弹性蛋白酶产生菌的筛选及其发酵条件的初步研究

四川农业大学硕士学位论文产弹性蛋白酶芽孢杆菌的选育及发酵条件的优化姓名：张娟申请学位级别：硕士专业：食品科学指导教师：刘书亮;吴琦20070501②ＩＮ＋ＤＥＳ连续诱变方法取ｌＯｍｌ菌悬液到直径为９ｃｍ的无菌平皿内，启动磁力搅拌器，将菌悬液置于ＩＳＷ紫外灯（波长２５４ｎｍ）下，垂直距离３０ｅｍ处照射上述所确定的时间后，取４ｍｌ菌悬液加入到１６ｍＬｐｎ７．０磷酸缓冲液中，再加入所确定浓度的ＤＥＳ溶液于无菌的三角瓶中，振荡处理上述所确定的时间后加入０．５ｍｌ２５％的硫代硫酸钠终止反应，然后取０．２ｍＬ诱变后菌悬液稀释涂布初筛平板，取未经ｕＶ和ＤＥＳ连续处理的菌悬液稀释涂布平板做对照，３７℃培养４８ｈ。

③ＩＮ＋ＤＥＳ连续诱变后突变菌株的筛选同紫外诱变后突变株的选择。

（４）遗传稳定性实验选取一株最后一轮诱变后测定酶活最高的菌株，接入新鲜的营养琼脂斜面培养基上，连续传代８代，每代摇瓶发酵测定酶活。

２．２结果与分析２．２．１产弹性蛋白酶菌株的初筛从屠宰场、牛奶厂、啤酒厂周围土壤和污水中采集土样和污水５２份，其中４１份样品观察到有分解弹性蛋白的现象。

取该样品稀释涂布分离平板培养形成单菌落后，挑取约１２００个左右菌落再点接于含有弹性蛋白的平板上经３７℃培养４８ｈ，获得具有分解弹性蛋白产生透明圈的菌落２０９个。

菌株在初筛平板上形成的透明圈见图２．２（附图１）。

图２．２ＳＣＥＬ０１菌株在１．Ｏ％的弹性蛋白平板上４８ｈ培养产生的水解圈Ｆｉ９２．２ＥｌａｓｔｏｌｙｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＢａｃｉｌｌｕｓＳＣＥＬ０１ｏｎ１．Ｏ％ｅｌａｓｔｉｎａｇａｒｐｌａｔｅｓａｉｄｅｒ４８ｈｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ图２．３ＳＣＥＬ０１的细胞形态图（ｘ１０００）Ｆｉｅ，２．３ＴｈｅｃｅｌｌｓｈａｐｅｏｆＳＣＥＬ０１ｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（×１０００）２０９株菌纯化后，再用接种针点种于ｐＨ７．０的初筛弹性蛋白酶的平板经３７＂Ｃ培养４８ｈ后，测量菌株在初筛平板上的蛋白水解圈和菌落直径，并计算二者的比值（ＨＣ从表２．３可以看出，菌株ＳＣＥＬＯＩ与东秀珠的《常见细菌系统鉴定手册》中的枯草芽孢杆菌菌株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）的生化指标的ｖ—Ｐ指标测定不相同，列于表２．４。

微生物产弹性蛋白酶Progress in Microbial Production of ElastaseFANG Shang-ling, HU Jia-jun（College of Biochemical Engineering, Hubei University of Technology, Wuhan *****, China）弹性蛋白酶（elastase）是一种以分解不溶性弹性蛋白质为特征的广谱蛋白水解酶，主要存在于动物胰脏中，以及皮肤、主动脉、血小板和白血球中。

