蛋白酶产生菌的筛选和紫外诱变育种

蛋白酶产生菌的分离、鉴定和筛选是一项重要的微生物学工作，通常用于寻找能够产生具有特定功能的蛋白酶的细菌或真菌菌株。

以下是一般的步骤和方法：
1. 样品采集：首先从土壤、水体、食品等环境中采集样品，可能含有潜在的蛋白酶产生菌。

2. 分离：将样品进行稀释处理后，通过涂布法、稀释涂布法、过滤法等分离方法，在富含寒原蛋白酶的寒原平板培养基上培养，以分离出单菌种。

3. 纯化：将分离得到的单菌种进行多次传代，确保单一菌株的纯化。

4. 鉴定：利用生理生化试验、形态学观察、生物学特性和分子生物学方法（如16S rRNA序列分析）等手段，对分离得到的菌株进行鉴定，确定其分类地位。

5. 筛选：利用含有蛋白质底物的培养基（如乳清蛋白、明胶等）进行筛选，观察菌株在培养基上的透明圈或发酵液的浑浊度变化，筛选出产生蛋白酶活性高的菌株。

6. 活性测定：对筛选出的蛋白酶产生菌株进行蛋白酶活性测定，确
定其蛋白酶活性水平。

7. 保存与应用：对获得的蛋白酶产生菌株进行保存，并进一步研究其生物学特性和应用潜力，如酶学特性、温度和pH稳定性等。

通过以上步骤，可以有效地从环境样品中分离、鉴定并筛选出具有高蛋白酶产量和活性的菌株，为后续的蛋白酶生产及应用研究提供了可靠的菌种资源。

陇东大学学士学位毕业论文（设计）蛋白酶产生菌的筛选及产酶条件优化生命科学与技术学院08生物技术班作者：指导教师：蛋白酶产生菌的筛选及产酶条件优化何泰杜旭谢丽娟，刘丽萍(陇东学院生命科学与技术学院，甘肃庆阳745000)摘要：采用陇东学院污水处理厂附近土壤、农田土壤及养殖场附近土壤作为样品，利用牛奶水解圈筛选模型从中分离筛选得到产蛋白酶能力较高的菌株whr1，初步鉴定该菌株属于芽孢杆菌。

并对其产酶条件进行优化，结果显示该菌最适培养时间为24h，最佳碳源为质量浓度1% 蔗糖，最佳氮源为质量浓度1.5%酵母膏，最适初始pH值为6.0，最适发酵温度为35℃。

关键词：菌种筛选，鉴定，蛋白酶，条件优化Protease produced the screening of the bacteria and the optimization of theenzyme production conditions（College of life science and technology, Longdong University, Qingyang 74500, Gansu, China）Abstract：The sewage treatment plant soil near east institute, soil and soil samples near farms .Using milk hydrolysis circle screening model separating screening in high ability get protease whr1 strains. Preliminary appraisal of the fungus belong to bacillus. After the optimization of the condition, the capability of whr1 was improved, the optimal condition is: The time is 24h; carbon source is sucrose 1%; nitrogen source is Yeast extract 1.5 %, the pH is 6.0; fermentation temperature is 30℃.Keyword: Screening，Identified，Protease, Conditions optimization0引言蛋白酶是水解蛋白质肽键的一类酶的总称，是一类广泛应用于皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面的重要工业用酶[1]，也是目前世界上产销量最大的商业酶，其市场占有率约占整个商品酶销售量的60％，微生物蛋白酶从微生物中提取，不受资源、环境和空间的限制，具有动物蛋白酶和植物蛋白酶所不可比拟的优越性[2,3]。

蛋白酶产生菌的筛选及活力的测定作者刘艳芝指导教师张玲秀（忻州师范学院生物系1201班034000）摘要：采用忻州师范学院校园附近土壤、农田土壤及体育场土壤作为样品，并从中筛选分离并得到产蛋白酶能力较高的菌株，经过初步鉴定该菌株属芽孢杆菌。

通过对其产酶条件进行优化，结果显示该菌产酶最佳碳源为质量浓度15g/L 的乳糖，最佳氮源为质量浓度20g/L的尿素，最适初始pH值为6.5，最适发酵温度为35℃。

关键词：菌种筛选；鉴定；蛋白酶；条件优化蛋白酶蛋白质中肽键水解的酶，是一类广泛应用于皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面的重要工业用酶，也是目前世界上产销量最大的商业酶，其市场占有率约占整个商品酶销售量的60％，微生物蛋白酶从微生物中提取，不受资源、环境和空间的限制，具有动物蛋白酶和植物蛋白酶所不可比拟的优越性。

