大实验一.从土壤中分离纯化蛋白酶产生菌

蛋白酶产生菌的分离、鉴定和筛选是一项重要的微生物学工作，通常用于寻找能够产生具有特定功能的蛋白酶的细菌或真菌菌株。

以下是一般的步骤和方法：
1. 样品采集：首先从土壤、水体、食品等环境中采集样品，可能含有潜在的蛋白酶产生菌。

2. 分离：将样品进行稀释处理后，通过涂布法、稀释涂布法、过滤法等分离方法，在富含寒原蛋白酶的寒原平板培养基上培养，以分离出单菌种。

3. 纯化：将分离得到的单菌种进行多次传代，确保单一菌株的纯化。

4. 鉴定：利用生理生化试验、形态学观察、生物学特性和分子生物学方法（如16S rRNA序列分析）等手段，对分离得到的菌株进行鉴定，确定其分类地位。

5. 筛选：利用含有蛋白质底物的培养基（如乳清蛋白、明胶等）进行筛选，观察菌株在培养基上的透明圈或发酵液的浑浊度变化，筛选出产生蛋白酶活性高的菌株。

6. 活性测定：对筛选出的蛋白酶产生菌株进行蛋白酶活性测定，确
定其蛋白酶活性水平。

7. 保存与应用：对获得的蛋白酶产生菌株进行保存，并进一步研究其生物学特性和应用潜力，如酶学特性、温度和pH稳定性等。

通过以上步骤，可以有效地从环境样品中分离、鉴定并筛选出具有高蛋白酶产量和活性的菌株，为后续的蛋白酶生产及应用研究提供了可靠的菌种资源。

第1篇一、实验目的1. 了解发酵工程的基本原理和操作方法；2. 掌握微生物的培养、分离、鉴定及发酵条件优化等实验技术；3. 提高实验操作能力和数据分析能力。

二、实验原理发酵工程是一门研究微生物发酵过程及其应用的科学。

通过发酵工程，可以利用微生物的代谢活动生产出各种有用的产品，如食品、医药、化工产品等。

本实验主要涉及微生物的培养、分离、鉴定及发酵条件优化等实验技术。

三、实验材料与仪器1. 材料：土壤样品、牛肉膏蛋白胨培养基、葡萄糖、酵母提取物、氯化钠、硫酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁、琼脂等；2. 仪器：高压蒸汽灭菌器、恒温培养箱、显微镜、电子天平、pH计、发酵罐、酒精灯、试管、培养皿等。

四、实验方法1. 微生物分离与纯化（1）土壤样品的采集与处理：在校园内采集土壤样品，将土壤样品过筛，去除杂质，备用；（2）牛肉膏蛋白胨培养基的制备：按照实验要求，称取牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、氯化钠、硫酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁等试剂，加入适量的水，搅拌均匀，煮沸10分钟，待冷却后加入琼脂，搅拌均匀，倒入培养皿中，待凝固；（3）土壤样品的接种：将处理好的土壤样品稀释，取适量涂布在牛肉膏蛋白胨培养基上，置于恒温培养箱中培养；（4）分离纯化：观察菌落特征，挑选单菌落进行纯化，重复以上步骤，直至获得纯化菌株。

2. 微生物鉴定（1）观察菌落特征：观察纯化菌株在牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落特征，如菌落大小、形状、颜色、边缘等；（2）显微镜观察：将纯化菌株进行涂片、染色，在显微镜下观察菌体形态、染色特性等；（3）生化试验：进行糖发酵试验、氧化酶试验、淀粉酶试验等，鉴定菌株的生理生化特性。

3. 发酵条件优化（1）发酵培养基的制备：根据实验要求，称取葡萄糖、酵母提取物、氯化钠、硫酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁等试剂，加入适量的水，搅拌均匀，煮沸10分钟，待冷却后加入琼脂，搅拌均匀，倒入发酵罐中；（2）发酵条件优化：通过改变发酵温度、pH值、接种量、发酵时间等条件，观察发酵产物的产量和品质，确定最佳发酵条件。

