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实验三 猪血中超氧化物歧化酶(SOD)的分离纯化及活力测定一、 实验原理超氧化物歧化酶(SOD)是一种能够专一性清除超氧离子自由基-2O 的金属酶。
它是一种酸性蛋白，对热、pH 和蛋白酶的水解较一般酶稳定。
SOD 催化下述反应：222222O O H O H +→+-+.。
机体内-2O 过量或不足都会对人体产生危害，SOD 对过量的-2O 及时清除保证-2O 含量的相对平衡。
本实验采用有机溶剂沉淀法以新鲜猪血为材料，从中提取SOD 并进行纯化。
该实验SOD 酶活性采用邻苯三酚自氧化法测定，其酶活性单位定义为：每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%酶量定义一个酶单位。
样品中蛋白质含量采用考马斯亮蓝250-G 法测定。
考马斯亮蓝250-G 在游离状态下呈粉红色，与蛋白质结合后呈蓝色。
在一定范围内，溶液在595nm 波长下的光密度与蛋白质含量成正比，可用比色法测定，测定范围是1-1000ug 。
SOD 同工酶鉴定采用不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分离鉴定。
二、试剂与材料[1]试剂：ACD 抗凝剂、0.9%NaCl 、丙酮、05%乙醇、氯仿、50mmol/L pH8.3磷酸缓冲液、10mmol/LEDTA 钠盐溶液、3 mmol/L 邻苯三酚钠溶液、考马斯亮蓝250-G 标准蛋白质溶液、[2]器材：分光光度计、试管、刻度吸管、离心机、烧杯。
三、操作步骤1、SOD 提取[1] 取40ml 新鲜猪血，5000r/m 离心10min ，去上层血浆，取下层红血球粘稠液。
加入2倍体积的0.9%Nacl 溶液清洗，5000r/m 离心10min ，弃上层清液。
[2] 向洗净的红血球中加入适量蒸馏水至15ml ，剧烈搅拌30min ，使其充分溶血。
再向溶血溶液中缓慢加入预冷的0.25倍体积的95%的乙醇溶液和0.15倍体积的氯仿，均浆呈红色，再继续搅拌15min ，4000r/m 离心10min ，去变性蛋白质沉淀物，得上层液，留样1ml 。
猪血红细胞SOD分离纯化及活性分析一．概述自从人类从牛的红细胞中提取SOD以来，至今已经建立了一整套快速而有效的SOD分离及分析方法，并对它的化学、药理、临床及其作用机制进行了一系列研究。
SOD无抗原性，不良反应较小，是很有临床价值的治疗酶，掌握其一整套完善实用的实验室制备技术具有深远意义。
超氧化物歧化酶广泛存在于自然界各种生物体内，而目前动物血液是生产超氧化物歧化酶的主要原料，牛血和猪血较为常见，虽然猪血很少用于生产，但是鉴于猪血价格低廉且资源丰富，对于实验室研究制备比较适合。
本实验中采用一系列技术方法对SOD进行提取纯化分析，虽然大部分都是一些常规技术，但是很多技术的细节前人尚不甚明了，因此与实验结果相比，本实验所应用的技术处理手段及其相关理论解释对后续实验者操作的启发意义显得更为重要，并且很多技术原理并不是局限于一种或一类实验而是广泛应用于化学研究领域的。
二．实验所用到的主要仪器与技术仪器：大容量离心机，分光光度计，电泳槽，层析柱，紫外分光光度计，记录仪等等技术：离心配平，洗涤溶胀，盐析，透析，电泳，分光光度法，柱层析等等。
三．所用到的试剂3.8%柠檬酸钠，0.9%NaCl, 95%乙醇，氯仿，K2HPO4.3HO2,KH2PO4, 丙酮，0.0025mol PH7.8磷酸钾缓冲液，1mol K2HPO4 90.8ml+1mol KH2PO4 9.2ml,稀释40倍。
