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胚胎培养一、胚胎培养的概念1.胚胎：植物在受精后，受精卵形成合子，随即进行第一次分裂，进而形成分生组织和幼胚，再发育成成熟胚。
2.胚胎培养：胚胎培养是植物组织培养的一个主要领域。
植物胚胎培养是指对植物的胚（种胚）及胚器官（如子房，胚珠）进行人工离体无菌培养，使其发育成幼苗的技术。
二、胚胎培养的种类以及方法1.胚培养⑴幼胚培养①定义：将子叶期以前的具胚结构的幼小胚从母体上分离出来，放在无菌的人工环境条件下使其进一步生长发育形成幼苗的技术。
②特点：幼胚培养完全是异养的，离体条件下培养要求培养基成分复杂，培养不易成功。
附：以下几种发育方式：a、胚性发育，此种方式不能萌发成苗b、早熟萌发，长成的苗十分瘦弱c、产生愈伤组织，再由愈伤组织分化形成胚或不定芽⑵成熟胚培养①特点：成熟胚培养是自养的，培养基需要简单。
②主要目的：a、研究胚发育过程的形态建成b、生长调节物质的作用c、胚与胚乳相互关系和营养要求③培养方法：将受精后成熟或未成熟种子或果实，用70%-75%酒精表面消毒几分钟；用0.1%升汞溶液或饱和漂白粉溶液消毒10min，无菌水反复冲洗；无菌操作台上，直接或在解剖镜下剥取胚接种在培养基上。
2、胚乳培养⑴定义：指将胚乳组织从母体上分离出来，通过离体培养，使其发育成完整植株的技术。
⑵胚乳是由两个单倍的极核和一个单倍的精子结合而成的3倍体组织。
由它可获得无子结实的3倍体植株，进而可将它加倍成6倍体植株。
不同胚乳发育类型及发育时期直接影响外植体取材时期以及胚乳细胞产生愈伤组织频率。
胚乳培养的后代，常发生细胞染色体数目变化，形成多倍体、非整倍体等。
⑶培养的方法：取授粉4-8d后的幼果，常规消毒；无菌条件下切开果实，取出种子，分离出胚乳；接种在培养基上（MS、White等培养基，附加2，4-D或NAA 0.5～2.0，BA0.1～1.0。
），在25-270C和黑暗条件或散光下培养想成愈伤组织；转到分化培养基（MS培养基附加0.5～3.0 mg/l的BA及少量的NAA。
胚培养技术1. 胚培养技术的概述胚培养技术是一种利用体外培养环境来支持和促进胚胎发育的技术。
通过控制培养条件，可以模拟体内的环境，并为胚胎提供所需的营养和生长条件，以促进其正常发育。
胚培养技术可以应用于多个领域，包括生殖医学、动物繁殖和植物育种等。
2. 胚胎的发育过程在理解胚培养技术之前，首先需要了解胚胎的发育过程。
胚胎的发育可以分为以下几个阶段：•受精：在受精过程中，精子和卵子融合形成受精卵。
•分裂：受精卵开始不断分裂，形成多个细胞。
•悬浮：细胞继续分裂并逐渐形成一个团簇。
•分化：团簇内的细胞开始分化为不同的细胞类型，最终形成胚胎。
•培养：培养胚胎提供所需的营养和生长条件，促进其正常发育。
3. 胚培养技术的应用3.1 生殖医学胚培养技术在生殖医学中扮演着重要的角色。
通过体外受精（IVF）和胚胎植入（ET）等技术，可以帮助那些无法自然受孕的夫妇实现生育愿望。
IVF是最常用的生殖医学技术之一，其过程包括将卵子和精子体外结合，形成受精卵。