目前，蛋白酶的研究仍注重于新品种的发掘，并通过分离筛选、发酵条件优化和诱变育种或构建基因工程菌等综合手段获得高产蛋白酶的优良菌株。

我国的蛋白酶研究还存在如微生物资源开发不足，蛋白酶种类较少，酶制剂品种单一等问题。

本论文从以下几方面对蛋白酶产生菌株进行较为系统的研究：从土壤中筛选出产蛋白酶能力较高菌株。

对筛选出的菌株进行形态学的鉴定，将菌株初步确定到属。

研究产蛋白酶菌株发酵产酶条件，对培养基成分和发酵条件进行优化，确定最佳培养基配方和发酵条件，进一步提高菌株的产酶活力。

一、材料及方法：1.1 实验材料与仪器实验仪器：高压灭菌锅，恒温培养箱，超净工作台，电子分析天平，pH测量仪，水浴锅，微波炉，紫外光可见分光光度计，摇床、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、量筒、容量瓶、漏斗、试剂瓶、漏斗、载玻片、滤纸、擦镜纸。

1.2 实验材料：样品：取自忻州师范学院附近的土壤。

试剂：无菌水（带玻璃珠）、100ug/ml 酪氨酸溶液、PH8.0硼酸缓冲液、0.4mol/L三氯乙酸、牛肉膏蛋白胨培养基、酪蛋白培养基、产蛋白酶发酵培养基二、操作步骤（一）配制所需培养基按照以下配方配制所需的培养基牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，NaCl 0.5g，琼脂1.5～2.0g，水100ml，pH 7.2，配制200mL酪蛋白培养基：牛肉膏0.3g，酪素1g，NaCl 0.5g，琼脂2g ，定容于100ml产蛋白酶发酵培养基：玉米粉6g，豆粉4g，磷酸二氢钾0.03g，碳酸钠0.1g，磷酸氢二钠0.4g，定容于100ml（二）分离1.洗涤培养皿、试管等实验器具，与121℃高压灭菌20min2.采集土壤样品，用无菌水植被1:10土壤悬液。

蛋白酶产生菌的分离鉴定及筛选。

蛋白酶产生菌的分离鉴定和筛选可以按照以下步骤进行：1.样品收集：从环境样品（如土壤、水样、发酵物等）中收集样品，注意收集样品需要符合生物安全和伦理规范。

2.分离菌株： a. 样品处理：将样品进行适当的稀释处理，以获得适量的单菌落。

b. 培养基选择：根据目标酶的特性，选择合适的培养基进行菌株分离。

常用的培养基有LB（大肠杆菌培养基）、TSA（琼脂糖营养平板培养基）等。

也可以添加特定的底物来富集酶活菌株。

c. 接种和分离：将处理后的样品接种在选定的培养基上，并进行营养和环境条件的适当调整。

通过稀释分离法，将单菌落分离至不同的培养皿中，得到纯培养的菌株。

3.酶活性测定： a. 初步筛选：将分离的菌株进行初步筛选，通过对菌落的酶活性直接观察或使用浸润琼脂糖等方法判断酶的活性。

b. 液体培养：将筛选出的菌株进行液体培养，收集培养物用于后续的酶活性测定。

c. 酶活性测定：通过适当的酶活性测定方法（如改良的Casein酶活测定法、Azocasein酶活测定法等）来评估菌株的酶活性。

4.酶产量测定： a. 最优菌株筛选：根据酶活性测定结果，选择酶活性较高的菌株。

b. 酶产量测定：对选定的菌株进行批量发酵或连续发酵实验，通过酶活性和菌体生长曲线的测定，估计菌株的酶产量。

5.菌株鉴定： a. 形态学特征：观察菌落的形态学特征，如形状、颜色、质地等。

b. 生理生化特性：进行生理生化测试，包括生长方式、耐受性、产酸性、酶反应等。

c. 分子生物学鉴定：通过PCR方法扩增和测序16S rRNA基因，进行菌株的分子鉴定，并与已知菌株进行比对。

这些步骤将有助于从样品中分离、鉴定和筛选出蛋白酶产生菌株。

根据筛选结果，选择高酶活性和高酶产量的菌株，可以进行后续的酶性质研究、表达载体构建等工作。

在实践中，根据具体实验条件和要求，可能需要进行适当的优化和调整。

蛋白酶产生菌的分离鉴定及筛选1. 引言蛋白酶是一类能够降解蛋白质的酶，在许多工业领域具有广泛的应用价值。

因此，发现和筛选具有高蛋白酶产量的菌株成为了很多研究人员的关注点。

本文旨在介绍蛋白酶产生菌的分离鉴定及筛选的方法和步骤。

2. 蛋白酶分离菌株的采集蛋白酶产生菌株可以从各种环境中采集得到，常见的源包括土壤、水样、植物表面等。

采集时需要注意避免污染和样品间的干扰。

常用的采集方法包括无菌棉签擦拭、土壤样品采集等。

3. 蛋白酶分离菌株的分离和筛选3.1 培养基选择和制备蛋白酶分离菌株的分离需要选择合适的培养基，常见的培养基包括含蛋白质和多肽的培养基，如酵母提取物培养基、肉汤培养基等。