比色分析试剂BSA冰醋酸PAGE试剂DEAE试剂四．关键的试验无水磷酸氢二钾盐析，磷酸钾缓冲液透析，蛋白质含量测定，SOD活性测定，PAGE电泳，DEAE柱层析，SOD精酶液蛋白含量测定，SOD 精酶液SOD活性测定五．实验流程第一天：（1）取新鲜抗凝猪血800ml。
在天平上与另外一组进行配平，由于对方重了一些，我组加入了一些备用的抗凝猪血。
配平完后，放入大容量离心机，待其他组放好后，关上盖子，设置温度为4度，转速为2800rpm/min开始离心。
动物血中超氧化物歧化酶的提取和活性测定原理超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase，简称SOD)广泛存在于生物体内的含Cu、Zn、Mn、Fe的金属类酶。
它作为生物体内重要的自由基清除剂，可以清除体内多余的超氧阴离子，在防御生物体氧化损伤方面起着重要作用。
离子(02-)是人体氧代谢产物，它在体内过量积累会引起炎症、肿瘤、色斑沉淀、衰老等疾病，超氧阴离子与生物体内许多疾病的发生和形成有关。
由于SOD能专一消除超氧阴离子(O2 -)而起到保护细胞的作用，SOD作为一种药用酶，具有广阔的应用前景，并引起了国内外医药界、生物界和食品界的极大关注。
按金属辅基成分的不同可分成3种类型。
最常见的一种含有铜锌金属辅基(CuZn-SOD)，主要存在于真核细胞的细胞质中，在高等植物的叶绿体基质、类囊体内以及线粒体膜间隙也有存在，CuZn-S0D 酶蛋白的分子量约为3.2×104，纯品呈蓝绿色，每个酶分子由2个亚基通过非共价键的疏水基相互作用缔合成二聚体。
每个亚基(肽链)含有铜、锌原子各一个，活性中心的核心是铜。
第二种含有锰离子(Mn-SOD)，主要存在于真核细胞的线粒体和原核细胞中，在植物的叶绿体基质和类囊体膜上也有存在，纯品呈粉红色，由4条或2条肽链组成。
第三种是Fe-S0D，过去一直认为只存在于原核细胞中，近来发现有一些真核藻类甚至某些高等植物中也有存在。
Fe-SOD纯品呈黄色或黄褐色，由2条肽链组成，多数情况下每一个二聚体中含有一个Fe原子。
l969年，McCord和Fridovich第一次从牛血中提纯到超氧化物岐化酶。
自然界中SOD分布极广，其含量随生物体的不同而不同，即使同一种生物的不同组织或同一组织的不同部位，其SOD的种类和含量也有很大差别。
迄今为止人们已从细菌，真菌、原生动物。
藻类、昆虫、鱼类、植物和动物等各种生物体内分离得到SOD。
为拓宽提取SOD的原料，筛选或基因过程开发产SOD量较高的菌株。
超氧化物歧化酶（SOD）活力测定植物叶片在衰老过程中发生一系列生理生化变化，如核酸和蛋白质含量下降、叶绿素降解、光合作用降低及内源激素平衡失调等。
这些指标在一定程度上反映衰老过程的变化。
近来大量研究表明，植物在逆境胁迫或衰老过程中，细胞内自由基代谢平衡被破坏而有利于自由基的产生。
过剩自由基的毒害之一是引发或加剧膜脂过氧化作用，造成细胞膜系统的损伤，严重时会导致植物细胞死亡。
自由基是具有未配对价电子的原子或原子团。
生物体内产生的自由基主要有超氧自由基（O2.－）、羟自由基（OH.）、过氧自由基（ROD）、烷氧自由基（RO）等。
植物细胞膜有酶促和非酶促两类过氧化物防御系统，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）和抗坏血酸过氧化物酶（ASA-POD）等是酶促防御系统的重要保护酶。
抗坏血酸（VC ）、VE和还原型谷胱甘肽（GSH）等是非酶促防御系统中的重要抗氧化剂。
SOD、CAT等活性氧清除剂的含量水平和O2.－、H2O2、OH. 和O2等活性氧的含量水平可作为植物衰老的生理生化指标。