产蛋白酶菌种的分离与纯化--初筛一、目的要求1 学习蛋白酶产生菌的筛选方法。

2 掌握稀释涂布平板法从自然环境中分离纯化微生物的基本操作技术。

3 进一步熟练和掌握微生物无菌操作技术。

二、基本原理土壤是微生物生长的大本营，所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的，因此土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离纯化得到许多有价值的菌株。

工业微生物菌种最初都来自于自然界。

但是自然界中微生物种类繁多，而且都是混居在一起的，要获得工业发酵菌株，首先必须把它们从混杂的微生物群体中分离出来。

从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。

常用的方法有：简单单细胞挑取法和平板分离法。

本实验用平板分离法。

平板分离法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化。

其基本原理包括两个方面：(1)选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养，酸碱度，温度和氧等或加入某种抑制剂造成只利于该微生物的生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。

(2)微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体。

因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。

获取单个菌落的方法可通过稀释涂平板法或平板划线等技术完成。

值得指出的是从微生物群体中经分离生长在平板上的单菌落并不一定保证是纯培养。

因此纯培养的确定要经过一系列的分离与纯化过程和多种特征鉴定方能得到。

蛋白酶是一类重要的工业用酶制剂，它能将蛋白质分解成短肽甚至氨基酸。

根据三氯乙酸能将酪蛋白变性从而产生沉淀这一原理，可在平板培养基上直接筛选蛋白酶产生菌株。

产酶菌株能将酪蛋白水解成小分子物质，菌落周围不形成沉淀蛋白而出现透明圈，根据透明圈大小还能判断产酶活力。

三、实验器材与试剂1 样品土壤样品。

2 培养基酪素培养基配方如下：葡萄糖0.5gNaCl 5gK2HPO4 0.5gKH2PO4 0.5g干酪素10g蒸馏水1000ml琼脂20gpH 7.5115℃灭菌30min。

实验一产蛋白酶菌株枯草芽孢杆菌的分离一、教学目标及基本要求1. 学习从各种样品中分离微生物的操作技术2. 掌握分离微生物时定性测定产物的筛选方法3. 学习和掌握枯草芽孢杆菌的分离技术4. 掌握高产蛋白酶菌株的初筛方法二、实验原理枯草杆菌是属于芽孢杆菌属的一类细菌。