培养基制备时需要注意无菌操作，避免细菌污染。

3.2 菌株的分离将采集得到的样品均匀涂布在选定的培养基上，使用无菌棉签或铲子进行均匀涂布。

将涂布后的培养基培养于适宜的温度和时间下，一般常见的培养温度为30摄氏度。

3.3 蛋白酶活性筛选使用适当的蛋白酶活性指示剂，如casein等，在培养基上进行盘状培养。

通过观察培养基上蛋白质的降解情况，筛选出具有高蛋白酶活性的菌株。

此外，也可通过测定培养液中蛋白酶的活性来进行筛选。

4. 蛋白酶产生菌株的鉴定4.1 形态观察观察菌落的形态特征，如菌落的形状、颜色、透明度等，以及菌株的菌落生长速度等。

4.2 生理生化特性检测进行菌株的生理生化特性检测，包括产酸、产气、葡萄糖利用、氧需求等。

常用的方法包括气压油技术、碳水化合物利用酶技术等。

4.3 分子生物学鉴定采用分子生物学方法对菌株进行鉴定，如16S rRNA序列分析、PCR等。

将菌株的DNA提取出来，进行引物扩增，然后通过测序和序列比对，确定菌株的分类信息。

5. 结论通过蛋白酶产生菌的分离鉴定及筛选，可以获得具有高蛋白酶产量的菌株。

这些菌株在生物技术、食品工业等领域具有广泛的应用前景。

未来的研究可以进一步优化培养条件，提高菌株的蛋白酶产量，并应用于相关的工业生产中。

蛋白酶产生菌的筛选组别：第*组班级：生工** 班组员：***指导老师：***一、实验目的学习从自然界中分离蛋白酶产生菌二、实验内容蛋白酶产生菌的分离三、实验原理许多细菌和霉菌产生蛋白酶，细菌中的芽孢杆菌是最常见的蛋白酶产生菌。

本实验将土壤样品悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其他微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到奶粉培养平板并进行培养，根据奶粉平板的水解圈做初筛。

将初筛的蛋白酶产生菌接入产酶培养基振荡培养，测定蛋白酶的活力，最终得到产蛋白酶的芽孢杆菌。

也可直接将细菌接种到奶粉培养平板进行培养，分离筛选其他蛋白酶产生菌。

四、实验材料和用具1.材料：土壤样品2.试剂：牛肉膏蛋白胨培养及平板、奶粉培养基平板、45mL 无菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液、3.仪器及用具：紫外分光光度计、显微镜、恒温水浴锅、摇床、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、量筒、容量瓶、漏斗、试剂瓶、漏斗、载玻片、滤纸、擦镜纸。

五、操作步骤（一）配制所需培养基按照以下配方配制所需的培养基牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏 0.5g ，蛋白胨 1g ，NaCl 0.5g ，琼脂 1.5 ～2.0g ，水 100ml ，pH 7.2配制 200mL奶粉培养基：牛肉膏0.5g ，蛋白胨 1g ，NaCl 0.5g ，琼脂 2.0g ，水 100ml ，pH 7.0 ～7.2脱脂奶粉 3g ，配制 200mL（二）分离1.采集土壤样品，用无菌水植被 1:10 土壤悬液。

2.取 1:10 土壤悬液 5 mL，注入已灭过菌的试管中，将此试管放入 75～80℃水浴中热处理 10min 以杀死非芽孢细菌。

3.取加热处理过的土壤悬液 100～200μL，涂布接种到牛肉膏蛋白胨培养平板，后将平板倒置，于30～ 32℃下培养24～48h.4.对长出的单菌落进行编号，选择表面干燥、粗糙、不透明的菌落，挑取少许菌苔涂片，做芽孢染色，判断是否为芽孢杆菌。

蛋白酶产生菌的筛选鉴定,原理
蛋白酶产生菌的筛选鉴定的原理是利用菌株产生的蛋白酶活性对菌落进行筛选和鉴定。

常用的方法有以下几种：
1. 筛选培养基法：将菌株接种在富含蛋白质的培养基上，待菌落形成后，置于一定条件下（如低温、酸碱pH变化、盐等），观察菌落周围是否出现蛋白质水解区域。