受精卵随后被转移到培养皿中，通过胚培养技术提供所需的环境来促使其继续发育。
在适当的时机，医生将胚胎植入到女性子宫内，希望实现着床和宫内妊娠。
3.2 动物繁殖胚培养技术也在动物繁殖领域得到广泛应用。
通过胚胎的体外培养，可以更好地控制繁殖过程，提高繁殖效率，增强种畜的遗传品质。
胚培养技术可以用于动物的克隆、胚胎移植和生殖组织的保存等方面。
3.3 植物育种在植物育种中，胚培养技术也具有重要的意义。
通过体外培养胚胎，可以加快植物的繁殖速度和育种进程，产生更多的优良品种。
胚培养技术可以应用于植物的遗传改良、种子繁殖和病毒病防治等方面。
4. 胚培养技术的关键因素胚培养技术的成功与否取决于多个关键因素，包括培养基组成、温度、湿度、pH值和培养时间等。
培养基是支持胚胎生长和发育所需的培养介质，它通常包含多种有机物质和无机盐，以满足胚胎的营养需求。
培养基的组成需要根据不同物种和发育阶段进行调整。
胚胎培养的操作步骤一、获取胚胎在胚胎培养过程中，首先需要获取胚胎。
这一步骤通常在试管婴儿程序中进行，通过超排卵和人工受精等方法获取胚胎。
二、胚胎质量检查在获取胚胎后，需要对胚胎进行质量检查。
通过显微镜观察胚胎的形态和发育情况，评估胚胎的等级和发育潜力。
这一步骤有助于选择优质的胚胎进行培养。
三、胚胎培养液准备为了提供胚胎生长所需的营养物质，需要准备适当的胚胎培养液。
根据胚胎的发育阶段和实验需求，可以选择不同的培养液配方。
确保培养液的清洁度和适宜的温度，以维持胚胎的正常生长。
四、胚胎移植将经过质量检查的胚胎转移到准备好的培养液中，进行进一步的体外培养。
在这一步骤中，要确保胚胎在适宜的环境中顺利生长。
五、培养环境控制胚胎培养的环境对胚胎的生长至关重要。
控制培养室的温度、湿度、气体浓度等参数，确保环境条件适宜胚胎发育。
定期监测和记录环境数据，确保胚胎生长环境的稳定性。
六、观察胚胎发育在胚胎培养过程中，需要定期观察胚胎的发育情况。
通过显微镜观察胚胎形态变化，记录胚胎生长数据，评估胚胎的健康状况。
及时发现和处理异常情况，确保胚胎正常生长。
七、胚胎移植回体当胚胎发育到一定阶段时，需要将胚胎移植回母体或代孕母亲体内。
这一步骤需要根据程序指南和伦理要求进行。
确保移植过程中的安全性和有效性，关注移植后的护理和监测工作。
八、后续护理在胚胎移植后，对母体或代孕母亲进行适当的护理和监测。
这包括提供必要的医疗支持和心理辅导，以及定期进行产前检查。
密切关注母体和胎儿的健康状况，确保妊娠过程的顺利发展。
胚胎培养的技巧胚胎培养是一种重要的实验技术，用于研究和应用胚胎发育的机理及其相关问题。
正确的胚胎培养技巧是保证胚胎发育正常的基础，下文将详细介绍胚胎培养的技巧。
首先，胚胎培养要使用高质量的培养基。
胚胎培养基是一种特殊的液体，里面含有胚胎发育所需的营养物质和生长因子。
常用的胚胎培养基有经典的全面培养基（例如M16或KSOM）和改进的有血清/无血清培养基（例如G1.2或KSOM-AA）。
这些培养基都需要严格的无菌操作来避免细菌、真菌和其它污染物的污染。
其次，胚胎的离体培养环境也是非常关键的。
培养箱是胚胎离体培养的重要设备，能够提供适宜的温度、湿度和气体环境。