在微生物类群中也广有分布，细菌、放线菌、真菌中都有分泌胞外弹性蛋白酶的报道。

弹性蛋白酶可由动物胰脏提取或由微生物发酵制得。

由动物提取纯化的弹性蛋白酶是一种肽链内切酶，由240个氨基酸残基组成，相对分子质量为25 900，等电点为pI 9.5。

来源不同的微生物弹性蛋白酶都能降解其天然底物——弹性硬蛋白质。

同功不同源蛋白酶的特点、性质、相对分子质量和等电点等有所差异，但都是一种广谱的肽链内切酶，具有较广泛的水解特性。

目前，弹性蛋白酶主要作为治疗高脂血症、防治动脉粥样硬化症的生化药物，治疗确切，安全可靠。

我国生产弹性蛋白酶主要由猪胰脏提取，原料来源有限制，且酶含量不高，每1 kg鲜胰脏含弹性蛋白酶仅210 000 U，限制了生产的发展。

微生物弹1/ 9性蛋白酶与胰弹性蛋白酶一样，具有较广的水解特性，不但能降解弹性蛋白，而且能分解酪蛋白、明胶、血纤维蛋白、血红蛋白、白蛋白等多种蛋白质，是一种广谱的肽链内切酶。

国外，药用弹性蛋白酶有通过动物胰脏提取，也有发酵生产，其效果相似。

利用微生物发酵大规模工业化生产弹性蛋白酶不仅能提供足够的治疗用药物酶，也能为开拓该酶其他方面的应用提供充足的酶源。

1微生物来源弹性蛋白酶的国内外研究情况弹性蛋白酶最初是1949年由Balo等从胰脏中分离纯化出来，并指出其含量水平与动脉粥样硬化症有关。

从此对该酶的研究一直很活跃。

实验方案设计人：陈龙1．蛋白酶产生菌的分离1. 1 实验材料菌源：酱香型大曲1. 2 培养基的配制细菌培养基（牛肉膏蛋白胨培养基）：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、琼脂15-25g、水1000ml；称量：分别准确称取上述蛋白胨和NaCl量置于烧杯中，然后加入所需水量的2/3左右的蒸馏水；牛肉膏用玻璃棒挑取置于小烧杯或是表面皿中称量，用热水融化后倒入烧杯中。

溶化：在上述烧杯中先加少许所需要的水量，将烧杯置于石棉网上加热，用玻棒搅拌，让药品完全融化，补充水到所需的总体积。

调PH：在未调PH前，先用PH试纸预测培养基原来的PH，若偏酸用1 mol/L NaOH调节边加变搅拌，并随时用PH试纸检测至PH到7.2。

反之，用0.1 mol/LHCL进行调节。

分装、包扎、灭菌。

霉菌培养基（察氏培养基）：蔗糖30g、NaNO3 2g、K2HPO4 1g、KCL 0.5g、MgSO4.7H2O 0.5g、FeSO4 0.01g、琼脂15-25g、蒸馏水1000ml；量取所需水量约2/3左右加到烧杯中，分别称取上述物品依次逐一加入水中溶解，方法同细菌培养基。

分装、包扎、灭菌。

产蛋白酶发酵培养基：葡萄糖20g，酵母粉15g，K2HPO4 1.0g，Na2CO3 0.1g，自来水100ml PH 9.0（灭菌前）。

pH7．0。

配制方法：称取葡萄糖20g，酵母膏15g置于洁净干燥500ml锥形瓶轻轻摇动，使物料混匀，按上述配方用自来水配制无机盐溶液50ml，调节Ph 9.0,倒入装有物料的锥形瓶中混匀，在0.1Mpa压力灭菌30min。

选择培养基：豆粕粉10．0 g，琼脂15．0 g，蒸馏水1000 mL，pH7．2～7．4，112℃，灭菌30 min。

固体斜面培养基：250mL三角瓶装料12.5g麦麸，麦麸：水=1：1.2，pH自然，121℃灭菌30min。

筛选平板：牛肉膏蛋白胨培养基（配法同上）。

1. 3 试剂和溶液1.3.1 配制生理盐水：分装于250ml锥形瓶，每瓶内装99ml，并装10粒玻璃珠。

陇东大学学士学位毕业论文（设计）蛋白酶产生菌的筛选及产酶条件优化生命科学与技术学院08生物技术班作者：指导教师：蛋白酶产生菌的筛选及产酶条件优化何泰杜旭谢丽娟，刘丽萍(陇东学院生命科学与技术学院，甘肃庆阳745000)摘要：采用陇东学院污水处理厂附近土壤、农田土壤及养殖场附近土壤作为样品，利用牛奶水解圈筛选模型从中分离筛选得到产蛋白酶能力较高的菌株whr1，初步鉴定该菌株属于芽孢杆菌。