表现明显蛋白质水解区域的菌落可以认为是蛋白酶产生菌。

2. 培养基加酪蛋白法：将菌株接种在含有酪蛋白的培养基上，蛋白酶能够水解酪蛋白，会呈现明显的透明圈形成。

菌落形成后，利用这个特征可以筛选出蛋白酶产生菌。

3. 硫酸铜法：将菌株接种在富含酪蛋白的培养基上，在菌落周围加入硫酸铜溶液。

菌落产生的蛋白酶能使硫酸铜发生颜色变化（由蓝色变为紫色）或溶液变清晰，可以通过这种方法对菌株进行筛选和鉴定。

4. 特定基质代谢法：蛋白酶产生菌可以利用特定基质作为唯一碳源进行代谢，产生的酶能水解特定基质并产生反应产物。

利用这些反应产物的特性，可以利用化学或生物学方法进行分析和鉴定。

以上这些方法都是利用菌株产生的蛋白酶活性进行筛选和鉴定，以确定是否为蛋白酶产生菌。

这些方法灵敏度高、简单易行，
可以用于在大量菌株中筛选出蛋白酶产生菌，并对其进行鉴定和进一步的研究。

蛋白酶是一类能够水解蛋白质的酶，在许多领域具有广泛的应用价值。

下面是蛋白酶产生菌的分离鉴定及筛选的一般步骤：
1. 样品采集：
-从自然环境（如土壤、水源等）或已知含有蛋白质的样品（如食品、发酵物等）中采集样品。

2. 分离菌株：
-将样品经过适当的稀释和处理后，通过平板法、液体培养法等方式进行分离培养。

-可以采用选择性培养基，如蛋白质含量较高的培养基，以筛选出潜在的蛋白酶产生菌。

3. 蛋白酶活性筛选：
-根据蛋白酶的活性特点，可使用含有特定蛋白质底物的琼脂糖平板或液体培养基，筛选出蛋白酶活性高的菌株。

-观察菌落周围的透明圈（即蛋白酶产生的溶解区），判断菌株对蛋白质的降解能力。

4. 纯化与鉴定：
-从具有蛋白酶活性的菌株中选择一个或多个进行进一步的培养和纯化。

-使用生化方法，如SDS-PAGE电泳、酶活性测定等，鉴定蛋白酶的分子量、酶活性和特性。

5. 分子鉴定：
-对蛋白酶活性高的菌株进行16S rRNA或其他适用的基因序列分析，以确定其属于的菌属和物种。

6. 筛选优良菌株：
-结合蛋白酶活性、稳定性、产酶量等指标，筛选出蛋白酶产量高、酶性好的优良菌株。

值得注意的是，在进行分离鉴定及筛选过程中，需要严格遵守微生物实验室操作规范，采取必要的无菌操作和消毒措施，确保实验安全。

此外，还可以利用分子生物学技术对蛋白酶基因进行研究，以进一步了解蛋白酶的产生机制和调控方式。

微生物实验设计-产蛋白酶菌株的筛选背景蛋白酶是一种具有很广泛的应用价值的酶类。

由于其在消化道营养吸收、生物反应器中的转化作用等方面均有重要的作用，因此蛋白酶的产生与筛选已成为当今生物技术领域中的研究热点之一。

尤其是在食品加工、污水处理、纤维素生物降解等领域，蛋白酶都有着非常广泛的应用前景。

因此，本实验拟通过对产蛋白酶的菌株进行筛选，找到高产蛋白酶的优良菌株。

材料与方法菌株的采集菌株采集方法：在集中饮水供应点，选择自然生长的水上植物为采样点，如睡莲、菖蒲、兰草等，具体点位由实验组决定。

采用无菌削皮刀在水上植物上擦拭，将擦拭物用无菌三角板置于室温营养物培养基上慢慢离心直至血清澄清。

取尽可能大的好的菌落转入入液氮甘油管中，经深冷保存。

后选取筛选菌落接种于琼脂板上。

菌株的鉴定先用生化方法进行初步鉴定，包括观察菌落形态、氧化酶试验和嗜酸性染色，确定分离菌株的生物学特性。

然后利用API系统和Biolog系统对鉴定的菌株进行进一步的鉴定，最终确定其菌种身份。

菌株的扩增将选出的菌株接种到含有碳源和氮源的液体培养基中进行预培养。

在预培养的基础上，将菌株接种到不同浓度的含有特定碳源和氮源的液体培养基中进行再培养，测定培养基中蛋白酶活性及菌株生长情况。

选择生长良好、活性高的优良菌株进行扩大培养。

菌株蛋白酶活性的检测制备含有特定底物的琼脂板进行蛋白酶活性的检测，通过观察菌落周围的荧光带，判断菌株产生的蛋白酶活性。

结果与分析通过菌株采集、鉴定、扩增和蛋白酶活性的检测，找到了多个高产蛋白酶的优良菌株。

本实验通过对菌株的筛选，找到了高产蛋白酶的优良菌株，为蛋白酶的产生与研究提供了重要的参考。

蛋白酶产生菌的分离、活化选育、发酵及酶活力的测定许多细菌和霉菌产生蛋白酶，细菌中的芽孢杆菌是常见的蛋白酶产生菌。

本实验将土壤样品悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其它微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到酪蛋白平板进行培养，根据酪蛋白平板的水解圈做初筛。

