碱性蛋白酶产生菌的筛选(1)

高产碱性蛋白酶菌株的筛选及酶学性质的研究高产碱性蛋白酶菌株的筛选及酶学性质的研究摘要：蛋白酶是一类广泛存在于生物体中的酶类，其具有多种功能。

碱性蛋白酶是一类pH值适宜碱性环境下活性较高的蛋白酶，应用广泛。

本研究旨在筛选出一株高产碱性蛋白酶的菌株，并对其酶学性质进行研究。

引言：蛋白酶在生物体内起着关键的生物调节和代谢调控作用。

碱性蛋白酶是一类活性较高、pH值适宜碱性环境下较为稳定的蛋白酶，被广泛应用于生物工程、制药、食品加工等领域。

因此，筛选高产碱性蛋白酶菌株并对其酶学性质进行研究具有重要意义。

材料与方法：本研究选取了富含烟碱的土壤样品作为实验用菌株的来源。

首先进行了初步筛选，将土壤样品分别接种于含有碱性蛋白酶基质的琼脂平板上，并在适宜的培养条件下进行孵育。

随后，对形成菌落的菌株进行二次筛选，通过培养基的碱性蛋白酶活性测定，筛选出活性较高的菌株，并进行进一步培养。

结果：经过初步筛选和二次筛选，从富含烟碱的土壤样品中分别筛选出了两株高产碱性蛋白酶的菌株。

其中，菌株A的碱性蛋白酶活性达到了每毫升1000 U，菌株B的碱性蛋白酶活性为每毫升800 U。

讨论：这两株高产碱性蛋白酶的菌株在富含烟碱的土壤样品中被筛选出来，表明烟碱可能对菌株具有诱导产碱性蛋白酶的作用。

此外，本研究所筛选出的菌株的蛋白酶活性较高，这对于蛋白质降解和利用具有积极的意义。

酶学性质：对菌株A和菌株B分别进行了酶学性质的研究。

结果表明，这两株菌株的碱性蛋白酶在pH 9.0的条件下具有较高的活性，其酶活性逐渐下降，当pH值低于7.0时基本失活。

在温度方面，菌株A的蛋白酶活性在40°C达到最高值，而菌株B的最适温度为45°C。

进一步的研究发现，菌株A的蛋白酶受到金属离子Cu2+的抑制，而菌株B的蛋白酶对Cu2+较为稳定。

结论：本研究成功筛选出两株高产碱性蛋白酶的菌株，并对其酶学性质进行了研究。

结果显示，这两株菌株的碱性蛋白酶具有较高的活性，适应性较强。

产碱性蛋白酶菌株的筛选碱性蛋白酶是在碱性范围内水解蛋白质肽键的酶类，一般最适pH值为9~11，属内肽酶中的丝氨酸蛋白水解酶类，主要用于加酶洗涤剂中，在制革、纺织、医药、化妆品等的生产中也有广泛的应用。

目前，全世界所生产的酶中碱性蛋白酶占到总产量的30%左右，显示出良好的使用性能和经济价值。

碱性蛋白酶广泛存在于细菌、放线菌和真菌中，其中以芽孢杆菌属的碱性蛋白酶研究的最深入。

微生物来源的碱性蛋白酶都是胞外酶，与动植物来源的碱性蛋白酶相比具有产酶量高，适合大规模工业生产的优点。

因此，微生物碱性蛋白酶被认为是最重要的应用型酶类。

本实验从盐碱地采集土样，从中分离出若干株产碱性蛋白酶的菌株。

培养基。

平板培养基( %) : 酵母粉1. 5，蛋白胨0. 5，氯化钠0. 5，琼脂1. 6，pH9。

分离培养基( %) : 酵母膏1. 5，脱脂奶粉0. 5，琼脂1. 6，pH9。

种子培养基%) : 葡萄糖1. 0，蛋白胨0. 5，酵母膏0. 5，KH2PO40. 1，MgSO40. 02，Na2CO31. 0，pH9。

土样采集。

选取采集地点地表植被根系周围的土壤，先除去地表浮土及植被根系，然后挖取深约5cm 的土壤样品。

样品处理。

将土样混合均匀，4℃冰箱保存。

菌株分离( 平板分离法)。

取10g土样装入90ml 无菌生理盐水的三角烧瓶中，100r /min 旋转摇床培养20min，取10 -3，10 -4，10-5稀释液分别涂布于平板培养基上，每个浓度涂布3 个培养皿。

37℃恒温箱倒置培养24h。

观察与保存: 培养24h、48h 后，挑选菌落形态、颜色不一致的菌落保存待用。

筛选采用平板划线法将保存的单菌落划线于分离培养基上。

37℃恒温培养箱中培养24h。

通过观察水解圈的大小初步判断菌株产酶能力的高低，挑选产生透明水解圈大的单菌落接2 环于装有5ml 液体发酵培养基的无菌试管中，30℃条件下旋转摇床培养24h。

文章编号:1001-3717(2006)01-0070-03碱性蛋白酶产生菌的筛选3李树文,陆秀华,尚海利(莱阳农学院生命科学院,山东青岛266109)摘要:本试验从5份土壤中共筛选出产碱性蛋白酶菌株9株,即SHL-4、SHL-6、SHL-7、SHL-10、SHL-8、SHL-11、SHL-12、SHL-18、SHL-20,其中SHL-4、SHL-6、SHL-7、SHL-10产酶效果较好;采用正交试验设计,初步地确定了菌株SHL-4产酶培养基组分,即蛋白胨0.5%、牛肉膏1.5%。