并对其产酶条件进行优化，结果显示该菌最适培养时间为24h，最佳碳源为质量浓度1% 蔗糖，最佳氮源为质量浓度1.5%酵母膏，最适初始pH值为6.0，最适发酵温度为35℃。

关键词：菌种筛选，鉴定，蛋白酶，条件优化Protease produced the screening of the bacteria and the optimization of theenzyme production conditions（College of life science and technology, Longdong University, Qingyang 74500, Gansu, China）Abstract：The sewage treatment plant soil near east institute, soil and soil samples near farms .Using milk hydrolysis circle screening model separating screening in high ability get protease whr1 strains. Preliminary appraisal of the fungus belong to bacillus. After the optimization of the condition, the capability of whr1 was improved, the optimal condition is: The time is 24h; carbon source is sucrose 1%; nitrogen source is Yeast extract 1.5 %, the pH is 6.0; fermentation temperature is 30℃.Keyword: Screening，Identified，Protease, Conditions optimization0引言蛋白酶是水解蛋白质肽键的一类酶的总称，是一类广泛应用于皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面的重要工业用酶[1]，也是目前世界上产销量最大的商业酶，其市场占有率约占整个商品酶销售量的60％，微生物蛋白酶从微生物中提取，不受资源、环境和空间的限制，具有动物蛋白酶和植物蛋白酶所不可比拟的优越性[2,3]。

蛋白酶产生菌的筛选及活力的测定作者刘艳芝指导教师张玲秀（忻州师范学院生物系1201班034000）摘要：采用忻州师范学院校园附近土壤、农田土壤及体育场土壤作为样品，并从中筛选分离并得到产蛋白酶能力较高的菌株，经过初步鉴定该菌株属芽孢杆菌。

通过对其产酶条件进行优化，结果显示该菌产酶最佳碳源为质量浓度15g/L 的乳糖，最佳氮源为质量浓度20g/L的尿素，最适初始pH值为6.5，最适发酵温度为35℃。

关键词：菌种筛选；鉴定；蛋白酶；条件优化蛋白酶蛋白质中肽键水解的酶，是一类广泛应用于皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面的重要工业用酶，也是目前世界上产销量最大的商业酶，其市场占有率约占整个商品酶销售量的60％，微生物蛋白酶从微生物中提取，不受资源、环境和空间的限制，具有动物蛋白酶和植物蛋白酶所不可比拟的优越性。

目前，蛋白酶的研究仍注重于新品种的发掘，并通过分离筛选、发酵条件优化和诱变育种或构建基因工程菌等综合手段获得高产蛋白酶的优良菌株。

我国的蛋白酶研究还存在如微生物资源开发不足，蛋白酶种类较少，酶制剂品种单一等问题。

本论文从以下几方面对蛋白酶产生菌株进行较为系统的研究：从土壤中筛选出产蛋白酶能力较高菌株。

对筛选出的菌株进行形态学的鉴定，将菌株初步确定到属。

研究产蛋白酶菌株发酵产酶条件，对培养基成分和发酵条件进行优化，确定最佳培养基配方和发酵条件，进一步提高菌株的产酶活力。

一、材料及方法：1.1 实验材料与仪器实验仪器：高压灭菌锅，恒温培养箱，超净工作台，电子分析天平，pH测量仪，水浴锅，微波炉，紫外光可见分光光度计，摇床、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、量筒、容量瓶、漏斗、试剂瓶、漏斗、载玻片、滤纸、擦镜纸。