也可直接将细菌或霉菌接种到酪蛋白平板进行培养，分离筛选其它蛋白酶产生菌。

本实验主要包括：蛋白酶产生菌的分离纯化、产酶微生物菌种的选育、产酶微生物的发酵与酶活力的测定、蛋白酶产生菌的生长及生长曲线、培养基优化。

通过本实验项目，使学生学会从自然界中分离蛋白酶产生菌的方法，菌种的纯化技术、高产菌的选育技术；了解蛋白酶产生菌的生长情况，学会绘制其生长曲线；学会培养基优化的方法；了解蛋白酶的性质及蛋白酶的测定原理；掌握蛋白酶的发酵及酶活力测定方法。

1 实验材料1.1 实验样品校园内土壤样品1.2实验仪器与材料牛肉膏蛋白胨培养基平板、酪蛋白平板、无菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液番红；显微镜、恒温水浴锅、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、血球计数板、试管、三角烧瓶、烧杯、量筒、，玻棒、电子天平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅、pH试纸（ pH 5．5—9．0）、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、培养皿、胶头滴管、分光光度计（应符合GB9721的规定）等。

2实验方法与步骤 2.1 培养基的配制方法1.称量按培养基配方比例依次准确地称药品放入烧杯中。

2.溶化在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。

待药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。

3.调pH4.分装按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内。

5．包扎塞好棉花的试管和锥形瓶应盖上厚纸用绳捆扎，用记号笔注明培养基名称、组别、日期。

6．灭菌将上述培养基以1.02kg/cm2（15磅/英寸2），121．3℃， 15-20min高压蒸汽灭菌。

如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。

本科毕业论文蛋白酶高产菌株的选育以及菌种鉴定专业名称：生物科学 1302学生姓名：**学号： **************师：**蛋白酶高产菌株的选育以及菌种鉴定摘要分离和纯化培养法在实验中常常是分离杂菌筛选所需菌落的有效方法，紫外线诱变可以试验出菌落突变率最高的诱变时间或诱变强度，从而选择最适剂量对纯化菌株进行诱变，产生性能更加优秀的可育后代，这就是菌株的选育过程。

本实验采用以上方法对土壤中的杂菌进行分离纯化，得到纯化的能分解蛋白质的菌株，通过紫外线诱变而获得分解能力强的菌株，即高产蛋白酶的菌株。

菌种鉴定则是对微生物快速深入了解的捷径。

关键字灭菌、培养基、无菌操作、分离纯化、紫外线诱变、菌种鉴定Abstract英文省略。

正文1.蛋白酶菌种的采样由于采样的菌种需要有分解蛋白质的能力，所以采样地点可以是餐饮聚集地或者种植大豆等富含高蛋白植物的土地。

2.蛋白酶菌种的分离纯化2.1.实验用品的灭菌灭菌是指杀死或消灭一定环境中的所有微生物,灭菌的方法分物理和化学灭菌法两大类.本实验主要介绍物理方法的一种,即加热灭菌.加热灭菌包括湿热和干热灭菌两种.通过加热使菌体内蛋白质凝固变性,从而达到杀菌目的.蛋白质的凝固变性与其自身含水量有关,含水量越高,其凝固所需要的温度越低.在同一温度下,湿热的杀菌效力比干热大,因为在湿热情况下,菌体吸收水分,使蛋白质易于凝固；同时湿热的穿透力强,可增加灭菌效力.本实验采用高压蒸汽灭菌法。

2.1.1.灭菌前的准备玻璃器皿等在灭菌前必须经正确包裹和加塞,以保证玻璃器皿于灭菌后不被外界杂菌所污染.常用玻璃器皿的包扎和加塞方法如下：平皿用纸包扎或装在金属平皿筒内；三角瓶在棉塞与瓶口外再包以厚纸,用棉绳以活结扎紧,以防灭菌后瓶口被外部杂菌所污染；吸管以拉直的曲别针一端放在棉花的中心,轻轻捅入管口,松紧必须适中,管口外露的棉花纤维统一通过火焰烧去,灭菌时将吸管装入金属管筒内进行灭菌,也可用纸条斜着从吸管尖端包起,逐步向上卷,头端的纸卷捏扁并拧几下,再将包好的吸管集中灭菌.2.1.2.高压蒸汽灭菌法高压蒸汽灭菌用途广,效率高,是微生物学实验中最常用的灭菌方法.这种灭菌方法是基于水的沸点随着蒸汽压力的升高而升高的原理设计的.当蒸汽压力达到1.05kg/cm2时,水蒸气的温度升高到121℃,经15～30min,可全部杀死锅内物品上的各种微生物和它们的孢子或芽孢.一般培养基、玻璃器皿以及传染性标本和工作服等都可应用此法灭菌。

