（D3）移植冷冻后剩余可利用胚胎继续体外培养的囊胚形成情况及意义。方法：将D3移植冷冻后剩余的可利用胚胎通过序贯培养至囊胚阶段,将可利用囊胚进行冷冻，在未妊娠患者下一周期将其解冻移植,比较同时期通过冷冻解冻D3移植后的胚胎的植入率、妊娠率、多胎率和流产率。结果：402例不孕症患者D3移植冷冻后剩余的胚胎2807枚形成囊胚2001枚,可利用囊胚1074枚,将可利用囊胚冷冻；其中43例未妊娠患者的65枚囊胚在下一周期解冻后移植,其植入率47.0%极显著高于878例患者 的1814枚卵裂期胚胎解冻后移植的植入率21.3%；而妊振率65.1%显著高于解冻后卵裂期胚胎的妊振率37.9%；多胎率和流产率无性显著差异。结论：囊胚体外培养可以筛选出具有发育潜能的剩余胚胎提高可利用胚胎数和临床妊娠率。 【关键词】剩余胚胎；胚胎培养；囊胚；序贯培养 【中图分类号】R714.8 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2017）28-0099-01 在常规IVF/ICSI－ET工作中通常根据D3胚胎形态学分级结合原核评分来选择移植和冷冻胚胎，剩余的低形态学评分胚胎通常被丢弃。但是这些胚胎是否还具有发育潜能其发育潜能与哪些因素有关尚很少有相关报道。仅根据形态学标准来衡量胚胎的发育潜能和种植潜力还无法做到足够科学和准确。本中心将IVF/ICSI-ET中移植及冷冻后剩余的D3胚胎继续培养2～3天以评估胚胎继续发育的潜能。与常规D3冻融胚胎移植进行比对探讨剩余质量较差胚胎是否有继续培养利用的价值。 1.材料与方法 1.1 研究对象及分组 收集2015年在本中心接受IVF/ICSI-ET治疗的402例患者移植冷冻后剩余的2807枚可利用胚胎同时收集同一时期的D3冻融胚胎移植的患者作为比较。以上述402例患者D3移植失败后在下一周期解冻囊胚移植43例患者为实验组，以同时期通过解冻D3移植的878例患者为对照组就胚胎植入率、妊娠率、多胎率和流产率进行比较分析。 1.2 实验方法 常规超促排卵方案：促排卵方案常规使用GnRH/FSH/hCG方案，待卵泡发育成熟后行阴道B超引导下穿刺取卵术。胚胎培养及评估：胚胎培养采用美国Vitrolife系列序贯培养基培养。按Peter[2]卵裂期胚胎评分系统进行评级，严格按照Gardner标准进行囊胚评级。胚胎冷冻及解冻：试剂采用丹麦Origio冷冻及解冻液，严格按照说明书进行操作。 1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。组间比较采用卡方检验，P<0.05为差异有统计学意义，<0.01为差异有极显著统计学意义。 2.结果 在402个IVF/ICSI-ET治疗周期中将D3胚胎进行移植和优质胚胎进行冷冻后，将所剩余可利用胚胎2807枚进行体外囊胚培养，形成囊胚2001枚，其中可利用囊胚1074枚，囊胚形成率和可利用囊胚率为56.2%和38.3%。在402例患者中有43个周期进行冷冻解冻囊胚移植，解冻囊胚68枚，存活66枚，囊胚存活率为97.1%。同一时期卵裂期胚胎冷冻解冻移植周期数为878，解冻胚胎1814个，存活1756个，胚胎解冻存活率为96.8%，两者差异无统计学意义(P>0.05)。而D3胚胎和囊胚的植人率为21.3%和47.0%，具有非常显著的统计学意义(P<0.01)，临床妊娠率为37.9%和65.1%两者具有非常显著的统计学意义(P<0.01)，D3胚胎和囊胚的多胎率为24.6%和14.3%无统计学意义(P>0.05)，D3胚胎和囊胚的流产率为5.7%和3.6%两者差异无统计学意义(P>0.05)，结果详见表1。 3.讨论 评估胚胎是否具有高着床潜能是现代辅助生殖技术的重点，目前用于评估胚胎质量的主要参数为原核期评分和D3的形态及发育速度，因此一般在受精后第3天对其分级处理，并移植1～3个优质胚胎剩余评分较高的胚胎进行冷冻保存，剩余的胚胎遗弃处理。但是大量研究[1]证明胚胎的形态学评分不能正确反应胚胎的发育潜能并且主观性很大。我们研究发现虽然D3的剩余胚胎评分低，还是有一些能形成可利用囊胚且解冻后其植人率和妊娠率为47.0%和65.1%，这充分说明形态并不能完全代表其生命力和质量，胚胎在发育过程中是不断进行自身修复的，并且通过继续囊胚培养可以淘汰劣质的胚胎最终获得妊娠[2]。 【参考文献】 [1]田莉峰，黄志辉，丁涛，等.采用玻璃化冻融囊胚技术临床妊娠7例报道[J].江西医药，2011，46(9)：845-847.