一般来说，胚胎的培养温度为37，湿度为95%以上，培养箱内的气氛成分为5% CO2、5% O2和90% N2。
胚胎在这样的环境下能够更好地存活和发育。
另外，胚胎的操作应该尽量轻柔，以避免损伤胚胎。
在进行胚胎培养的过程中，需要使用显微操作技术将胚胎转移至新的培养皿中。
为了避免潜在的损伤，可以使用特制的胚胎转移螺丝杆或注射针来操作。
此外，胚胎的培养容器也要选择适合的大小和形状，以确保胚胎有足够的生长空间。
此外，胚胎培养过程中的时间控制也非常重要。
在胚胎离体培养的过程中，不同的发育阶段需要不同的培养时间。
例如，在小鼠胚胎培养中，受精卵需要培养约24小时才能发展成为2细胞胚，再培养约48小时才能发展成为典型的8细胞胚。
因此，控制培养时间是保证胚胎发育正常的关键。
最后，胚胎培养过程中的质量控制也是非常重要的。
胚胎的质量控制可以通过观察胚胎的形态和发育来进行。
正常发育的胚胎应该有均匀的细胞分裂和明确的细胞核存在。
通过观察胚胎的外观，可以判断其是否发育正常。
同时，还需要进行胚胎的染色体或基因分析，以检查胚胎是否有染色体异常或基因突变。
总之，胚胎培养是一项复杂而精细的实验技术，需要注意许多细节。
正确选择培养基，提供适宜的培养环境，轻柔操作胚胎，控制培养时间和进行质量控制都是保证胚胎培养成功的关键。
第六章胚胎培养
一、胚胎培养的意义
1.概念
胚胎培养指胚及其胚器官（如子房、胚珠）在离体无菌培养条件下，使胚发育成幼苗的技术2.分类
广义: 离体胚培养、胚乳培养、胚珠培养、子房培养、试管受精、胚轴、胚芽等
狭义：离体胚培养（成熟胚培养、幼胚培养）
3.意义
可克服一些早熟品种胚早期败育现象，从而缩短育种周期，增加种子发芽度
可克服远缘杂种的不育性
利用胚乳培养可获得无籽的三倍体果实
可用于研究与胚发育有关的内外因素以及有关的代谢和生理生化变化
4.发展简史
1904年，Hanning培养萝卜、辣根的胚，提前萌发成苗，成为世界上胚胎培养最早成功的一例
30年代，Tudey培养多种果树胚胎获得成功
1942年，Dietrich对十字花科、豆科、菊科、葫芦科和禾本科的多种植物离体胚培养进行研究
二、离体胚培养
（一）成熟胚培养
指子叶期后至发育完全的胚的离体培养
易成功，在含有大量无机无素和蔗糖的培养基上培养即可萌发
培养目的
研究发育过程的形态建成、激素的作用、营养要求等生理问题
培养方法
消毒（种子70%酒精5-30`表面消毒---饱和漂液或0.1%升汞10-30 min----无菌水冲冼3-4次）——取胚（无菌解剖,直接取胚）——培养（置于培养基上培养----萌发成苗）
（二）幼胚培养
1.概念
指子叶期以前的具有胚结构的幼小胚培养
2.培养方法
包括消毒(子房)、取胚、接种。
需在高倍解剖镜下取胚，操作要细心
3.胚发育方式
a.胚胎发育：即按胚胎的正常发育途径生长发育最后成苗，是最理想的发育方式
b.胚性发育：培养的幼胚可增大，但不能萌发成苗，只呈现胚性生长
克服方法
1.提高渗透压
2.改变激素的种类或浓度
3.加入天然复合物
4.改善培养条件(pH、温度、光）
c.早熟萌发：指离体培养的幼胚越过正常胚胎发育阶段,在未达到生理和形态成熟的情况下,萌发长成幼苗。
形成畸形、弱苗或死亡.