自1968年发现SOD后，立刻引起科学界的高度重视，近40年来这方面的研究进展非常迅速，它的应用领域日益拓宽，SOD也有了产品。
二十世纪80年代后期，我国关于SOD的研究及应用也形成了热点，如今已在化妆品添加剂、饮料及医药方面显示了特殊效果。
超氧自由基（O2.－）是生物细胞某些生理生化反应常见的中间产物。
自由基是本身带有不成对价电子的分子、原子、原子团或离子，化学性质非常活泼，是活性氧的一种。
如果细胞中缺乏清除自由基的酶时，机体就会受到各种损伤。
超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase），简称SOD，能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧自由基（O2.－），生成H2O2和O2。
H2O2由过氧化氢酶（CAT）催化生成H2O和O2，从而减少自由基对有机体的毒害。
一、目的学习和掌握氯化硝基四氮唑蓝（NBT）光化还原法测定SOD活力的方法和原理，并了解SOD的作用特性。
实验8 猪血SOD的提取1969年，Maccord和Fridovich第一次从牛血中提纯到超氧化物歧化酶。
超氧化物歧化酶，简称SOD（ superoxide dismutase），是一种广泛存在于动、植特及微生物中的金属酶。
自然界中SOD分布极广，其含量随生物体的不同而不同，即使同一生物的不同组织或同一组织的不同部位，其SOD的种类和含量也有很大的差异。
迄今为止人们已从各种生物体内分离得到SOD。
为拓宽SOD的原料，筛选或基因过程开发SOD量较高的菌株。
目前研究开发最多的资源还是从动物血液、动物组织中制备提纯SOD.一、实验目的1．学习从血液中提取SOD，并了解天然酶提取的一般过程。
2．学习使用酸度计。
二、实验内容1．原材料的预处理；2．粗酶液的制备；3.离子交换色谱精制；4．紫外分光光度计检测蛋白质含量；5．酶活力的检测。
三、实验原理酶是活细胞产生的一类具有催化功能的生物分子——生物催化剂，其中绝大多数是蛋白质，可在一定浓度的酸、碱、盐溶液中溶解，又可在一定浓度的有机溶剂中沉淀。
国内多采用Maccord和Fridovich法制备SOD，其主要工业过程为：第一步，乙醇－氯仿除去血红蛋白；第二步，有机溶剂和硫酸铵分级沉淀；第三步，离子交换色谱精制。
四、实验材料1．实验仪器离心机，单盘天平(DT-100)，搅拌器(电动)，电冰箱(BCD-228B)，7530G 型紫外可见分光光度计(上海分析仪器厂)，pHS-2型酸度计。
2．实验试剂5％的柠檬酸三钠，生理盐水，95％乙醇，2.5mmol／LpH值为7．6的磷酸钾缓冲液，丙酮，氯仿，聚丙烯酸，P2O5五、实验过程1．分离红细胞取新鲜猪血，然后迅速将7份血(每份20m1)加1份5％的柠檬酸三钠搅匀，并放人离心沉淀器中，以3000r／min离心处理15min，吸除上清液(血浆)，收集下层红细胞沉淀。
2．除血红蛋白把收集的红细胞加2倍0.9％的氯化钠溶液，以3000r／min离心处理7min，重复3次，得洗涤红细胞(洗涤后的红细胞在一15℃条件下可保存60天)，然后在洗净的红细胞中加入等体积的蒸馏水，在0～4℃条件下，搅拌溶血30min，在0～4℃下放置10h以上，使红细胞充分破裂。
实验三猪血中超氧化物歧化酶（SOD）的分离纯化及活力测定生物化学与分子生物学刘志坚S2*******一、超氧化物歧化酶（SOD）概述SOD是一种酸性蛋白，是唯一以自由基为底物的酶，具有清除自由基的功能酶，在酶分子上共价连接金属辅基，因此它对热、PH以及某些理化性质表现出异常的稳定性。