枯草芽孢杆菌的分布十分广泛，主要存在于土壤或腐烂的稻草之中。

由于能够形成芽孢，因此能够抵抗高温，低温等不良环境，所以是实验室及工业生产中主要污染菌之一，危害极大。

但是许多枯草芽孢杆菌能分泌蛋白酶、淀粉酶、抗菌素等物质，是工业酶制剂生产的重要菌种。

例如，我国使用的BF7658枯草芽孢杆菌生产а-淀粉酶，用于淀粉水解，纺织品退浆等。

又如AS1398枯草杆菌是生产蛋白酶的重要菌株。

1. 枯草芽孢杆菌的芽孢耐热的特点。

由于芽孢具有较强的抗高温能力，分离纯化时可采用热处理的方法，即通过高温加热杀死其中不生芽孢的菌种，使耐热的芽孢菌得到富集。

2. 枯草芽孢杆菌的产酶特征。

利用枯草芽孢杆菌产生水解酶的特性，可以选择酪蛋白或淀粉为主要营养成分的分离培养基，因菌体分泌的酶可以将大分子的蛋白或淀粉水解而在菌落周围形成透明圈。

根据透明圈直径(H)和菌落直径(C)之比值(H/C)可以初步确定酶活力，其比值越大，酶活力越高，进而可筛选出高产酶活的菌株。

3. 枯草芽胞杆菌的形态特征枯草芽孢杆菌的细胞大小0.7×2～3 μm，营养细胞为杆状，杆端钝圆、单生或者短链，着色均匀，无荚膜，周边运动，革兰氏染色阳性。

有芽孢0.6×1～1.5 μm，芽孢中生或近中生，壁薄，不膨大，孢子呈椭圆或长筒形，常为两端染色。

菌落变化很大，枯草芽孢杆菌在麦芽汁琼脂培养基斜面上，菌落呈细皱状，干燥或颗粒状。

在土豆培养基上菌落呈细皱状，干燥，有时呈现天鹅绒状的菌苔，在液体培养基表面形成银白色的菌膜。

菌落粗糙，扁平、扩展，不透明，不闪光，表面干燥，污白色或微带黄色。

4. 枯草芽胞杆菌的生理生化特性枯草芽孢杆菌能够液化明胶，冻化牛乳，还原硝酸盐，不产生吲哚，H2S，V-P反应阳性，水解淀粉。

蛋白酶产生菌的分离鉴定及筛选。

蛋白酶产生菌的分离鉴定和筛选可以按照以下步骤进行：1.样品收集：从环境样品（如土壤、水样、发酵物等）中收集样品，注意收集样品需要符合生物安全和伦理规范。

2.分离菌株： a. 样品处理：将样品进行适当的稀释处理，以获得适量的单菌落。

b. 培养基选择：根据目标酶的特性，选择合适的培养基进行菌株分离。

常用的培养基有LB（大肠杆菌培养基）、TSA（琼脂糖营养平板培养基）等。

也可以添加特定的底物来富集酶活菌株。

c. 接种和分离：将处理后的样品接种在选定的培养基上，并进行营养和环境条件的适当调整。

通过稀释分离法，将单菌落分离至不同的培养皿中，得到纯培养的菌株。

3.酶活性测定： a. 初步筛选：将分离的菌株进行初步筛选，通过对菌落的酶活性直接观察或使用浸润琼脂糖等方法判断酶的活性。

b. 液体培养：将筛选出的菌株进行液体培养，收集培养物用于后续的酶活性测定。

c. 酶活性测定：通过适当的酶活性测定方法（如改良的Casein酶活测定法、Azocasein酶活测定法等）来评估菌株的酶活性。

4.酶产量测定： a. 最优菌株筛选：根据酶活性测定结果，选择酶活性较高的菌株。

b. 酶产量测定：对选定的菌株进行批量发酵或连续发酵实验，通过酶活性和菌体生长曲线的测定，估计菌株的酶产量。

5.菌株鉴定： a. 形态学特征：观察菌落的形态学特征，如形状、颜色、质地等。

b. 生理生化特性：进行生理生化测试，包括生长方式、耐受性、产酸性、酶反应等。

c. 分子生物学鉴定：通过PCR方法扩增和测序16S rRNA基因，进行菌株的分子鉴定，并与已知菌株进行比对。

这些步骤将有助于从样品中分离、鉴定和筛选出蛋白酶产生菌株。

根据筛选结果，选择高酶活性和高酶产量的菌株，可以进行后续的酶性质研究、表达载体构建等工作。

在实践中，根据具体实验条件和要求，可能需要进行适当的优化和调整。

蛋白酶产生菌的分离鉴定及筛选1. 引言蛋白酶是一类能够降解蛋白质的酶，在许多工业领域具有广泛的应用价值。

因此，发现和筛选具有高蛋白酶产量的菌株成为了很多研究人员的关注点。

本文旨在介绍蛋白酶产生菌的分离鉴定及筛选的方法和步骤。

2. 蛋白酶分离菌株的采集蛋白酶产生菌株可以从各种环境中采集得到，常见的源包括土壤、水样、植物表面等。

采集时需要注意避免污染和样品间的干扰。

常用的采集方法包括无菌棉签擦拭、土壤样品采集等。

3. 蛋白酶分离菌株的分离和筛选3.1 培养基选择和制备蛋白酶分离菌株的分离需要选择合适的培养基，常见的培养基包括含蛋白质和多肽的培养基，如酵母提取物培养基、肉汤培养基等。