1.2 实验材料：样品：取自忻州师范学院附近的土壤。

试剂：无菌水（带玻璃珠）、100ug/ml 酪氨酸溶液、PH8.0硼酸缓冲液、0.4mol/L三氯乙酸、牛肉膏蛋白胨培养基、酪蛋白培养基、产蛋白酶发酵培养基二、操作步骤（一）配制所需培养基按照以下配方配制所需的培养基牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，NaCl 0.5g，琼脂1.5～2.0g，水100ml，pH 7.2，配制200mL酪蛋白培养基：牛肉膏0.3g，酪素1g，NaCl 0.5g，琼脂2g ，定容于100ml产蛋白酶发酵培养基：玉米粉6g，豆粉4g，磷酸二氢钾0.03g，碳酸钠0.1g，磷酸氢二钠0.4g，定容于100ml（二）分离1.洗涤培养皿、试管等实验器具，与121℃高压灭菌20min2.采集土壤样品，用无菌水植被1:10土壤悬液。

枯草芽孢杆菌弹性蛋白酶的纯化及酶学性质研究刘书亮;吴琦;詹莉;赖文【摘要】对枯草芽孢杆菌BEM01菌株发酵液中的弹性蛋白酶进行了分离纯化,并研究了酶学性质.先后采用了硫酸铵分级沉淀、离子交换层析和分子筛层析等方法,弹性蛋白酶的回收率为7.88%,纯化倍数为13.79,结合SDS-PAGE和分子筛层析确定该弹性蛋白酶是一单链蛋白,分子量约为31 ku.对酶学性质的研究表明,该弹性蛋白酶属于含有Ca2+的金属蛋白酶类;其最适作用温度为50℃,具有良好的热稳定性;在硼砂.硼酸缓冲体系、Tris-HCl缓冲体系中酶最适反应pH分别为7.4和8.6,在pH 8.0～11.0酶活力趋于稳定;10 mmoL/L的Ca2+有激活和稳定酶活作用,SDS 和吐温-80也有激活酶活作用,而Li+、Na+、Zn+、K+、Ba2+、Mg2+、Mn2+和EDTA对酶活均有不同程度的抑制作用;其催化动力学方程为:y=0.186x+32.493;Vmax=0.030 8 U/mL,Km=0.005 7 g/mL.【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2010(036)006【总页数】5页(P26-30)【关键词】弹性蛋白酶;枯草芽孢杆菌;纯化;酶学性质【作者】刘书亮;吴琦;詹莉;赖文【作者单位】四川农业大学食品学院,四川雅安,625014;四川农业大学生命与理学院,四川雅安,625014;四川农业大学生命与理学院,四川雅安,625014;四川农业大学食品学院,四川雅安,625014【正文语种】中文弹性蛋白酶(EC3.4.4.7,Elastase)是一种以水解不溶性弹性蛋白(elastin)为特征的蛋白水解酶[1],主要用作治疗高血脂症和防止动脉粥样硬化症。

同时,其广谱蛋白水解活性和对弹性蛋白的优先特异降解性显示其作为肉类嫩化剂具有广阔的应用前景和较高的商业价值[1-2]。

弹性蛋白酶可从动物胰脏中提取或由微生物发酵制得[3]。

蛋白酶产生菌的筛选及活力的测定作者刘艳芝指导教师张玲秀（忻州师范学院生物系 1201班 034000）摘要：采用忻州师范学院校园附近土壤、农田土壤及体育场土壤作为样品，并从中筛选分离并得到产蛋白酶能力较高的菌株，经过初步鉴定该菌株属芽孢杆菌。

通过对其产酶条件进行优化，结果显示该菌产酶最佳碳源为质量浓度15g/L的乳糖，最佳氮源为质量浓度20g/L的尿素，最适初始pH值为6.5，最适发酵温度为35℃ 。

关键词：菌种筛选；鉴定；蛋白酶；条件优化蛋白酶蛋白质中肽键水解的酶，是一类广泛应用于皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面的重要工业用酶，也是目前世界上产销量最大的商业酶，其市场占有率约占整个商品酶销售量的60％，微生物蛋白酶从微生物中提取，不受资源、环境和空间的限制，具有动物蛋白酶和植物蛋白酶所不可比拟的优越性。