SOD根据所含金属辅基不同可分为三种：第一种是铜（Cu）锌（Zn）金属辅基称（Cu/Zn-SOD）最为常见的一种酶，呈绿色，主要存在于肌体细胞浆中。
它为同源二聚体酶，其中一个亚基结合一个Cu原子，另一个亚基结合一个Zn原子，两个亚基间的相互作用提高了酶的催化活性和稳定性，金属原子的氧化还原完成了酶的催化功能。
第二种是含锰（Mn）金属辅基的称（Mn—SOD），呈紫色，存在于真核细胞的线粒体和原核细胞内。
Mn—SOD是由203个氨基酸残基构成的四聚体，Mn3+处于三角双锥配位环境中，其中一轴向配位为水分子，另一轴向被蛋白质辅基的配位His-28占据，另3个配位His-83、His-170和Asp-166位于赤道平面。
第三种是含铁（Fe）金属辅基的称（Fe—SOD），呈黄褐色，存在于原核细胞中。
其活性中心是3个His，1个Asp和1个H2O扭曲四面体配位而成。
其中，Mn—SOD 、Fe—SOD的结构特征是不含半胱氨酸，含有较多的色氨酸和酪氨酸，因此紫外吸收光谱类似一般蛋白质，在280nm附近有最大吸收峰，Mn—SOD的可见光谱在475nm处附近有最大吸收，Fe—SOD在350nm处有最大吸收，这都反映了所含金属离子的光学性质。
SOD为自由基清除剂，它广泛存在于生物体的各种组织中，能清除O2-（超氧阴离子）自由基，而超氧阴离子自由基具有细胞毒性，可使脂质过氧化，损伤细胞膜，引起炎症，肿瘤和自身免疫性疾病，并可能促使机体衰老。
它的功能为：（1）抑制心脑血管疾病：机体的衰老与体内氧自由基的产生与积累密切相关，SOD课清除人体内过多的有害的氧自由基，是对健康的有益的功效成分。
超氧化物歧化酶SOD的分离纯化技术证明SOD提取过程工艺不同浓度的硫酸铵对纯化SOD蛋白酶的效果的综合影响一、摘要：通过对绿豆的研磨破碎获得SOD粗酶，经过(NH4)2SO4分级分离、透析除盐和浓缩等过程，除去粗酶中的杂质及干扰蛋白。
二、关键词：SOD 连苯三酚自氧化法SOD酶活性测量透析除盐三、前言：超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase），简称SOD，是一种新型酶制剂，属金属酶.它是一种源于生命体的活性物质，SOD是机体内危害最大的氧自由基专一清除剂，亦是其他自由基最有效的清除剂，它与体内的谷胱甘肽过氧酶、过氧化氢酶联手，把自由基转化为水和氧分子。
能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质。
对人体不断地补充SOD具有抗衰老的特殊效果。
本实验以绿豆为原料提取SOD，通过各步的分离提纯，应测得酶总活力逐渐减小，比活逐渐升高.通过本实验掌握物质分离纯化的实验设计过程，以及硫酸铵分离、透析除盐、浓缩和葡聚糖凝胶层析等物质分离技术。
四、实验技术路线：我们的这次试验主要的路线是通过测定经过不同浓度的硫酸铵分离出来的不同的SOD蛋白的上清和沉淀，以此来确定硫酸铵沉淀SOD酶和其他杂蛋白的一个大致区间。
经过40%的硫酸铵和50%的硫酸铵作用过后的提取液，得到40%的上清和沉淀，50%的上清和沉淀。
然后分别测定这4份样品的SOD酶活力，来推理出硫酸铵沉淀区间。
五、材料和试剂：绿豆（实验使用前需先用蒸馏水浸泡20h）；连苯三酚（使用时需先稀释5倍）；硫酸铵（粉末）；Tris-HCL缓冲液；蒸馏水。
六、仪器：匀浆机；低温离心机；分光光度计；移液枪；500ml量筒；纱布；烧杯和试管若干。
七、实验步骤：1、取30g绿豆，并加入300ml蒸馏水，用匀浆机匀浆。
2、匀浆出来的豆液用二层纱布过滤，离心（5℃，3000rpm / 8min）取上清液，取1ml上清液测量其总活性（用连苯三酚自氧化测SOD活性法），其余量取150ml分装成两支各75ml。