培养基制备时需要注意无菌操作，避免细菌污染。

3.2 菌株的分离将采集得到的样品均匀涂布在选定的培养基上，使用无菌棉签或铲子进行均匀涂布。

将涂布后的培养基培养于适宜的温度和时间下，一般常见的培养温度为30摄氏度。

3.3 蛋白酶活性筛选使用适当的蛋白酶活性指示剂，如casein等，在培养基上进行盘状培养。

通过观察培养基上蛋白质的降解情况，筛选出具有高蛋白酶活性的菌株。

此外，也可通过测定培养液中蛋白酶的活性来进行筛选。

4. 蛋白酶产生菌株的鉴定4.1 形态观察观察菌落的形态特征，如菌落的形状、颜色、透明度等，以及菌株的菌落生长速度等。

4.2 生理生化特性检测进行菌株的生理生化特性检测，包括产酸、产气、葡萄糖利用、氧需求等。

常用的方法包括气压油技术、碳水化合物利用酶技术等。

4.3 分子生物学鉴定采用分子生物学方法对菌株进行鉴定，如16S rRNA序列分析、PCR等。

将菌株的DNA提取出来，进行引物扩增，然后通过测序和序列比对，确定菌株的分类信息。

5. 结论通过蛋白酶产生菌的分离鉴定及筛选，可以获得具有高蛋白酶产量的菌株。

这些菌株在生物技术、食品工业等领域具有广泛的应用前景。

未来的研究可以进一步优化培养条件，提高菌株的蛋白酶产量，并应用于相关的工业生产中。

一株蛋白酶产生菌的鉴定、酶性质研究和表达载体构建一株蛋白酶产生菌的鉴定、酶性质研究和表达载体构建是一个涉及微生物学、生物化学和分子生物学等多个领域的综合性实验。

以下是该实验的详细步骤：一、蛋白酶产生菌的鉴定1.观察菌落的形态和颜色：将待鉴定菌株接种在固体培养基上，观察菌落的形状、大小、隆起程度、颜色等特征。

与已知蛋白酶产生菌的菌落特征进行比较，初步判断待鉴定菌株是否为蛋白酶产生菌。

2.显微镜观察：将待鉴定菌株进行显微镜观察，观察其细胞形态、大小、排列方式等特征。

与已知蛋白酶产生菌的显微镜特征进行比较，进一步确定待鉴定菌株是否为蛋白酶产生菌。

3.生理生化实验：进行一系列的生理生化实验，包括碳源利用实验、氮源利用实验、生长曲线测定、氧化还原实验等，进一步确定待鉴定菌株是否为蛋白酶产生菌，并对其生长特性和代谢特性进行研究。

4.分子生物学鉴定：提取待鉴定菌株的基因组DNA，进行PCR扩增和序列分析，与已知蛋白酶产生菌的基因序列进行比对，确定待鉴定菌株的分类地位和系统发育关系。

二、蛋白酶性质研究1.蛋白酶的分离纯化：从待鉴定菌株中提取蛋白酶，通过离子交换层析、凝胶过滤等手段进行分离纯化。

2.酶活性检测：设置合适的底物浓度和反应条件，测定蛋白酶的活性，包括最适pH、最适温度、动力学常数等。

3.酶稳定性研究：在不同温度、pH等条件下，检测蛋白酶的稳定性，确定其应用范围和使用条件。

4.底物特异性分析：通过蛋白质印迹实验、底物特异性分析等方法，研究蛋白酶的底物特异性，为其应用提供依据。

三、表达载体构建1.目的基因获取：通过PCR扩增或基因组测序等方法，获取蛋白酶基因。

2.载体选择：根据目的基因的特点和应用需求，选择合适的表达载体，如质粒载体、噬菌体载体、病毒载体等。

3.载体构建：将目的基因插入表达载体中，构建成重组表达载体。

可以采用DNA重组技术、定向进化技术等方法，对目的基因进行改造和优化。

4.转化宿主细胞：将重组表达载体转入合适的宿主细胞中，常用的宿主细胞包括细菌、酵母、昆虫细胞等。

蛋白酶产生菌的分离、活化选育、发酵及酶活力的测定许多细菌和霉菌产生蛋白酶，细菌中的芽孢杆菌是常见的蛋白酶产生菌。

本实验将土壤样品悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其它微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到酪蛋白平板进行培养，根据酪蛋白平板的水解圈做初筛。

也可直接将细菌或霉菌接种到酪蛋白平板进行培养，分离筛选其它蛋白酶产生菌。

本实验主要包括：蛋白酶产生菌的分离纯化、产酶微生物菌种的选育、产酶微生物的发酵与酶活力的测定、蛋白酶产生菌的生长及生长曲线、培养基优化。

通过本实验项目，使学生学会从自然界中分离蛋白酶产生菌的方法，菌种的纯化技术、高产菌的选育技术；了解蛋白酶产生菌的生长情况，学会绘制其生长曲线；学会培养基优化的方法；了解蛋白酶的性质及蛋白酶的测定原理；掌握蛋白酶的发酵及酶活力测定方法。

