自动化分析 (免疫比浊)

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自动化分析-(免疫比浊)

自动化免疫比浊
➢免疫比浊分析技术发展
两测定Biblioteka 原抗体形成后的阶段个测定抗原抗体结合的峰值
散射(终点)比浊
阶
段
速率散射比浊
散射比浊法:
当一束光
在光源的光路方向（50-960）
免疫比浊
线通过溶液受到光散射和光吸收两个
角的方向上测量透射光强度和被检测溶液中微粒浓度关系的方法。
法
因素的影
➢对抗原过量进行阈值限定先测定预反应时段抗原-抗体复合物的散射光信号，若未超过阈值，可进行全量样本测定。若超过阈值，提示样品浓度过高，需稀释后测定。
三、速率散射比浊分析
三、速率散射比浊分析（一）基本原理
— 是测定抗原抗体结合反应的动态过程。
— 所谓速率，是在单位时间内抗原抗体结合形成复合物的速度。将各单位时间内形成复合物的速率及测定的散射信号连接在一起，即是动态的速率比浊分析。
平光线
散射光θ
透射光
检测器检测器
光源透镜滤光片
散射比浊、透射比浊光路图
实验要求（了解）
❖ 溶液中形成的复合物分子应足够大(35-100nm) ❖ 溶液中形成的复合物分子要足够多 ❖ 控制抗原抗体反应的温度和时间 ❖ 加促凝剂，提高复合物形成速度，缩短检测时间 ❖ 应选择亲和力好、效价高的抗体，保证抗体过量 ❖ 将标准品稀释至少5个浓度测定，以吸光度值(A)
Rayleigh原理：即散射光的强度与复合物的量呈正比，与散射光的夹角呈正比，与波长呈反比。
在散射比浊中，增加抗原-抗体复合物的体积，减小入射光的波长，扩大散射光夹角等因素，均可增加检测的敏感度。
（二）反应物含量与散射浊度
Heidelberger曲线

免疫自动分析技术

镧系元素荧光特点：
荧光寿命极长镧系元素螯合物（60~900 us) <铕：714us> 普通荧光免疫中荧光团：1~100us 样本中蛋白质荧光：1~10us，易猝灭。
Stokes位移大（大约280nm）铕：发射光613nm、激发光340nm，荧光素的Stokes位移为280nm
荧光特异性强（发射光谱带很窄：615± 5nm）解离-增强技术可使其荧光性提高100万倍
免疫自动分析技术
免疫自动化分析系统（automation of immunoassays）
免疫自动化分析
免疫自动化分析结构
主要内容
一、概述二、自动化免疫浊度分析系统三、自动化发光免疫分析系统四、自动化免疫荧光分析系统五、自动化酶联免疫分析系统六、免疫自动化仪器选择与应用
第一节自动化免疫浊度分析系统
➢肿瘤标志物检查 AFP、CEA、CA-50、PSA、hTg、β2-micro、NSE PAP、CA-242、PSA（total/free）、PSA EQM CA-199*、CA-125*、CA-153*、CA-724*
➢ 妇产科检查 FSH、LH、hCG、Prolactin、E3、E2、 Testosterone、Progesterone、SHBG
• Eu3+在游离状态下，荧光信号很弱，并容易被水淬灭。
解离-增强技术
➢ Eu3+解离后迅速与β-二酮体螯合，进入胶束内核，形成一个大分子微囊--新的稳定螯合物。
➢大分子微囊个外端是亲水基团，内端是疏水基团。
➢激发后荧光信号增强可达100万倍。
七、方法学评价
1、灵敏度高。 2、线性宽，4~5个数量级。 3、稳定，有效期长。 4、安全，无放射性污染。 5、易于自动化。缺点：对环境要求高、易受环境、试剂和容器中的镧系元素离子污染。