猪血超氧化物歧化酶分离纯化工艺改进及其抗氧化活性研究王保全;庞晓斌;李昭华;平娟;王玲玲;董先智【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2010(000)002【摘要】以新鲜猪血为原料,首次利用改进的新工艺提取分离超氧化物歧化酶,经过溶血,热变,丙酮沉淀,超滤浓缩,SephadexG-75凝胶过滤层析和DEAE-sepharose-fast flow离子交换层析纯化,冷冻干燥等步骤,得到高纯度酶,并对酶的相关性能进行研究.试验结果显示产品粗酶活性在3 000 U/mg左右,分剐经SephadexG-75和DEAE-sepharose-fast flow层析纯化后,酶活分别达到5 585 U/mg和6 148 U/mg产品得率分别为13.4%和10.32%,SDS-PAGE凝胶电泳显示为单一条带达到电泳纯,其分子量在31 kD附近,其临苯三酚抗氧化活性明显.【总页数】5页(P168-172)【作者】王保全;庞晓斌;李昭华;平娟;王玲玲;董先智【作者单位】河南大学药学院,开封,475001;中国科学院生物物理研究所,北京,100101;河南大学药学院,开封,475001;中国科学院生物物理研究所,北京,100101;河南大学药学院,开封,475001;河南大学药学院,开封,475001;中国科学院生物物理研究所,北京,100101【正文语种】中文【相关文献】1.苦瓜抗氧化活性成分的分离纯化及抗氧化活性研究 [J], 刘苇芬;郭丽萍2.麦苗中超氧化物歧化酶抗氧化活性研究 [J], 张志清;丛军;林虹;晁正3.红花籽抗氧化肽的分离纯化及抗氧化活性研究 [J], 孙立;毛晓英;陈计峦;李保山4.湖南猪血桃花色苷提取工艺优化及抗氧化活性研究 [J], 杨玉;陈为峰;袁野;廖琼;邓文;徐海;卜范文5.猪血中抗菌肽类物质的分离纯化和抗菌活性研究 [J], 张艳梅;佘锐萍;刘天龙;李文贵;贾君镇;包汇慧因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
实验三猪血中超氧化物歧化酶（SOD）的分离纯化及活力测定生物化学与分子生物学刘志坚S2*******一、超氧化物歧化酶（SOD）概述SOD是一种酸性蛋白，是唯一以自由基为底物的酶，具有清除自由基的功能酶，在酶分子上共价连接金属辅基，因此它对热、PH以及某些理化性质表现出异常的稳定性。
SOD根据所含金属辅基不同可分为三种：第一种是铜（Cu）锌（Zn）金属辅基称（Cu/Zn-SOD）最为常见的一种酶，呈绿色，主要存在于肌体细胞浆中。
它为同源二聚体酶，其中一个亚基结合一个Cu原子，另一个亚基结合一个Zn原子，两个亚基间的相互作用提高了酶的催化活性和稳定性，金属原子的氧化还原完成了酶的催化功能。
第二种是含锰（Mn）金属辅基的称（Mn—SOD），呈紫色，存在于真核细胞的线粒体和原核细胞内。
Mn—SOD是由203个氨基酸残基构成的四聚体，Mn3+处于三角双锥配位环境中，其中一轴向配位为水分子，另一轴向被蛋白质辅基的配位His-28占据，另3个配位His-83、His-170和Asp-166位于赤道平面。
第三种是含铁（Fe）金属辅基的称（Fe—SOD），呈黄褐色，存在于原核细胞中。
其活性中心是3个His，1个Asp和1个H2O扭曲四面体配位而成。
其中，Mn—SOD 、Fe—SOD的结构特征是不含半胱氨酸，含有较多的色氨酸和酪氨酸，因此紫外吸收光谱类似一般蛋白质，在280nm附近有最大吸收峰，Mn—SOD的可见光谱在475nm处附近有最大吸收，Fe—SOD在350nm处有最大吸收，这都反映了所含金属离子的光学性质。