1 实验材料1.1 实验样品校园内土壤样品1.2实验仪器与材料牛肉膏蛋白胨培养基平板、酪蛋白平板、无菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液番红；显微镜、恒温水浴锅、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、血球计数板、试管、三角烧瓶、烧杯、量筒、，玻棒、电子天平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅、pH试纸（ pH 5．5—9．0）、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、培养皿、胶头滴管、分光光度计（应符合GB9721的规定）等。

2实验方法与步骤 2.1 培养基的配制方法1.称量按培养基配方比例依次准确地称药品放入烧杯中。

2.溶化在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。

待药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。

3.调pH4.分装按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内。

5．包扎塞好棉花的试管和锥形瓶应盖上厚纸用绳捆扎，用记号笔注明培养基名称、组别、日期。

6．灭菌将上述培养基以1.02kg/cm2（15磅/英寸2），121．3℃， 15-20min高压蒸汽灭菌。

如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。

蛋白酶产生菌细菌的分离与优化一、研究背景及进展蛋白酶已广泛应用在皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面。

皮革工业的脱毛和软化已大量利用蛋白酶，既节省时间，又改善劳动卫生条件。

蛋白酶还可用于蚕丝脱胶、肉类嫩化、酒类澄清。

临床上可作药用，如用胃蛋白酶治疗消化不良，用酸性蛋白酶治疗支气管炎，用惮性蛋白酶治疗脉管炎以及用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶对外科化脓性创口的净化及胸腔间浆膜粘连的治疗。

加酶洗衣粉是洗涤剂中的新产品，含碱性蛋白酶，能去除衣物上的血渍和蛋白污物，但使用时注意不要接触皮肤，以免损伤皮肤表面的蛋白质，引起皮疹、湿疹等过敏现象。

二、实验方案1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌株B1 分离自污水河的土壤；B9 为B1 物理诱变后所得的菌株。

1.1.2 药品弹性蛋白、刚果红弹性蛋白 Sigma 公司产品。

1.2 培养基1.2.1 细菌富集培养基(% W/V)蛋白胨1.0，酵母膏0.5，NaCl 1.0，pH7.0，121℃灭菌20min。

1.2.2 初筛培养基(% W/V)弹性蛋白0.80，葡萄糖0.10，酵母膏0.10，K2HPO4 0.10，KH2PO4 0.05，MgSO4·7H2O 0.01，pH7.0，115℃灭菌30min。

1.2.3 发酵培养基(% W/V)干酪素3.00，葡萄糖4.00，玉米提取液0.1，K2HPO4，0.20，MgSO4·7H2O 0.01，pH7.0，11℃灭菌30min。

1.3 胞外弹性蛋白酶产生菌的筛选方法1.3.1 细菌富集培养称取土样1 g ，加入细菌富集培养基中，送摇床培养，150r/min，37℃培养48h。

同时做两个平行实验。

1.3.2 分离将富集土壤悬液按每级稀释10 倍的次序得到10－ 3、10 － 4、10 － 5 的系列稀释液，再依次分别从各稀释度试管中各吸取0.2ml 稀释液，加到相应的培养皿内，用涂棒涂匀。

每个稀释梯度做两个平行试验，3 7 ℃培养箱倒置培养48h。

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以下是一篇关于土壤中微生物分离与纯化实验报告的示例文章，按照清晰的标题和不同级别的小节编写：实验报告：土壤中微生物的分离与纯化。