《免疫比浊分析》课件

案例三
总结词
辅助诊断、判断病情
详细描述
自身免疫性疾病是一类复杂的疾病，免疫比浊分析可以检测出自身抗体，辅助医生进行诊断和判断病情。通过检测自身抗体水平，有助于了解疾病的活动度和治疗效果。
THANKS
感谢观看
06
案例分享：免疫比浊分析在疾病诊断中的应用
案例一
总结词
准确、快速、敏感
详细描述
免疫比浊分析在乙肝病毒检测中表现出高准确性和高敏感性，能够快速检测出乙肝病毒的抗原和抗体，为乙肝的诊断和治疗提供了有力支持。
案例二
总结词
早期发现、监测病情
VS
详细描述
免疫比浊分析用于检测肿瘤标志物，有助于肿瘤的早期发现和病情监测。通过定期检测肿瘤标志物水平，可以及时发现肿瘤复发或转移，为制定治疗方案提供依据。
结果解读
根据实验结果，结合专业知识，对结果进行解读和解释，为临床诊断和治疗提供依据。
03
免疫比浊分析的仪器与试剂
仪器介绍
仪器类型
介绍免疫比浊分析中常用的仪器类型，如分光光度计、全自动生化分析仪等。
工作原理
阐述仪器的工作原理，如光线通过溶液时发生散射、吸收等现象，用于测量物质浓度。
仪器参数
研究进展与展望
• 自动化程度提高：仪器设备的自动化程度不断提高，减少了人为误差和操作时间。
研究进展与展望
标准化和规范化
建立统一的检测标准和方法，提高不同仪器和试剂间的可比性。
智能化发展
结合人工智能、大数据等技术，实现检测结果的自动分析和解读。
应用拓展
拓展免疫比浊分析在临床诊断、生物医药等领域的应用范围。
实验注意事项
仪器维护

免疫沉淀类试验——免疫比浊

免疫浊度测定
微生物与免疫教研室
沉淀反应（precipitation）
可溶性抗原与相应抗体在适当条件下发生特异性结合所出现的沉淀现象。
分类
絮状沉淀试验液体内沉淀试验环状沉淀试验
沉
免疫浊度测定
淀
反应
单向免疫扩散试验免疫扩散验
免疫电泳
火箭免疫电泳对流免疫电泳
免疫浊度测定
1 抗原抗体比例
1. 高剂量钩状效应（high dose hook effect )
2. 海德堡（heidelberger）曲线理论
2 抗体的质量
（1）特异性高（2）效价高（3）亲和力高（4）抗血清来源
3 抗原抗体反应的溶液
• pH 6.5~8.5
• 电解质离子强度、种类（磷酸盐缓冲液）
（二）类型
1. 透射免疫比浊法
通过检测光被吸收、衍射、反射和折射后光线减弱的变化来衡量抗原抗体的复合物。
2、散射免疫比浊法
通过检测光折射和衍射而形成的散射光强度来定量抗原抗体的复合物。
3、免疫胶乳比浊法
以胶乳作为载体对小分子免疫复合物进行微量测定，进一步提高了免疫浊度测定的灵敏度。
1 透射免疫比浊法
概念：将现代光学测量仪器与自动化分析检测系统相结合应用于沉淀反应，可以对各种液体介质中的微量抗原、抗体和药物及其他小分子半抗原物质进行定量测定。
（一）免疫浊度分析的基本原理：
• 抗原、抗体在特定的电解质溶液中反应，形成小分子免疫复合物(<19S)，在增浊剂(如聚乙二醇( PEG)、NaF等)的作用下，迅速形成免疫复合物微粒(>19S)，使反应液出现浊度。在抗体稍微过量且固定的情况下，形成的免疫复合物量随抗原量增加而增加，反应液的浊度亦随之增大，即待测抗原量与反应溶液的浊度呈正相关。用一系列已知浓度的抗原标准品同时进行试验，制备剂量反应曲线，即可计算出标本中抗原的含量