克服途径:提高培养基渗透压(蔗糖、无机盐、甘露醇) 胚龄越小要求的渗透压（糖浓度）越高。
产生愈伤组织或胚状体
生长调节剂浓度高时易形成愈伤组织
4.影响胚培养成功的因素
○1胚的发育程度：胚越小, 离体培养难度越大
○2培养基
a.基本培养基：MS、B5、white
b.碳源：蔗糖最佳，2-4%。
重要作用是调节渗透压
不同发育时期的胚要求不同浓度的蔗糖浓度，胚年龄越小，蔗糖浓度越高
结论：
渗透压与幼胚生长关系密切，胚越小，Vp要求越高
在胚培养中，要定期将胚转移到逐渐降低Vp的培养基中
推论：
高渗透压调节胚的生长，减少由于低渗而造成对从高渗环境中分离出的胚的影响
高渗可抑制早熟萌发，并把细胞的伸长状态转到分裂状态
c.生长调节物质：IAA、KT、GA等合理浓度配比
不同植物的胚培养要求的生长物质不同（种类、浓度等）
在培养一种新的植物幼胚之前，对生长物质合理的种类、浓度进行筛选
d.胚乳营养物质
研究表明，培养基中添加胚乳抽提物可促进幼胚生长
小胚接种于破碎的胚乳上培养成功率提高
e.天然复合物：椰子汁、椰乳、酵母提取物、水解酪蛋白、水解乳蛋白
○3胚胎培养的环境条件
a. 温度
通常25-30℃。
有些种类、品种需低温打破休眠
b. 光照
黑暗或弱光下培养幼胚比较适宜
促进胚芽生长，抑制胚根生长
根据植物种类决定光照条件
c. pH 值
通常5.6-5.8之间。
有同植物种类,最适pH不同
三、胚珠培养
（一）胚珠培养的目的
克服幼胚培养难度大,不易成功
有些种类成熟胚很小,取胚珠培养较易成功
利用未受精的胚珠培养可诱发大孢子发育成单倍体
（二）胚珠培养的发展
1932年,white,胚珠培养,使胚珠只进行了很有限的生长
1942-1943年,withner,兰花胚珠培养,获得成熟种子
1958年,Maheshwari,培养授粉5天的罂粟胚珠成功,在试管内萌发成苗
胚珠培养还处于试验摸索阶段,育种方面的应用也刚开始,园艺植物如洋葱、四季桔、矮牵牛、凤仙花等胚珠培养获得成功
（三）培养方法
授粉或未授粉子房——表面消毒——无菌解剖——取出胚珠——培养
培养基：
基本培养基：Nitsch、white常用；MS、B5、N6
添加物：生长调节特质+其它（糖、V、椰乳等）
（四）胚珠离体培养的原理
胚是一个完整的细胞体系,位于胚珠之中,它与包围着它的胚珠其他部分构成一个整体.当进行离体培养时,胚珠与培养接触,胚也会受到来自培养基中的各种因素的刺激,发生反应
离体培养的胚,发育受到外源物质和胚珠中本身存在的内在因素的共同作用
提供胚生长的适合内在和外在的因素,是取得胚珠培养成功的关键
（五）影响离体胚珠培养成功的因素
1.胚的发育时期
发育时期越早,越难培养成功。
球形期以后的胚珠培养较易成功
2.胎座和子房的影响
带有部分胎座和子房组织的胚珠培养较易成功
影响机制不祥
3.培养基附加物质的影响
添加复合物对许多植物的胚珠培养有效
不同植物、不同发育时期添加物种类、数量不同
四、子房培养
（一）概念：子房培养指受粉或未受粉的子房的离体培养
受粉的子房----成熟胚
未受粉子房----单倍体植株
（二）培养方法
1.材料消毒
未受粉子房----花被包裹，只需对花蕾灭菌即可
受粉的子房----需表面灭菌
2.材料的选择
未受粉子房----选取卵细胞适宜的发育时期.通常接近成熟时的子房培养较易成功