从土壤中分离纯化微生物实验报告
实验名称：从土壤中分离纯化微生物
实验目的：从土壤中分离纯化微生物，了解微生物的生长与繁殖规律，提高分离技术的实践能力。

实验步骤：
1. 采集土壤样品，从不同深度、不同地点取样，放入消毒过的容器中，避免污染。

2. 准备好细菌培养基，如Luria-Bertani（LB）培养基、营养琼脂培养基等。

3. 取少量土样，加入LB培养基中，振荡混合，放入42℃的恒温培养箱中培养。

4. 24小时后，观察培养基上是否有生长菌落，若有，则取一部分菌落接种到新的LB培养基上再次培养。

5. 重复以上步骤，直至获得单个菌种菌落。

用无菌线圈挑取单一菌落，接种到新的培养基上，进行进一步鉴定。

实验结果：从土壤样品中获得多种不同形态和颜色的微生物。

通过分离和纯化，最终得到单一微生物菌落。

实验结论：从土壤样品中分离纯化微生物能够获得纯净的菌落，为进一步鉴定和研究微生物提供了基础。

同时，这也证明了分离技术在微生物研究中的重要性和必要性。

蛋白酶是一类能够水解蛋白质的酶，在许多领域具有广泛的应用价值。

下面是蛋白酶产生菌的分离鉴定及筛选的一般步骤：
1. 样品采集：
-从自然环境（如土壤、水源等）或已知含有蛋白质的样品（如食品、发酵物等）中采集样品。

2. 分离菌株：
-将样品经过适当的稀释和处理后，通过平板法、液体培养法等方式进行分离培养。

-可以采用选择性培养基，如蛋白质含量较高的培养基，以筛选出潜在的蛋白酶产生菌。

3. 蛋白酶活性筛选：
-根据蛋白酶的活性特点，可使用含有特定蛋白质底物的琼脂糖平板或液体培养基，筛选出蛋白酶活性高的菌株。

-观察菌落周围的透明圈（即蛋白酶产生的溶解区），判断菌株对蛋白质的降解能力。

4. 纯化与鉴定：
-从具有蛋白酶活性的菌株中选择一个或多个进行进一步的培养和纯化。

-使用生化方法，如SDS-PAGE电泳、酶活性测定等，鉴定蛋白酶的分子量、酶活性和特性。

5. 分子鉴定：
-对蛋白酶活性高的菌株进行16S rRNA或其他适用的基因序列分析，以确定其属于的菌属和物种。

6. 筛选优良菌株：
-结合蛋白酶活性、稳定性、产酶量等指标，筛选出蛋白酶产量高、酶性好的优良菌株。

值得注意的是，在进行分离鉴定及筛选过程中，需要严格遵守微生物实验室操作规范，采取必要的无菌操作和消毒措施，确保实验安全。

此外，还可以利用分子生物学技术对蛋白酶基因进行研究，以进一步了解蛋白酶的产生机制和调控方式。

现代农业科技2021年第15期食品科学摘要蛋白酶是一种重要的工业用酶制剂。

本试验从土壤中筛选出1株产蛋白酶水平较高的菌株S-3,通过生理生化鉴定和16S rDNA 基因序列分析,鉴定其为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis )。

本试验为贝莱斯芽孢杆菌应用于蛋白酶生产提供了依据。

关键词蛋白酶;贝莱斯芽孢杆菌;菌种鉴定中图分类号TQ925.2文献标识码A 文章编号1007-5739(2021)15-0210-03DOI :10.3969/j.issn.1007-5739.2021.15.086开放科学(资源服务)标识码(OSID ):Isolation and Identification of a Protease-producing StrainWANG Shuai WANG Nannan XIANG Jiale SUN Dongmei *(School of Life Science and Technology,Heilongjiang Bayi Agricultural University,Daqing Heilongjiang 163000)Abstract Protease is an important industrial enzyme preparation.In this experiment,a strain of S-3with a high level of protease production was selected from the soil,and it was identified as Bacillus velezensis through physiological and biochemical identification and 16S rDNA gene sequence analysis.This experiment provided a basis for the application of Bacillus velezensis in protease production.Keywords protease;Bacillus velezensis ;strain identification一株蛋白酶产生菌的分离及鉴定王帅王楠楠向佳乐孙冬梅*(黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院,黑龙江大庆163000)蛋白酶是一类能催化肽键水解成氨基酸或短肽的酶类,广泛存在于动物、植物和微生物中,有着许多不同的生理功能[1]。

实验（内容）题目：蛋白酶产生菌的筛选及培养的优化院系生命科学技术学院专业生物技术年级2015级生物技术1班专升本蛋白酶产生菌的选育及发酵培养条件的优化一、实验目的1、学习从土壤中分离蛋白酶产生菌。

2、握分离纯化的方法，分离获得并纯化蛋白酶产生菌。

3、握正交优化的方法和步骤。

二、实验原理许多细菌和霉菌产生蛋白酶，细菌中的芽孢杆菌是最常见的蛋白酶产生菌。

本实验将土壤样品悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其他微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到奶粉培养平板并进行培养，根据奶粉平板的水解圈做初筛。