临床免疫学：第七章免疫比浊技术

絮状沉淀试验
液体内沉淀反应
环状沉淀试验
沉淀反应
单向扩散试验
凝胶内沉淀反应双向扩散试验
免疫电泳
免疫电泳技术
免疫固定电泳
免疫比浊技术
免疫比浊技术的分类
• 所检测的光信号性质
透射免疫比浊散射免疫比浊
终点法 • 测定时间
速率法
无增敏 • 增敏剂 PEG增敏
胶乳增敏
透射免疫比浊法
• 基本原理
• 一定波长的光线通过抗原抗体反应的溶液时，由于抗原抗体复合物的形成使入射光被反射、吸收，透射光减少，光吸收量增多。
• Mie散射(d ＞λ)
散射免疫比浊法
散射免疫比浊法
• 免疫复合物形成的散射光多数属于Rayleigh散射，其光强度计算公式为：
适当增加抗原-抗体的体积，减少入射光的波长，减小检测角度，以及使用激光、较短波长等高强度光源作为入射光，都可提高检测灵敏度。
（θ=0 ？）
散射免疫比浊法的类型
• 5、抗体亲和力好、效价高，且保证过量；
透射免疫比浊法
• 方法评价
• 1、操作简单，重复性好，结果较准确； • 2、能用全自动或半自动化仪器进行检测； • 3、灵敏度比单向免疫扩散法高5～10倍，但
是比散射免疫比浊法低； • 4、要求抗原抗体复合物分子应足够多、足
够大，故耗时长。
根据透射光减弱的原理来定量，分子太小则入射光直接通过，只能测定抗原-抗体反应的第二阶段。
累计时间（s）形成IC总量速率
5
8
－
10
13
5
15
25
12
20
60
35
25
150
90

免疫比浊检验技术原理

在临床、生命科学研究和生物工业等领域得到了广泛应用。
自动化检测
免疫比浊检验技术可以与自动化仪器配合使用，提高检测效率和准确性。
免疫比浊检验技术的原理
在免疫比浊检验技术中，检测物质与特异性抗体结合形成免疫复合物，这些复合物会在溶液中形成可见的浑浊度，浑浊度与物质浓度呈正相关。
免疫比浊检验技术的步骤
3
样本准备要求高
样本的预处理对测量结果有一定影响，样本准备要求较高。
免疫比浊检验技术的未来发展方向
未来，免疫比浊检验技术有望进一步发展，结合新的成像和数据处理技术，实现更高的灵敏度和准确度，以满足更多领域的需求。
在药物研发过程中，可以用于评估药效和药代动力学。
3 环境监测
用于检测环境中的毒性物质，保护人类健康和环境安全。
免疫比浊检验技术的优点
准确度高
相对传统的比色法和酶联免疫吸附法，免疫比浊检验技术具有更高的准确度。
快速得出结果
免疫比浊检验技术通常只需要几分钟到几小时，可以得到快速的检测结果。
免疫比浊检验技术原理
免疫比浊检验技术是一种基于光学原理的生化分析方法，通过测量溶液中悬浮颗粒的浑浊度来确定其对应的分析物浓度。
免疫比浊检验技术的定义
快速、灵敏
通过相对简单的操作流程，可以快速检测样本中微量物质的浓度。
数量测定
可以准确测定血液、尿液、唾液等生物样本中的特定分析物的浓度。
广泛应用
1
样本预处理
将待测样本进行预处理，如离心、稀释等，以提高结果的准确性。
2
免疫反应
将样本与特异性抗体一起反应，允许免疫复合物形成。
3
测量浑浊度
利用光学仪器测量样品溶液的浑浊度，得到测量结果。

自动生化分析仪的分析参数设置

自动生化分析仪的分析参数设置自动生化分析仪是一种把生化分析中的取样、加试剂、去干扰物、混合、恒温反应、自动监测、数据处理以及实验后清洗等步骤进行自动化操作的仪器，它完全模仿并代替了手工操作，目前已经成为医疗机构进行临床诊断所必可不少的仪器之一。

它的应用大大提高了生化检验的准确性、精密度和工作效率，适应了临床医学发展对检验医学的要求，然而这一切不仅需要生化分析仪的技术基础，也需要仪器内每个项目都有一组最优化的分析参数。

并且目前大多数生化分析仪为开放式，封闭式的仪器一般也会另外留一些检测项目的空白通道由用户自己设定分析参数，因此我们有必要了解生化分析仪各个分析参数的基本含义以及设置方法。

1.试验名称常以项目的英文缩写来设置，如总蛋白设置为TP，白蛋白设置为ALB等。

2.方法类型生化分析仪常用的方法有终点法、连续监测法、比浊法等，根据被检物质的检测原理等选择其中一种分析方法。

2.1终点法又称为平衡法，是基于反应达到平衡时反应产物的吸收光谱特征及其对光吸收强度的大小对物质进行定量分析的一类方法，有一点终点法和两点终点法两类。

一点终点法的特点是使用一种或两种试剂，当待测物与试剂反应达到终点时，测定混合溶液的吸光度来计算待测物的浓度，该法常用的有总蛋白双缩脲法、白蛋白溴甲酚绿法、葡萄糖氧化酶法等，手工操作的大多数方法都是一点终点法。