产蛋白酶菌株的筛选级分离一、实验原理自能够产生胞外蛋白酶的菌株在牛奶平板上生长后，其菌落周围可形成明显的蛋白水解圈，水解圈与菌落直径的比值，常被作为判断该菌株蛋白酶产生能力的初筛依据。

将腐烂的大豆浸泡液中的细菌接种在含有酪素的培养基上进行培养。

由于产蛋白酶菌株能在干酪素的培养基上形成无色透明圈，因此能将产蛋白菌株分离出来，分离出来的菌株经再次培养，就可获得纯种产蛋白酶的菌株。

二、实验器材1.菌种：从大豆浸泡液中获得2.培养基:(1)PDA斜面培养基：马铃薯200g，蔗糖20g,琼脂20g,水1000ml.马铃薯去皮，切成块，煮沸半小时后用纱布过滤，再加糖及琼脂，溶化后补水至1000ml，121℃灭菌30min备用。

（2）干酪素琼脂培养基：干酪素4.0g，用20ml 0.1mol/L NaOH溶液溶解后再加20g琼脂，加蒸馏水煮沸加水至1000ml 121℃灭菌30min备用。

3.试剂：无菌水。

4.仪器：天平，电磁炉，烧杯，无菌试管，无菌培养皿，高压灭菌锅，锥形瓶，接种环，涂布棒，酒精灯，恒温培养箱。

三、实验步骤1.将腐烂的大豆放入无菌水中浸泡，制成细菌悬浮液。

2.用涂布棒蘸取菌液接种于PAD培养基中，26℃培养48h。

3.倒置于酪素琼脂培养基平板上，37℃培养24h。

4.挑取培养好的菌落接种于平板上，28℃培养48h。

5.观察各菌落周围形成的透明圈的情况。

6.选取透明圈较大的三个菌落分别接种在干酪素琼脂培养基上，28℃培养48h。

7.观察受否为单菌落，若为单菌落且有透明圈，则为纯种产蛋白酶菌株。

若有杂菌，则需要重复步骤6，直到培养出纯菌为止。

参考文献[1]代玉梅.蛋白酶高产菌株的筛选鉴定及酶学性质研究[D].青岛:青岛大学,2008.[2]黄志强,林白雪,谢联辉.产碱性蛋白酶海洋细菌的筛选与鉴定[J].福建农林大学学报:自然科学版,2006,35(4):416-420.。

一株高产胞外蛋白酶菌株的选育摘要：本实验采用的菌株来源于XXX大学动科院养牛场中的土壤，通过设置不同的培养基来筛选具有产胞外蛋白酶能力的菌株。

以酪素培养基平板产生的透明圈的直径/菌落直径的大小作为选择标记，经初筛选择出比值大的菌株为出发菌株。

经紫外线诱变处理，培养获得两种未知高产胞外蛋白酶菌株。

对其进行形态观察和生理生化鉴定，结果表明突变菌株w1的形态、生理生化特性符合芽孢杆菌属的特征，而突变菌株w2为革兰氏阴性杆菌。

关键字：细菌；胞外蛋白酶；筛选；鉴定蛋白酶（Protease）是催化蛋白质水解的一类酶，微生物蛋白酶主要由霉菌、细菌生产。

蛋白酶对所作用的反应底物有严格的选择性，一种蛋白酶仅能作用于蛋白质分子中一定的肽键。

该酶催化反应速度较快，无工业污染，且反应条件适应性宽，被广泛应用在皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面。