将初筛的蛋白酶产生菌接入产酶培养基振荡培养，测定蛋白酶的活力，最终得到产蛋白酶的芽孢杆菌。

也可直接将细菌接种到奶粉培养平板进行培养，分离筛选其他蛋白酶产生菌。

三、实验器材1、材料：土壤样品2、试剂：牛肉膏蛋白胨培养基及平板、奶粉培养基及平板、45mL 无菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液、 3、仪器及用具：紫外分光光度计、显微镜、恒温水浴锅、摇床、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、量筒、容量瓶、漏斗、试剂瓶、漏斗、载玻片、滤纸、擦镜纸。

四、实验步骤（一）配制所需培养基1、牛肉膏蛋白胨固体培养基：牛肉膏 0.5g，蛋白胨 1g，NaCl 0.5g，琼脂 1.5～2.0g，水 100ml，pH 7.22、奶粉培养基：牛肉膏 0.5g，蛋白胨 1g，NaCl 0.5g，琼脂 2.0g，水 100ml，pH 7.0～7.2 脱脂奶粉 3g，3、牛肉膏蛋白胨液体培养基：牛肉膏 0.5g，蛋白胨 1g，NaCl 0.5g，水 100ml，pH 7.24、发酵培养基：葡萄糖6.0g,硝酸钠4.0g，磷酸二氢钾0.03g,碳酸钠0.1g,磷酸二氢钠0.4g加水100ml（二）分离1、采集土壤样品，用无菌制备1:10土壤悬液。

2、取1:10土壤悬液5 mL，注入已灭过菌的试管中，将此试管放入75～80℃水浴中热处理10min以杀死非芽孢细菌。

土壤中产蛋白酶芽孢杆菌的筛选一、实验目的要求1、了解微生物分离纯化的原理及微生物分离纯化常用方法和技术2、掌握从土壤中筛选产蛋白酶菌株的原理及方法3、学习用选择平板从自然界中分离胞外蛋白酶产生菌的方法4、培养学生自行设计实验流程、综合分析解决问题及判断实验结果的能力二、实验基本原理土壤微生物类群在全球自然生态系统中具有不可替代的作用，它推动着生态系统的能量流动和物质循环，是生态系统的重要组成部分。

芽孢杆菌属是一类好氧或兼性厌氧、产生抗逆性内生孢子的杆状细菌，多数为碱性菌，主要分布于土壤、动植物体及水体中。

微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落，通常是由一个细胞繁殖而成的集合体。

因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。

从而得到所需的菌株。

并且自能够产生胞外蛋白酶的菌株在牛奶平板上生长后，其菌落周围可形成明显的蛋白水解圈。

水解圈与菌落直径的比值，被作为判断该菌株蛋白酶产生能力的初筛依据。

三、实验材料和试剂器具和其他用具：盛有9ml无菌水试管4支、培养皿10个、锥形瓶250ml、500ml各一个、无菌移液管4根、吸管、玻璃涂棒、电子天平、水浴锅、恒温培养箱、烧杯、报纸、土壤样品、高压灭菌锅、记号笔、显微镜、载玻片、盖玻片、酒精灯、接种环、尺子。

试剂：蛋白胨、牛肉膏、Nacl、琼脂、脱脂奶粉、酵母膏、葡萄糖、(NH4)2SO4、MgSO4.7H2O、K2HPO4、香柏油、二甲苯。

（注：牛奶平板、牛肉膏蛋白胨培养基、淡薄培养基）革兰氏染色：革兰氏染色、草酸铵结晶紫染液、碘液、95%乙醇、番红复染液芽孢染色：5%孔雀绿水溶液、0.5%番红水溶液1、取样在家畜饲养的地方，从地表下10~15cm的土壤中用无菌小铲取土样，并记录取样的地理位置。

2 、采集取一小方土样均匀在纸上，然后再纸的四角和中心各取2g土壤样品，混匀形成10g土样。

3 、灭菌将10g土样放入100ml无菌水中并置于250ml的三角瓶中，然后放入水浴锅中加热（80℃）处理10min。