两点终点法也称固定时间法，如果是单试剂分析，当测定波长同干扰物质的吸收光谱有重叠时，通过选用两点终点法可消除样品空白引起的干扰，其分析过程是在样品与试剂混合后经过一段延滞期读取一个点A1，一定时间后再读取A2，然后比较标准和测定的ΔA（ΔA=A2-A1）值，求得待测物的浓度。

肌酐苦味酸法就是一个典型的单试剂两点法的例子。

如果是双试剂分析，选用二点终点分析法除了可消除样品空白引起的干扰外，还可消除内源性干扰物质的干扰，其分析过程是加入试剂1后读取A1，加入试剂2后读取A2，A1相当于读出样品空白值，A2才是实际呈色反应，然后比较标准和测定的ΔA（ΔA=A2-A1）值，求得待测物的浓度。

散射免疫比浊法

第六章免疫比浊分析
目
录
第一节免疫比浊技术原理第二节自动化免疫比浊分析
第三节小结
第一节
免疫比浊技术原理
免疫比浊技术分类：
透射免疫比浊法
（turbidimetric immunoassay）
散射免疫比浊法
（nephelometry immunoassay）
终点散射比浊法速率散射比浊法
一、透射免疫比浊法
8 13 25 60 150 230 300 360 415 450 480 500 — 5 12 35 90 80 70 60 55 45 30 20
（二）技术要求
速率散射比浊法峰值出现的时间与抗体浓度及纯度直接相关，需选用抗体纯度及亲和力交高的试剂。此外，要保证待测样本血清的性状符合要求，如严重脂血等即为不合格样本。
（三）方法学评也小，因此结果稳定、可靠，特异性好，精确度高，且不需要特殊的仪器设备，一般分光光度计、自动化生化分析仪或散射比浊仪均可使用。
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第二节自动化免疫比浊分析
一、主流免疫比浊设备概况
（一）BN特种蛋白分析测定系统 1.测定原理该系统的测定方法是透射免疫比浊法的一种
（三）方法学评价
该法具有快速、敏感度及精密度高的特点，其最大优点在于快速，检测不必等到抗原抗体达到平衡，大大节省反应时间，每小时可检测标本数十份；敏感度高，最小检出量达微克/ 升水平。
四、免疫胶乳比浊法
（一）基本原理将抗体吸附在大小适中、均匀一致的胶乳颗粒上，制成致敏的胶乳颗粒，当遇到相应抗原时，发生交联反应，形成抗原抗体复合物，胶乳颗
抗原抗体反应曲线
二、散射免疫比浊法
（一）基本原理
散射比浊法是指一定波长的光沿水平轴照射，

免疫比浊检验技术原理与进展

新型免疫比浊法研究动态
纳米颗粒增强免疫比浊法
01
利用纳米颗粒的高比表面积和光学性质，提高抗原抗体复合物
的浊度变化，从而提高检测灵敏度。
均相免疫比浊法
02
在反应体系中直接加入抗原抗体复合物，通过浊度变化检测待
测物，无需分离步骤，简化实验操作。
多重免疫比浊法
03
同时检测多个目标物，提高检测通量和效率，满足临床多样化
需求。
存在问题与挑战分析
抗原抗体复合物稳定性
复合物在反应体系中的稳定性直接影响浊度变化的准确性和可重复性，需要优化复合物制备和保存条件。
非特异性干扰
血清等样本中的非特异性物质可能干扰免疫比浊反应，导致结果误差，需要采取相应措施降低干扰。
自动化与标准化
当前免疫比浊法操作仍较为繁琐，需要进一步提高自动化程度，同时推动标准化进程，以确保结果的准确性和可比性。
肿瘤标志物检测中的应用
01
肝癌
通过检测甲胎蛋白（AFP）等肿瘤标志物，可辅助诊断肝癌及判断其预后。
卵巢癌
02
03
前列腺癌
免疫比浊法可检测癌抗原125 （CA125），用于卵巢癌的诊断和病情监测。
通过检测前列腺特异性抗原（PSA），有助于前列腺癌的早期发现和诊断。
05 免疫比浊法研究进展及挑战
探讨了免疫比浊检验技术在临床实验室中的应用，如特定蛋白的测定、药物监测等，并强调了质量控制的重要性和实施方法。
对未来发展趋势的展望
自动化与智能化
多项目联合检测
随着科技的进步，未来免疫比浊检验技术将更加自动化和智能化，提高检测效率和准确性。
开发能够同时检测多个项目的免疫比浊试剂盒，以满足临床实验室对于高通量、高效率的检测需求。