3.培养基
基本培养基：MS、White、Nitsch、Heller等；N6、B5用于禾本科植物
适当添加生长素类物质有效
碳源多用蔗糖，浓度3-10%
4.环境条件
T：22-27℃，冬作物可低些
光照：500-1500lux
5.附属花器
附属花器对胚发育生长有利
机制不祥
6.子房植株的倍性
子房存在两种细胞（性细胞和体细胞），子房植株出现混倍现象
获得单倍体要促进大孢子细胞分裂，抑制体细胞分裂
五、离体受精（试管受精）
（一）概念：试管受精指在无菌条件下培养离体的未受精子房或胚珠和花粉，花粉萌发产生
的花粉管进入胚珠，从而完成受精过程的技术
（二）意义
克服自交不亲和性
克服杂交时受精遇到的一些障碍
缺点：
花粉不能在柱头上萌发
花粉管太短
生长太慢
（三）方法
1.花粉收集
花蕾开放前数天,将花套袋,开花当天或前一天,取尚未裂开的花蕾,常规表面灭菌,无菌条件下收集花粉
2.剥取子房和胚珠
开花前一天,对花套袋,去雄,开花前一天或花后1-2天,将花蕾取下,常规表面消毒,无菌条件下剥取子房或胚珠
3.离体授粉受精
将花粉撒在培养基上,再将子房接种上去,待花粉萌发,伸入珠孔受精
将子房接种到培养基上,再将花粉直接撒在子房上,直接萌发受精
4.胚培养
将授粉受精后的子房移至Nitsch固体培养基上培养
胚形成后移至胚培养基上培养
（四）影响试管受精成功的因素
1、离体胚珠的成活率和受精力，关键是培养基。
2、花粉萌发和花粉管的生长速度，关键是培养基,注意钙和硼的作用。
3、花粉的灭菌，新鲜花蕾浸渍灭菌,然后剥出花粉使用。
紫外线照射灭菌,15min。
六、胚乳培养
胚乳为胚的发育和种子萌发时幼苗生长提供营养物质
被子植物的胚乳为双受精的产物，所以通常为三倍体
裸子植物的胚乳由雌配子体发育而来，为单倍体
早在三十年代，人们就进行了胚乳培养，已证明胚乳细胞同样具有潜在的形成发生能力，只要条件适宜“全能性”即可表现出来
（一）胚乳培养的意义
1.基础理论方面
了解胚乳的全能性
了解胚与胚乳的相互关系
研究胚乳细胞合成蛋白、糖等物质的生理机制
2.育种方面
胚乳植株染色体倍性不稳定，多数为多倍体和非整倍体，从而为园艺植物多倍体遗传育种提供丰富的原始材料
胚乳培养可获得无籽结实的三倍体植株
胚乳培养的遗传基础2/3来自母本，从而提高对育种后代的预见性
（二）胚乳培养的方法
1.愈伤组织的诱导
取授粉4-8天的幼果——表面灭菌——无菌取出胚乳——接种——愈伤组织2-30mm——分
化培养基——胚乳植株
○1MS、White、LS，2.4-D 0.5-2.0 mg/ml，BA 0.1-1.0 mg/ml，蔗糖2-3%，黑暗或弱光
○2MS、White，NAA 0.5-2.0 mg/ml，BA 0.5-3.0 mg/ml，充足的光照，注意转移时愈伤的年龄
（三）胚乳植株的倍性
多数胚乳植株都是由具有多种数目的染色体细胞组成的嵌合体
可从中筛选取出各种类型非整倍体，在遗传育种中具有一定利用价值
目前为止，胚乳培养成功的例子十分有限，应深入开展这方面的研究，尽快开辟诱导形成三倍体植株的途径
（四）胚乳离体培养的研究进展
仅能形成愈伤组织：黄瓜、檀香、小麦、沙针、黑麦草、美洲槲寄生、澳洲根寄生
达到器官分化水平：玉米、蓖麻、巴豆、变叶木、葡萄荷叶芹、黑种草等
形成完整植株：大麦、水稻、苹果、柚、橙、马铃薯、桃、荷叶芹。