目前微生物菌种选育所采用的诱变手段主要有激光诱变、DES诱变结合热处理、空间诱变、紫外线照射和亚硝基胍复合诱变等。

蛋白酶分布广，主要存在于人和动物消化道中，在植物和微生物中含量丰富。

由于动植物资源有限，工业上生产蛋白酶制剂主要利用枯草杆菌、栖土曲霉等微生物发酵制备。

常见的能产生蛋白酶的蛋白微生物有细菌中的酸性蛋白酶生产菌（如黑曲霉、根霉）；碱性蛋白酶生产菌（如地衣芽孢杆菌）；中性蛋白酶生产菌（如枯草芽孢杆菌）。

本实验以养牛场土壤中筛选得到的蛋白酶生产菌株为出发菌株，采用紫外线照射诱变方法育种，以筛选得到高产胞外蛋白酶菌株。

1 材料与方法1.1 材料1.1.1 土样：河北农业大学西校区养牛场中的土壤 1.1.2 培养基：（表中数据均为1000mL培养基中所含物质量）筛选培养基：酪素培养基干酪素 1g 酵母膏 0.25g 甘油 1.25g dH2O 250mL K2HPO4 0.125g 琼脂 4g pH 8.0 营养培养基：肉汤培养基蛋白胨 10g 牛肉膏 3g NaCl 5g H2O 1000mL pH 7.4 鉴别性培养基淀粉培养基蛋白胨 10g 明胶培养基蛋白胨 5g牛肉膏 13g 明胶120g dH2O 1000mL pH 7.2―7.4 NaCl 5g 牛肉膏 5g 可溶性淀粉2g dH2O 1000mL 琼脂 16g 葡萄糖发酵培养基蛋白胨 10g 蛋白胨 5g NaCl 5g 葡萄糖5g K2HPO4 0.2g K2PO4 2g dH2O 1000mL 1.6%溴甲酚紫1―2mL dH2O 1000mL pH7.2―7.4 pH 7.2―7.4 葡萄糖蛋白胨培养基乳糖发酵培养基（已配好）柠檬酸盐培养基（已配好）半固体培养基（已配好）三糖铁培养基（已配好）1.2 方法1.2.1 菌种的筛选1.2.1.1 培养基的配置及灭菌按上述方法分别配置肉汤培养基和酵素培养基，配置完成后放入高压灭菌锅于120℃下灭菌20min。

蛋白酶产生菌的筛选蛋白酶是一种能够水解蛋白质的酶类，广泛应用于医药、食品、饲料等多个领域。

因此，对蛋白酶产生菌的筛选具有重要意义。

下面将对蛋白酶产生菌的筛选进行详细介绍。

一、菌种的选取菌种的选取是筛选蛋白酶产生菌的第一步。

一般来说，优秀的蛋白酶产生菌应具备以下特点：1.适应性强：具有广泛适应环境的能力，能够在多种环境中生存繁殖；2.高酶产量：产酶量高且稳定，生产成本低；3.酶活性好：酶活性高，能够快速、高效地降解蛋白质；4.易于培养：易于培养和维护，适应不同的培养条件。

根据以上要求，我们可以选取一些常见的微生物菌株，如大肠杆菌、真菌、放线菌等。

此外，一些原产于自然界中的微生物资源也是优秀的菌株来源，在筛选蛋白酶产生菌时应予考虑。

二、菌群的分离菌群的分离是筛选蛋白酶产生菌的关键步骤。

在这一步骤中，我们需要将每一种菌株分离出来，以便进行后续的酶活性检测和分析。

常用的分离方法包括平板法、液体培养法、筛选法等。

其中平板法是最为常见的方法，其步骤如下：1.准备培养基：根据选取的菌株特性，准备适宜的培养基，以促进菌株的生长和繁殖；2.分离：将样品按照一定稀释倍数涂布在平板上，然后放入培养箱进行培养；3.单菌分离：观察培养基的著色情况，辨别每一个菌落，最后用无菌酒精燃烧消毒的针头将每个菌落刺到含有相同培养基的试管中进行液体培养；4.鉴定：确定单菌培养基量大于10^6时，进行细胞分类和鉴定。

三、酶活性检测酶活性检测是筛选蛋白酶产生菌的重要环节，可以通过掌握酶活性信息来评估菌株的产酶能力以及蛋白酶的种类和活性等。

我们可以通过以下方法进行酶活性检测：1.酶联免疫吸附测定法（ELISA）：其原理是将特异性抗体与酶偶联，加入样品中，利用抗体与酶偶联物发生特异性相互作用，用底物染色，观察染色情况以确定酶活性；2.凝胶电泳：将分离纯化的酶嵌入聚丙烯酰胺凝胶中进行分离和检测；3.酶活性测定：以酶降解底物的反应速度作为酶活性的指标，通过比色、荧光和放射等不同方式进行检测。

本科毕业论文蛋白酶高产菌株的选育以及菌种鉴定专业名称：生物科学 1302学生姓名：**学号： **************师：**蛋白酶高产菌株的选育以及菌种鉴定摘要分离和纯化培养法在实验中常常是分离杂菌筛选所需菌落的有效方法，紫外线诱变可以试验出菌落突变率最高的诱变时间或诱变强度，从而选择最适剂量对纯化菌株进行诱变，产生性能更加优秀的可育后代，这就是菌株的选育过程。