临床医学检验技术(士)：免疫检验自动化仪器分析考点

临床医学检验技术(士)：免疫检验自动化仪器分析考点1、单选测定内分泌激素、肿瘤标志物和治疗性药物浓度方面应用最广泛的新技术为（）A.免疫散射比浊分析B.时间分辨荧光免疫分析C.速率散射比浊分析D.免（江南博哥）疫透射比浊分析E.化学发光免疫分析正确答案：E参考解析：免疫散射比浊法是最早应用于临床的自动化免疫分析技术；速率散射比浊分析是以沉淀反应为基础，最早应用于检测抗原抗体反应第一阶段的自动化免疫分析技术；化学发光免疫分析是测定内分泌激素、肿瘤标志物和治疗性药物浓度方面应用最广泛的新技术。

2、单选特种蛋白免疫分析仪是基于抗原-抗体反应原理，不溶性免疫复合物可使溶液浊度改变，再通过浊度检测标本中微量物质的分析方法。

产生伪浊度的主要因素（）A.抗体的非特异性交叉反应性B.增浊剂浓度过低C.反应时间不合适D.仪器故障E.抗原过剩正确答案：A3、单选特种蛋白免疫分析仪是基于抗原-抗体反应原理，不溶性免疫复合物可使溶液浊度改变，再通过浊度检测标本中微量物质的分析方法。

免疫浊度分析的必备试剂不包括（）A.多抗血清（R型）B.高分子物质增浊剂C.20%聚乙二醇D.浑浊样品澄清剂E.校正品正确答案：C4、单选免疫比浊分析的影响因素包括（）A.抗原抗体比例和抗体的质量B.增浊剂的使用C.伪浊度D.入射光光源和波长E.以上均是正确答案：E参考解析：免疫比浊分析的影响因素包括：抗原抗体比例；抗体的质量；增浊剂的使用；伪浊度；入射光光源和波长；结果报告中的计量单位；标准曲线制备与质量控制。

5、单选化学发光酶免疫分析的反应中，对鲁米诺起催化作用的酶是（）A.HRPB.ALPC.AHPPDD.PR3E.β-Gal正确答案：A参考解析：对鲁米诺起催化作用的酶是HRP。

用HRP标记抗原或抗体，与待测标本反应后形成酶标记抗原-抗体复合物，作用于鲁米诺产生发光效应。

6、单选目前临床治疗药物监测最常采用的方法为（）A.FPIAB.荧光酶免疫分析C.TRFIAD.ELISAE.免疫比浊分析正确答案：A参考解析：荧光偏振免疫分析法(fluorescence polari-zation immunoassay，FPIA)是一种定量免疫分析技术，其基本原理是荧光物质经单一平面的蓝偏振光(485nm)照射后，吸收光能跃入激发态，随后回复至基态，并发出单一平面的偏振荧光(525nm)。