目前，蛋白酶的研究仍注重于新品种的发掘，并通过分离筛选、发酵条件优化和诱变育种或构建基因工程菌等综合手段获得高产蛋白酶的优良菌株。

我国的蛋白酶研究还存在如微生物资源开发不足，蛋白酶种类较少，酶制剂品种单一等问题。

本论文从以下几方面对蛋白酶产生菌株进行较为系统的研究：从土壤中筛选出产蛋白酶能力较高菌株。

对筛选出的菌株进行形态学的鉴定，将菌株初步确定到属。

研究产蛋白酶菌株发酵产酶条件，对培养基成分和发酵条件进行优化，确定最佳培养基配方和发酵条件，进一步提高菌株的产酶活力。

1、材料及方法：1.1 实验材料与仪器实验仪器：高压灭菌锅，恒温培养箱，超净工作台，电子分析天平，pH测量仪，水浴锅，微波炉，紫外光可见分光光度计，摇床、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、量筒、容量瓶、漏斗、试剂瓶、漏斗、载玻片、滤纸、擦镜纸。

1.2 实验材料：样品：取自忻州师范学院附近的土壤。

试剂：无菌水（带玻璃珠）、100ug/ml 酪氨酸溶液、PH8.0硼酸缓冲液、0.4mol/L三氯乙酸、牛肉膏蛋白胨培养基、酪蛋白培养基、产蛋白酶发酵培养基二、操作步骤（一）配制所需培养基按照以下配方配制所需的培养基牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏 0.5g，蛋白胨1g，NaCl 0.5g，琼脂 1.5～2.0g，水 100ml，pH 7.2，配制200mL酪蛋白培养基：牛肉膏0.3g，酪素 1g，NaCl 0.5g，琼脂2g ，定容于100ml产蛋白酶发酵培养基：玉米粉6g，豆粉4g，磷酸二氢钾0.03g，碳酸钠0.1g，磷酸氢二钠0.4g，定容于100ml（二）分离1.洗涤培养皿、试管等实验器具，与121℃高压灭菌20min2.采集土壤样品，用无菌水植被1:10土壤悬液。