SOD为自由基清除剂，它广泛存在于生物体的各种组织中，能清除O2-（超氧阴离子）自由基，而超氧阴离子自由基具有细胞毒性，可使脂质过氧化，损伤细胞膜，引起炎症，肿瘤和自身免疫性疾病，并可能促使机体衰老。
它的功能为：（1）抑制心脑血管疾病：机体的衰老与体内氧自由基的产生与积累密切相关，SOD课清除人体内过多的有害的氧自由基，是对健康的有益的功效成分。
具有调节血脂的保健作用，可预防动脉粥样硬化，预防高血脂引起的心脑血管疾病。
降低脂质过氧化物的含量。
（2）抗衰老：年龄的增长和某些体外因素会造成机体和皮肤组织自由基产生超过机体正常清除自由基的能力，从而使皮肤组织造成伤害，导致衰老。
由于SOD能够清除自由基，因而可以延缓衰老。
（3）防治自身免疫性疾病：SOD对各类自身免疫性疾病都有一定的疗效。
如红斑狼疮、硬皮病、皮肌炎等。
（4）肺气肿：肺气肿患者亦可使用SOD ，但应在病变初期肺弹性纤维尚未受到损害时使用，疗效较好。
（5）辐射病及辐射防护：对有可能受到电离辐射的人员，可注射SOD 作为预防措施。
（6）老年性白内障：对这类疾病应在进入老年期前即开始经常服用抗氧化剂，或者说经常注射SOD。
一旦形成白内障，则应该摘除，因为此时使用SOD无效。
（7）抗氧化：医学报告指出，抗氧化能力的衰退期已提前至40岁左右，光靠蔬果已经不足以消除人体内外共同形成的氧化压力。
（8）预防慢性病：自由基是科学家最近才发现导致各种慢性病与老化的罪魁祸首，故说它是“万病之源”，是人体健康的大敌，自由基对身体的伤害是日积月累的，尤其是糖尿病与心血管方面的疾病。
（9）抗疲劳：过多的自由基在体内残存，就犹如毒素蓄积在体内一样，会让人：容易疲劳、厌倦、注意力不集中、常常昏昏沉沉、打哈欠。
SOD对上班族熬夜加班、学生应付考试所产生的疲劳，在提振精神及集中注意力方面成效显著，有助于工作绩效的提升，及考试成绩的进步。
二、原理超氧化物歧化酶（SOD）是一种能专一地清除超氧离子自由基（O2-）的金属酶，它具有抗衰老。
抗辐射、抗炎抗癌等作用，因而在医药、化妆品、食品工业等方面具有了广泛的应用前景。
SOD是一种酸性蛋白，对热、pH和蛋白酶的水解较一般酶稳定。
按照它所含金属离子的不同，可分为Cu-Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD等三种。
Cu-Zn-SOD为二聚体，呈蓝绿色；Mn-SOD呈紫红色；Fe-SOD呈黄褐色。
SOD催化下述反应：2H++2O2-→H2O2+O2。
机体内O2-的过量和不足均对机体不利，SOD对过量的O2-的及时清除保证了机体内的含量的相对平衡。
机体内O2-的形成可分为生理性和病理性两方面。
在一些正常生理过程中会形成一些O2-。
例如：呼吸链中电子传递结果可产生一些O2-。
在某些疾病（如氩中毒、辐射病等）过程中会产生大量的O2-。
过量的O2-如不及时清除，会对细胞损伤。
SOD将O2-歧化为H2O2，而过氧化氢（物）酶、谷胱甘肽过氧化酶可催化过氧化氢分解，在机体内形成一套解毒系统，对机体起防护作用。
本实验采用有机容易沉淀法以新鲜猪血为原料，从中提取SOD并进行纯化。
酶活力测定可用以下方法：邻苯三酚自氧化法、黄嘌呤氧化酶法、NBT光还原法、化学发光法、肾上腺素自氧化法、亚硝酸法等。
该实验SOD酶活性采用邻苯三酚自氧化法测定，酶活性单位定义为：每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%的酶量定义为一个酶单位。
样品中蛋白质含量用考马斯亮蓝G-250法测定。
考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，与蛋白质结合呈现蓝色。