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溶液中形成的复合物分子应足够大(35-100nm)
溶液中形成的复合物分子要足够多
控制抗原抗体反应的温度和时间加促凝剂，提高复合物形成速度，缩短检测时间
应选择亲和力好、效价高的抗体，保证抗体过量
将标准品稀释至少5个浓度测定，以吸光度值(A) 为纵坐标，浓度为横坐标，在半对数纸上绘出标
概括：免疫比浊测定原理，以及影响免疫比浊的因素。
原理：免疫当可溶性抗原与相应抗体特异结合，二者比例
合适时，在特殊的缓冲液中它们快速形成一定大小的抗原抗体复合物，使反应液体出现浊度。利用现代光学测量仪器对浊度进行测定从而检测抗原含量。
影响因素：抗原抗体的比例，反应体系中保持抗体过量；抗体的质量，要选择特异性强、效价高、亲和
临床免疫学检验
吉林医药学院检验学院
免疫检验自动化分析仪
免疫比浊分析的临床应用பைடு நூலகம்
血浆、体液中特种蛋白
如免疫球蛋白IgG、IgA、IgM
检范围测
、；补体C3、C4；血浆蛋白AAT、TRF、A1M、 CER、HPT、PAB、ALB；炎性反应蛋白 SAA、CRP；载脂蛋白 APO、ABI；尿蛋白系列小分子治疗药物
即当抗体量恒定时，形成的抗原抗体复合物的反应与散射信号响应值的上升呈正比。同时，散射信号随抗原抗体反应时间增加而曲线上升。当抗原量与响应值上升到一极限时，再增加抗原量，使散射响应值迅速下降
散射比浊测定时，一定要保证抗体过量。
二、定时散射比浊分析
（一）基本原理
1.是将沉淀反应与散射比浊分析相结合，“在抗原抗体反应几秒钟后开始测定峰值信号”。 2.目的是排除抗原抗体反应的不稳定性，降低检测误差。 3.采用抗体过量，以获得颗粒产生的最强的散射光信号。
检测时分间两个
在预反应时段，加小量样本与抗体反应，测定第一次散射光信号值
加全量样本，约反应 2分钟后，第二次测定散射光信号
信号峰值
计算机处理转换为样品浓度
（二）抗原过量检测
采用两项保证措施：
抗体过量
在检测中抗体结合抗原的能力可达到相当于正常血清的50倍以上，以保证高浓度样本中的抗原与抗体的结合。
Mile散射
颗粒直径接近入射光的波长，其散射光的分布呈明显不均匀
Rayleigh原理：即散射光的强度与复合物的量
呈正比，与散射光的夹角呈正比，与波长呈反
比。在散射比浊中，增加抗原-抗体复合物的体积，减小入射光的波长，扩大散射光夹角等因素，均可增加检测的敏感度。
（二）反应物含量与散射浊度
Heidelberger曲线
水平轴照射在粒子颗粒上时，光线被颗粒吸收或折射，发生偏转.散射光的强度与复合物的含量成正比，即待测抗原越多，
影响散射信号的因素(了解) 如入射光的波长、偏振、
形成的复合物越多，散
射光就越强。
微粒大小、浓度、质量、
以及检测点的距离。
（一）散射颗粒与散射光
Rayleigh散射
颗粒直径比入射光波长小的多，散射光的分布比较均匀。
散射比浊法: 在光源的光路方向（50-960）角的方向上测量透射光强度和被检测溶液中微粒浓度关系的方法。
透射比浊法: 在光源的光路方向（00）测量透射光强度和被检测溶液微粒浓度关系的方法。
一、散射免疫比浊分析原理
散射比浊法：在液相中可溶性抗原、抗体特异性
结合，形成一定大小的复合物粒子，当入射光沿
准曲线，
力强的多抗；抗原抗体反应的溶液，合适的PH（6.5～8.5）和离子强度；使用增浊剂可增强检测信号。
自动化免疫比浊
免疫比浊分析技术发展两个阶段
测定抗原抗体形成后的阶段散射(终点)比浊
测定抗原抗体结合的峰值速率散射比浊
免疫比浊法分类
当一束光线通过溶液受到光散射和光吸收两个因素的影响而使光的强度减弱
四、免疫透射比浊分析（一）基本原理当光源的光路（角度与正前方夹角为00时），通过一定体积的溶液，由于溶液中抗原抗体结合复合物粒子对入射光因反射、吸收或散射而衰减。透射光的强度和形成的复合物的量呈反比。
平光线射光散
检测器检测器
θ
透射光光源透镜滤光片
散射比浊、透射比浊光路图
实验要求（了解）
对抗原过量进行阈值限定
先测定预反应时段抗原-抗体复合物的散射光信号，若未超过阈值，可进行全量样本测定。若超过阈值，提示样品浓度过高，需稀释后测定。
三、速率散射比浊分析
三、速率散射比浊分析（一）基本原理
— 是测定抗原抗体结合反应的动态过程。 — 所谓速率，是在单位时间内抗原抗体结合形成复合物的速度。将各单位时间内形成复合物的速率及测定的散射信号连接在一起，即是动态的速率比浊分析。 — 当仪器测定到某一时间内形成速率下降时，即出现速率峰，该峰值的高低，即代表所测抗原的量。

自动化分析 (免疫比浊)

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