蛋白酶产生菌的分离鉴定及筛选。

蛋白酶产生菌的分离鉴定和筛选可以按照以下步骤进行：1.样品收集：从环境样品（如土壤、水样、发酵物等）中收集样品，注意收集样品需要符合生物安全和伦理规范。

2.分离菌株： a. 样品处理：将样品进行适当的稀释处理，以获得适量的单菌落。

b. 培养基选择：根据目标酶的特性，选择合适的培养基进行菌株分离。

常用的培养基有LB（大肠杆菌培养基）、TSA（琼脂糖营养平板培养基）等。

也可以添加特定的底物来富集酶活菌株。

c. 接种和分离：将处理后的样品接种在选定的培养基上，并进行营养和环境条件的适当调整。

通过稀释分离法，将单菌落分离至不同的培养皿中，得到纯培养的菌株。

3.酶活性测定： a. 初步筛选：将分离的菌株进行初步筛选，通过对菌落的酶活性直接观察或使用浸润琼脂糖等方法判断酶的活性。

b. 液体培养：将筛选出的菌株进行液体培养，收集培养物用于后续的酶活性测定。

c. 酶活性测定：通过适当的酶活性测定方法（如改良的Casein酶活测定法、Azocasein酶活测定法等）来评估菌株的酶活性。

4.酶产量测定： a. 最优菌株筛选：根据酶活性测定结果，选择酶活性较高的菌株。

b. 酶产量测定：对选定的菌株进行批量发酵或连续发酵实验，通过酶活性和菌体生长曲线的测定，估计菌株的酶产量。

5.菌株鉴定： a. 形态学特征：观察菌落的形态学特征，如形状、颜色、质地等。

b. 生理生化特性：进行生理生化测试，包括生长方式、耐受性、产酸性、酶反应等。

c. 分子生物学鉴定：通过PCR方法扩增和测序16S rRNA基因，进行菌株的分子鉴定，并与已知菌株进行比对。

这些步骤将有助于从样品中分离、鉴定和筛选出蛋白酶产生菌株。

根据筛选结果，选择高酶活性和高酶产量的菌株，可以进行后续的酶性质研究、表达载体构建等工作。

在实践中，根据具体实验条件和要求，可能需要进行适当的优化和调整。

产蛋白酶乳酸菌种的筛选及应用研究的开题报告开题报告题目：产蛋白酶乳酸菌种的筛选及应用研究研究背景乳酸菌是一类广泛存在于自然界中的微生物，其具有抗菌、抗氧化、降低乳酸含量等功能，因此被广泛应用于食品和医药领域。

而蛋白酶是一种能够水解蛋白质的酶类，可在食品加工领域中起到重要作用。

因此将产蛋白酶的乳酸菌种应用于食品加工领域具有广泛的应用前景。

研究目的本研究旨在通过筛选产蛋白酶的乳酸菌种，并对其进行应用研究，以期为乳制品制造业提供生产实践参考。

研究内容1. 通过传统微生物学鉴定方法筛选产蛋白酶的乳酸菌种。

2. 对所筛选得到的乳酸菌进行发酵产蛋白酶试验，通过SDS-PAGE和酶活性测定等方法对其进行鉴定和分析。

3. 将所筛选得到的产蛋白酶乳酸菌种应用于酸奶、乳酪等乳制品的制备过程中，对产品质量和特性进行评估。

4. 通过对产蛋白酶乳酸菌种的培养基改良、菌株突变等方法进行优化，提高其产酶能力和应用性能。

研究意义本研究将为乳制品加工领域提供产蛋白酶乳酸菌种的筛选和应用研究成果，有望开发出具有较高产酶能力和应用性能的菌种，并为乳制品制造业提供合理的生产和管控参考。

研究方法1. 采用传统微生物学鉴定方法筛选乳酸菌。

2. 采用固体发酵法进行产蛋白酶试验，通过SDS-PAGE和酶活性测定等方法对其进行鉴定和分析。

3. 对所制备的乳制品进行质量和特性评估，包括感官评估、化学分析、微生物分析等方法。

4. 采用培养基改良、菌株突变等方法进行优化。

预期结果预计筛选得到具有较高产酶能力和应用性能的产蛋白酶乳酸菌菌种，并应用于乳制品制备过程中，提高产品质量和特性。

同时，通过菌株的优化，将进一步提高产酶菌株的生产能力和应用性能。

研究进度目前已完成乳酸菌的筛选和鉴定工作，正在进行发酵试验和评估工作。

之后将进行培养基改良和菌株优化工作，并对优化后的菌株进行应用实验和评估。

预计整个研究工作将在一年内完成。

总结本研究旨在通过筛选产蛋白酶的乳酸菌种，并对其进行应用研究，提高乳制品加工质量和特性。

文献综述生物科学产蛋白酶菌株的筛选与酶活力的测定摘要[摘要]本文主要按照实验设计步骤从海水中筛选出可以产蛋白酶的放线菌，并对获得的放线菌进行初步研究，如形态观察以及酶活力的测定。

从舟山沿海中分离得到几株产蛋白酶的放线菌，并通过酪蛋白平板培养基，水解酪蛋白试验可对菌株的产酶情况进行定性研究，酶活较高的菌株都能产生较大的水解圈。

对其中2株产酶活性较高的菌株进行了以酪蛋白为底物的紫外分光光度法进行酶活性的测定。

[关键词]：蛋白酶；分离纯化；透明圈；酶活力1蛋白酶的简介水解蛋白质肽键的一类酶的总称。

按其水解多肽的方式，可以将其分为内肽酶和外肽酶两类。

内肽酶将蛋白质分子内部切断，形成分子量较小的肽。

外肽酶从蛋白质分子的游离氨基或羧基的末端逐个将肽键水解，而游离出氨基酸，前者为氨基肽酶后者为羧基肽酶[1]。

按其活性中心和最适pH值，又可将蛋白酶分为丝氨酸蛋白酶、巯基蛋白酶、金属蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶。