在一定范围内，溶液在595nm波长下的光密度与蛋白质含量成正比，可用比色法测定，测定范围1-1000μg。
SOD同工酶鉴定采用不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分离鉴定。
用“负”显色法，核黄素经光照所产生的活性氧O2-（氧自由基）能使氧化硝基四氮唑蓝（NBT）有黄色的氧化型转化为蓝色的还原型。
由于SOD能够抑制O2-的作用，因此，电泳分离SOD后，凝胶上无SOD处应显示为蓝色，而有SOD处应无色透明，由此可鉴定SOD同工酶的酶谱（即同工酶的数量、分布活性大小）。
三、实验试剂与器材(略)四、操作步骤1.SOD的提取[1]取新鲜猪血40ml于50ml离心管，6000r/m，10min离心，去上层血浆，取下层红血球粘稠液，然后加入2倍体积的0.9%NaCl溶液清洗，4000r/m，10min离心，弃上层清液，再加入2倍体积的0.9%NaCl溶液重复清洗一次，4000r/m，10min离心，得洗净的红血球粘稠液。
[2]向洗净的红血球中加入等体积的蒸馏水，剧烈搅拌30min，使其充分溶血。
再向溶血液中缓慢加入预冷的0.25倍体积的95%乙醇溶液和0.15倍体积的氯仿，匀浆呈暗红色，再继续搅拌15min，4000r/m，10min离心，去变性蛋白沉淀物，得上层液，留样1ml。
然后将清液在65-70℃恒温水浴中进行热处理，15min后取出迅速冷却到室温，4000r/m，5min离心除去沉淀，得浅黄色粗酶液，留样1ml。
[3]向粗酶液中加入等体积的丙酮溶液，冰箱静置过夜，4000r/min，10min弃上清液，得沉淀。
将沉淀物用等体积预冷的丙酮溶液清洗两次，离心收集沉淀，自然干燥即得淡绿色成品，按1mg/ml 溶于蒸馏水，备用。
2. SOD 活力测定[1] 邻苯三酚自氧化率的测定取4.5ml 50mmol/L pH8.3的磷酸缓冲液，4.2ml 蒸馏水和1ml 10mmol/L EDTA-Na2溶液，混匀后在25℃水浴保温20分钟，取出后立即加入25℃预热过的邻苯三酚溶液0.3ml ，迅速摇匀，倒入光径1cm 的比色杯内，用10mmol/L HCl 作空白，325nm 波长下每隔30秒钟测光吸收值一次，整个操作在4分钟内完成，计算出每分钟A325的增值，此即为邻苯三酚自氧化率。
要求自氧化速率控制在0.070/min 左右。
[2] 酶活力测定操作与⑴基本一致，加入邻苯三酚前，先加入一定体积的SOD 样液，蒸馏水则减少相应的体积，同理测其光吸收值，计算加酶后邻苯三酚自氧化率。
[3] 酶活性单位的计算根据酶活性单位的定义，按下列公式计算酶活性：样液体积样液稀释倍数反应液总体积数）（单位活性⨯⨯⨯-=%50%100/)/(00A A A ml U m其中，A 0：为邻苯三酚自氧化率；A m ：加酶后邻苯三酚自氧化率； 总活性(U)＝单位活性×酶原液总体积[4] 蛋白质含量测定（考马斯亮蓝G-250法）： （1） 标准曲线的制作：取6支具塞试管，编号，按下表加入试剂：盖上塞子，摇匀。
注意各管振荡程度尽量一致。
放置10分钟，在595nm 波长下比色测定光吸收值，比色应在1小时内完成。
以牛血清白蛋白含量（ug ）为横座标，光吸收值为纵坐标，绘出标准曲线。
（2） 样品中蛋白含量的测定将待测的SOD 溶解并稀释到一定浓度，取1支试管，准确加入0.1ml 样品提取液，加入0.9ml 蒸馏水和5ml 考马斯亮蓝G-250试剂，其余操作与标准曲线制作相同。
（3） 蛋白质含量计算根据所测样品提取液的光吸收值，在标准曲线上查得相应的蛋白质含量(ug)，计算其浓度。
