免疫比浊法检测免疫球蛋白
一、实验目的
利用免疫比浊法绘制标准曲线，并检测样品中免疫球蛋白的浓度。
（本小组检测的为IgG样品）
二、实验原理
1.抗原抗体反应(Antigen-antibody reaction)：抗原与其刺激机体产生的相应抗体在体内或体外发生特异性结合的反应。
反应特点有：特异性、比例性、可逆性、敏感性。
影响因素有：电解质、温度、酸碱度。
2.免疫比浊法：合适比例的抗原抗体形成的免疫复合物，在PEG作用下形成微粒，使样品浊度发生变化。
当一束光线通过溶液受到光散射和光吸收两个因素的影响而使光的强度减弱，根据光的强度改变可测得微粒浓度。
分类：①透射比浊法（Transmission tubidimetry）当一定波长光线通过浊度发生变化的反应混合物时，由于被不溶性免疫复合物吸收而减弱，故在一定范围内吸光度与免疫复合物量呈正相关。
当抗体浓度固定（过量），样品的浊度与其中所含抗原量成正比。
（特点）透射比浊操作简便，适用于普通的自动生化分析仪和普通的分光光度计，几乎所有的实验室均能开展。
不足的是灵敏度和精密度均不够理想，所需的抗血清量大，检测的时间较长。
②散射比浊法（Nephelometry）光线通过检测溶液时，被其中所含的抗原抗体复合物折射而部分偏转，产生散射光，其强度与复合物的数量和散射夹角成正比，与光的波长成反比。
（特点）优点是灵敏度、精密度均较高，检测快速。
其缺点是需特定的分析仪器，试剂价格高。
本实验采用透射法。
3.聚乙二醇PEG的作用：在免疫反应中，为增强抗原抗体反应常使用增聚剂，3~4％的聚乙二醇，可破坏抗原抗体的水化层，促进抗原抗体靠近反应，但如浓度不适合，会影响其它溶质或产生非特异性聚集影响结果。
三、实验材料
免疫球蛋白A,G(IgA,IgG)测定试剂(试剂1[PEG]，试剂2[羊抗人IgA, IgG]）（1管/每组）免疫球蛋白A, G(IgA,IgG)校准品，蒸馏水，血清样本（1管）
微量加样枪、ep管（1.5mL离心管）
酶标仪、水浴箱
四、实验步骤
1.在7个EP管中各加250µL IgG试剂1（PEG）。
2.7管分别加入蒸馏水、校准品原液、1：2校准品、1：4校准品、1：8校准品、1：16校准品、样本各2μL。
3.混匀后37℃水浴5min。
4.7管各加入85μL IgG试剂2（羊抗人IgG）。
5.混匀后37℃水浴10min。
6.分别吸取200µL至96孔酶标板中，用酶标仪在700nm处读取OD值。
五、实验结果与数据处理
2.标准曲线
3.样本浓度：y=0.604代入x=26.648g/L
由此得稀释之前样本的浓度为79.945g/L
误差：（79.945-34.8）/34.8*100％=129.73%
误差分析：
①抗原抗体反应需要一定孵育时间和温度，而操作中由于加样的速度限制，无法严格控制各管的反应时间；本次制作标准液时量极小，很有可能出现未混匀、挂壁的情况；标准液吸取量小会导致移液枪的误差被放大。
②免疫比浊法的基本原理是基于抗原抗体结合，而这个结合反应有特殊性，只有在一定范围浓度中，两者比例合适时检测结果才准确，否则会产生带现象，已有文章表明，稀释前后检测结果偏差很大(朱爱萍, 郭书云, 赵锐. 免疫比浊法检测异常血清免疫球蛋白的方法学探讨[J]. 现代检验医学杂志, 1999(4):33-34.)，所以我认为此样本虽然是由原液稀释三倍所得，但在溶液中IgG抗体的浓度都相同的情况下，两管中抗原抗体比例相差很大，所以检测结果也有偏差是可以理解的。
同时再结合散点图拟合出的标准曲线，可以发现，浓度较高的两管标准液距离拟合曲线的偏差是最大的，由此推断，1：1原液和1：2原液并不适合本次实验中所给的羊抗人抗体浓度（未知）。
所以，误差来源除了以上所说原因之外，还有本次实验提供的抗体浓度，并不适合原液中IgG浓度的检测，而稀释三倍后的样品属比较适合的范围。
所以最大的误差来源是抗体浓度的选择，虽然抗体浓度是保证过量的，但是过量的程度相对每个管来说是不同的，1：1和1：2也许需要更大的浓度。
六、思考
1.本实验采用的免疫比浊法适用于人体内哪几种Ig？
人体血清中含有五类免疫球蛋白，分别为IgG、IgA、IgM、IgD、IgE。
其中前三种含量相对较高，而IgD和IgE含量极低，膜结合型IgD构成BCR，是Bcell成熟的标志，IgE在正常人血清中含量最少，与Ⅰ型超敏反应和寄生虫感染有关。
理论上此五种Ig均可以采用免疫比浊法检测含量，但临床上常只检测前三种含量较高、疾病相关性更强的Ig，在考虑寄生虫感染和变态反应性疾病时还可以检测血清中IgE的含量。
2.检测血清等体液标本中某种抗原分子的方法？
原理同本实验，采用抗原抗体结合的原理，凝集反应、沉淀反应、中和反应，以及免疫荧光法和酶联免疫吸附试验等，在使用抗原抗体结合原理时，将抗体加入荧光可以直接检测荧光强度来定量检测抗原含量，而酶联免疫吸附试验还可采用双抗体法以级联放大更易检测。
3.使用免疫比浊法时，抗原抗体的比例应采用哪个区域？
应采用抗体过量的前带，因为所检测的物质是抗原，希望所加样品中的抗原完全与抗体结合形成微粒，所有的微粒均可吸收酶标仪中透过的光线。
因为吸光度OD值与溶液中颗粒的浓度成正比，而计算时默认颗粒的浓度与样品中所含抗原的浓度相当，所以，只有在抗体含量过量时，才能保证所有抗原都能与抗体结合形成微粒，降低因抗原未完全结合抗体所带来的误差。
而且结合本次误差，不同管抗体过量的程度也应该大致相当。
4.为何波长选择700nm？
抗原抗体结合后的吸光度受抗原抗体种类的影响，本次采用的是羊抗人Ig抗体，应该由经验值可知700nm是IgG抗原抗体结合后最大的吸收波长，在最大吸收波长处通过测吸光度来测浓度所得结果的误差最小。