按其反应的最适pH值，分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶。

工业生产上应用的蛋白酶，主要是内肽酶。

根据蛋白酶对所作用的反应底物的选择性，一种蛋白酶仅能作用于蛋白质分子中一定的肽键。

种类很多，重要的有胃蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶等。

如胰蛋白酶催化水解碱性氨基酸所形成的肽键。

2蛋白酶的广泛应用蛋白酶广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中。

微生物蛋白酶，主要由霉菌、细菌，其次由酵母、放线菌生产。

例如，乳酸菌(lacticacidbacteria,LAB)是一大类能在可利用的碳水化合物发酵过程中产生大量乳酸的细菌，目前已知有200多种LAB[2]。

相当多的LAB是益生菌，其作为益生菌有如下依据：其属于肠道正常菌群，对人和动物的健康是有益的[3]。

在农业、兽医、医学以及食品工业[4、5]中是很重要的。

如果对产蛋白酶的乳酸菌种进行了筛选，并将所产的蛋白酶进行了分离纯化，就可以为酸奶的生产研制和微生态制剂的研发提供更优良的菌种。

微生物实验设计-产蛋白酶菌株的筛选背景蛋白酶是一种具有很广泛的应用价值的酶类。

由于其在消化道营养吸收、生物反应器中的转化作用等方面均有重要的作用，因此蛋白酶的产生与筛选已成为当今生物技术领域中的研究热点之一。

尤其是在食品加工、污水处理、纤维素生物降解等领域，蛋白酶都有着非常广泛的应用前景。

因此，本实验拟通过对产蛋白酶的菌株进行筛选，找到高产蛋白酶的优良菌株。

材料与方法菌株的采集菌株采集方法：在集中饮水供应点，选择自然生长的水上植物为采样点，如睡莲、菖蒲、兰草等，具体点位由实验组决定。

采用无菌削皮刀在水上植物上擦拭，将擦拭物用无菌三角板置于室温营养物培养基上慢慢离心直至血清澄清。

取尽可能大的好的菌落转入入液氮甘油管中，经深冷保存。

后选取筛选菌落接种于琼脂板上。

菌株的鉴定先用生化方法进行初步鉴定，包括观察菌落形态、氧化酶试验和嗜酸性染色，确定分离菌株的生物学特性。

然后利用API系统和Biolog系统对鉴定的菌株进行进一步的鉴定，最终确定其菌种身份。

菌株的扩增将选出的菌株接种到含有碳源和氮源的液体培养基中进行预培养。

在预培养的基础上，将菌株接种到不同浓度的含有特定碳源和氮源的液体培养基中进行再培养，测定培养基中蛋白酶活性及菌株生长情况。

选择生长良好、活性高的优良菌株进行扩大培养。

菌株蛋白酶活性的检测制备含有特定底物的琼脂板进行蛋白酶活性的检测，通过观察菌落周围的荧光带，判断菌株产生的蛋白酶活性。

结果与分析通过菌株采集、鉴定、扩增和蛋白酶活性的检测，找到了多个高产蛋白酶的优良菌株。

本实验通过对菌株的筛选，找到了高产蛋白酶的优良菌株，为蛋白酶的产生与研究提供了重要的参考。

弹性蛋白酶发酵生产条件优化及性质研究的开题报告1. 研究背景和意义弹性蛋白是动物组织中一种重要的结构蛋白质，具有极高的可延展性和回弹性，广泛存在于人体的肺泡、血管、肌腱等组织中，并在医学、材料科学、食品工业等领域有着广泛的应用价值。

因此，开展弹性蛋白的研究和应用具有重要意义。

弹性蛋白酶是一种专门水解弹性蛋白的酶类，能够将弹性蛋白裂解成多种肽段。

利用弹性蛋白酶进行弹性蛋白的加工和制备已成为一种新兴的技术手段，具有很高的应用前景。

因此，开展弹性蛋白酶的研究和生产具有重要的学术和经济价值。

2. 研究目的和内容本研究旨在优化弹性蛋白酶的发酵生产条件，研究弹性蛋白酶的生化性质和应用价值。

具体研究内容包括：1）选择适合弹性蛋白酶生产的菌株，并通过单因素试验和正交实验优化发酵生产条件；2）对弹性蛋白酶进行生化性质研究，包括酶活力、热稳定性、pH稳定性等；3）研究弹性蛋白酶在弹性蛋白裂解和人体蛋白质代谢中的应用价值。