（4） 结果处理利用考马斯亮蓝G-250法测定每毫升酶原液蛋白质毫克数。
将测得的数据填入以下表格：提纯步骤酶液总体积ml蛋白质mg/ml酶活性(U/ml)总活性(U)比活性U/mg. pr回收率(%)纯化倍数除血蛋白上清 热变性后上清 丙酮沉淀后的五、结果与分析 结果邻苯三酚自氧化率的测定：[1] 邻苯三酚自氧化速率=（0.094+0.091+0.087+0.084）/4=0.089/min 样品/时间(min) 0.511.522.533.541 0.042 0.076 0.108 0.142 0.176 0.207 0.237 0.268 2 0.034 0.072 0.110 0.148 0.184 0.220 0.255 0.288 30.027 0.055 0.087 0.117 0.148 0.177 0.207 0.236分别计算加入样品1后邻苯三酚自氧化率：0.066/min 0.066/min 0.068/min 0.065/min 0.061/min 0.061/min所以：加入样品1后邻苯三酚自氧化率=0.387/6=0.0645/min 分别计算加入样品2后邻苯三酚自氧化率：0.076/min 0.076/min 0.074/min 0.072/min 0.071/min 0.068/min所以：加入样品2后邻苯三酚自氧化率=0.437 /6=0.0728/min)()()/()/()/(m g U m l m g m l U m g U 总蛋白质总活力单位蛋白质浓度单位活力比活力==分别计算加入样品3后邻苯三酚自氧化率：0.060/min 0.062/min 0.061/min 0.060/min 0.059/min 0.059/min所以：加入样品3后邻苯三酚自氧化率=0.361/6=0.060/min[2] 酶活性单位的计算Am 样液体积mL 反应液总体积mL 单位活性U/mL 总活性U 样品1 0.0645 1 10 550.5618样品2 0.0728 1 10 364.0449样品3 0.060 1 10 651.6854[3] 蛋白质含量的标准曲线牛血清蛋白质含量（ug）0 20 40 60 80 100 吸光度值0 0.088 0.201 0.315 0.455 0.554通过标准曲线的公式y = 0.005x - 0.015可以计算出样品中SOD含量样品加入量(ul) 吸光度值SOD含量（ug）1 50 0.551 113.22 100 0.150 333 200 0.186 40.2[4]样品蛋白质含量：样品吸光度蛋白质含量mg 样品加入量mL 单位蛋白质浓度mg/ml 样品1 0.511 0.0937 0.05 1.875样品2 0.150 0.0293 0.1 0.293样品3 0.186 0.0357 0.1 0.360[5]结果处理样品单位活性U/ml 单位蛋白质浓度mg/ml 比活力U/mg样品1 550.5618 1.875 293.633样品2 364.0449 0.293 1242.474样品3 651.6854 0.360 1810.237 [6]最终结果数据表提纯步骤酶液总体积ml蛋白质mg/ml酶活性U/ml总活性U比活性U/mg回收率%纯化倍数除血蛋白上清 1.875 550.5618 293.633 1热变性后上清0.293 364.0449 1242.474 4.231 丙酮沉淀后的0.360 651.6854 1810.237 1.457分析讨论1.从蛋白质标曲图的R2 =0.9961来看，实验结果不太准确，未达到0.999但可以作为本实验的参考，通过计算得到的蛋白质含量、酶活、比活力等数据可能不太准确，这可能与实验当时酶量称量不准确和操作过程有关。