本实验采用以上方法对土壤中的杂菌进行分离纯化，得到纯化的能分解蛋白质的菌株，通过紫外线诱变而获得分解能力强的菌株，即高产蛋白酶的菌株。

菌种鉴定则是对微生物快速深入了解的捷径。

关键字灭菌、培养基、无菌操作、分离纯化、紫外线诱变、菌种鉴定Abstract英文省略。

正文1.蛋白酶菌种的采样由于采样的菌种需要有分解蛋白质的能力，所以采样地点可以是餐饮聚集地或者种植大豆等富含高蛋白植物的土地。

2.蛋白酶菌种的分离纯化2.1.实验用品的灭菌灭菌是指杀死或消灭一定环境中的所有微生物,灭菌的方法分物理和化学灭菌法两大类.本实验主要介绍物理方法的一种,即加热灭菌.加热灭菌包括湿热和干热灭菌两种.通过加热使菌体内蛋白质凝固变性,从而达到杀菌目的.蛋白质的凝固变性与其自身含水量有关,含水量越高,其凝固所需要的温度越低.在同一温度下,湿热的杀菌效力比干热大,因为在湿热情况下,菌体吸收水分,使蛋白质易于凝固；同时湿热的穿透力强,可增加灭菌效力.本实验采用高压蒸汽灭菌法。

2.1.1.灭菌前的准备玻璃器皿等在灭菌前必须经正确包裹和加塞,以保证玻璃器皿于灭菌后不被外界杂菌所污染.常用玻璃器皿的包扎和加塞方法如下：平皿用纸包扎或装在金属平皿筒内；三角瓶在棉塞与瓶口外再包以厚纸,用棉绳以活结扎紧,以防灭菌后瓶口被外部杂菌所污染；吸管以拉直的曲别针一端放在棉花的中心,轻轻捅入管口,松紧必须适中,管口外露的棉花纤维统一通过火焰烧去,灭菌时将吸管装入金属管筒内进行灭菌,也可用纸条斜着从吸管尖端包起,逐步向上卷,头端的纸卷捏扁并拧几下,再将包好的吸管集中灭菌.2.1.2.高压蒸汽灭菌法高压蒸汽灭菌用途广,效率高,是微生物学实验中最常用的灭菌方法.这种灭菌方法是基于水的沸点随着蒸汽压力的升高而升高的原理设计的.当蒸汽压力达到1.05kg/cm2时,水蒸气的温度升高到121℃,经15～30min,可全部杀死锅内物品上的各种微生物和它们的孢子或芽孢.一般培养基、玻璃器皿以及传染性标本和工作服等都可应用此法灭菌。

蛋白酶产生菌的紫外诱变育种蛋白酶产生菌的紫外诱变育种xxxx大学生命科学学院生物工程第一组前言: 因为自发突变率小，以微生物的自然变易作为基础的筛选菌种的机率并不很高。

为了加大突变频率，可采用物理或化学的因素进行诱发突变。

物理因素中目前使用得最方便且十分有效是紫外，紫外诱变一般采用15w的紫外灭菌灯，其光谱比较集中在253.7nm处，这与DNA的吸收波长一致，可引起DNA分子结构发生变化，特别是嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体，从而引起菌种的遗传特性发生变易。

本次实验通过比较对照组和紫外诱变1min、5min、10min的实验组菌落的生长情况和水解圈的情况，可以很好的了解紫外诱变的效果。

初步的说明诱变育种为筛选高效，稳定的菌种提供了有效可能的方法。

1 实验材料与方法1.1 材料1.1.1样品：老师提供的生长较好的菌液 1.1.2培养基及其配制1）液体培养基：牛肉膏0.3g，蛋白胨 1.0g，NaCl 1.0g，pH7.0～7.5，H2O 定容至100ml。

配好50ml/三角瓶，分装两瓶每瓶50ml.包扎112℃，灭菌 30min。

2）固体培养基（300ml）:牛肉膏0.9g，蛋白胨3g，NaCl 3g， H2O 定容300ml，pH值7.0。

配好后，按100ml/瓶分装三瓶, 分别称取1.5g琼脂条塞入三角瓶，包扎，112℃，灭菌 30min。

取牛奶粉25g用250ml水溶解，包扎，116℃，灭菌 15min。

按10%分别加入上述3个三角瓶中，每个三角瓶10ml。

混匀后，倒平板。

1.1.3生理盐水：取Nacl 1.8g 溶解在200ml的水中，即配制0.9%的生理盐水。

1）每支试管中加入4.5ml蒸馏水，塞上试管塞，22支试管分4组分别包扎； 2）剩下的生理盐水装入三角瓶包扎；112℃灭菌 30min。

1.1.4器材血球计数板，显微镜，紫外诱变箱，红灯泡，移液管，涂布棒，含有7颗玻璃珠的空三角瓶等，112℃灭菌 30min。