3. 研究方法和技术路线1）菌株筛选和培养条件优化：从已有文献和本实验室菌库中选择适合弹性蛋白酶生产的菌株，通过单因素试验和正交实验优化发酵生产条件。

2）酶的提取与纯化：采用超滤、负载金属离子亲和层析等技术对酶进行提取和纯化。

3）酶活力测定：采用拉曼光谱、紫外吸收光谱等方法对酶活力进行测定。

4）酶的热稳定性和pH稳定性测定：采用不同温度和pH值下的酶活力测定方法对酶的热稳定性和pH稳定性进行研究。

5）弹性蛋白的裂解和人体蛋白质代谢研究：采用SDS-PAGE和Western blot等技术研究弹性蛋白的裂解和酶在人体蛋白质代谢中的应用价值。

4. 预期结果及意义通过本研究对弹性蛋白酶的生产、生化性质和应用价值进行深入研究，可以获得如下预期结果：1）优化弹性蛋白酶的发酵生产条件，提高酶的生产量和酶活力；2）深入了解弹性蛋白酶的热稳定性和pH稳定性等生化性质，为其在工业生产和应用中提供依据；3）研究弹性蛋白酶在弹性蛋白裂解和人体蛋白质代谢中的应用价值，拓展酶的应用领域。

产蛋白酶菌 Planomicrobium sp．L-2发酵条件的优化金玉兰;王玉荣【摘要】通过优化从长蛸胃肠道筛选得到的产蛋白酶菌 Planomicrobium sp．L-2菌株的发酵条件，提高其产蛋白酶的活力。

采用单因素实验研究发酵培养基的最佳碳源、氮源以及最佳发酵条件，采用 Box-Behnken 设计方法进行响应面实验设计，进一步优化培养基组成。

结果表明，最佳培养基组成及发酵条件为：可溶性淀粉0.73％、蛋白胨0.68％、酵母膏0.15％、磷酸高铁0.01％、海水，培养基初始pH 值8.0，接种量8％，发酵温度25℃，发酵时间3.5 d。

优化后，所产蛋白酶的最高酶活力为1457 U·mL－1，比优化前提高约2倍。

%A protease-producing strain Planomicrobium sp.L-2 was isolated and identified from gastrointes-tinal tract of Octopus variabilis .To increase the yield of proteases in Planomicrobium sp.L-2,the optimal fer-mentation conditions for producing protease,including carbon source,nitrogensource,fermentation time,fer-mentation temperature,initial pH value of medium,and inoculum amount were studied by single factor experi-ments.On the base of that,response surface analysis was applied to optimize the compositions of fermentation medium of Planomicrobium sp.L-2 for producing protease.The optimal medium was composed of soluble starch 0.73%,peptone 0.68%,yeast extract 0.15%,FePO4 0.01% in sea water with the initial pH value of 8.0.And then the medium with 8% inoculum amount was cultured at 25 ℃ for 3.5 d.Under these optimal conditions,the activity of proteases produced by Planomicrobium sp.L-2was high up to 1 457 U·mL-1 ,which was approxi-mately 2 times higher than that of the original condition.【期刊名称】《化学与生物工程》【年(卷),期】2014(000)011【总页数】6页(P34-39)【关键词】蛋白酶;Planomicrobium sp.L-2;发酵条件;Box-Behnken 设计【作者】金玉兰;王玉荣【作者单位】青岛农业大学化学与药学院，山东青岛 266109;青岛农业大学化学与药学院，山东青岛 266109【正文语种】中文【中图分类】Q814蛋白酶广泛存在于动物和人的消化道中，对蛋白质的消化吸收起着非常重要的作用[1]。