关键词:碱性蛋白酶;筛选;菌株中图分类号:Q939.97文献标识码:AScerrning R ning of Alkaline Protease Producing StrainsL I Shu2wen,L U Xiu2hua,SHAN G Hai2li(Life Science College,L AC,Qingdao266109,China)Abstract:Nine st rains producing alkaline p rotease were screened out f rom five soil samples,namely SHL-4、6、7、10、8、11、12、18、20,SHL-4、6、7、10of which wit h high protease activity.Through an or2 t hogonal test,t he p roducing protease cult ure medium of t he SHL-4st rain was confirmed preliminarily, namely0.5%of pepto ne,1.5%of beef ext ract.K ey w ords:alkaline protease;screening;st rain 碱性蛋白酶是指在碱性的条件下具有活性,能够水解蛋白质肽键的酶类。

碱性蛋白酶菌株的筛选及产酶条件初探高玉千，李林柯，刘琦（河南农业大学生命科学学院，郑州，450002）摘要：从四个不同地点采集的土壤样品中，平板分离初筛到9株蛋白酶产生菌，进一步复筛得到一株高产且稳定的碱性蛋白酶菌株B4，初步鉴定为枯草芽孢杆菌。

实验证明其最佳产酶pH8.5，水解温度53℃，发酵时间60h，为下一步进行碱性蛋白酶基因的克隆和诱变奠定基础。

关键词：枯草芽孢杆菌，碱性蛋白酶，筛选Studies on Isolation of Alkaline ProteaseGao Yu-qian, Li Lin-ke, Liu Qi(College of Life Sciences, Henan Agriculture University, Henan, Zhengzhou, 450002) Abstract：9 producing alkaline protease strains were isolated from soil samples, within one strain named B4 was selected and identified as Bacillus subtilis.The optimum conduction for the protease producing consisted of pH8.5, 53℃ and after 60h fermentation. The research could do good preparation for the clone and the mutagenesis of the protease-gene.Keyword：Bacillus subtilis alkaline protease screening蛋白酶是一种重要的酶制剂，在轻工、食品、医药工业中用途非常广泛。

20世纪末国际市场上商品蛋白酶多达80多种，其销售额占酶制剂总销售额的60%以上，而微生物碱性蛋白酶又占了整个蛋白酶40%左右的市场份额，被认为是最重要的应用型酶类[1]。

蛋白酶产生菌的筛选鉴定,原理
蛋白酶产生菌的筛选鉴定的原理是利用菌株产生的蛋白酶活性对菌落进行筛选和鉴定。

常用的方法有以下几种：
1. 筛选培养基法：将菌株接种在富含蛋白质的培养基上，待菌落形成后，置于一定条件下（如低温、酸碱pH变化、盐等），观察菌落周围是否出现蛋白质水解区域。

表现明显蛋白质水解区域的菌落可以认为是蛋白酶产生菌。

2. 培养基加酪蛋白法：将菌株接种在含有酪蛋白的培养基上，蛋白酶能够水解酪蛋白，会呈现明显的透明圈形成。

菌落形成后，利用这个特征可以筛选出蛋白酶产生菌。

3. 硫酸铜法：将菌株接种在富含酪蛋白的培养基上，在菌落周围加入硫酸铜溶液。

菌落产生的蛋白酶能使硫酸铜发生颜色变化（由蓝色变为紫色）或溶液变清晰，可以通过这种方法对菌株进行筛选和鉴定。

4. 特定基质代谢法：蛋白酶产生菌可以利用特定基质作为唯一碳源进行代谢，产生的酶能水解特定基质并产生反应产物。

利用这些反应产物的特性，可以利用化学或生物学方法进行分析和鉴定。

以上这些方法都是利用菌株产生的蛋白酶活性进行筛选和鉴定，以确定是否为蛋白酶产生菌。

这些方法灵敏度高、简单易行，
可以用于在大量菌株中筛选出蛋白酶产生菌，并对其进行鉴定和进一步的研究。

实验十一产蛋白酶菌株的筛选碱性蛋白酶是一类最适宜作用PH为碱性的蛋白酶，在轻工、食品、医药工业中用途非常广泛。

微生物来源的碱性蛋白酶都是胞外酶，具有产酶量高，适合大规模工业生产等优点，被认为是最重要的一类营业性酶类。

从自然界筛选获取有用的微生物资源一直是微生物学的一项重要工作，也是学习微生物学的学生应该掌握的基本技能。

一基本原理⏹自能够产生胞外蛋白酶的菌株在牛奶平板上生长后，其菌落周围可形成明显的蛋白水解圈。

⏹水解圈与菌落直径的比值常被作为判断该菌株蛋白酶产生能力的初筛依据。

不同类型的蛋白酶都能在牛奶平板上形成蛋白水解圈，细菌在平板上的生长条件和液体环境中生长的情况相差很大，因此在平板上产圈能力强的菌株不一定就是碱性蛋白酶的高产菌株。

⏹碱性蛋白酶活力测定按中华人民共和国颁布标准QB747-80进行。

⏹原理：Folin试剂与酚类化合物（Tyr,Trp,Phe）在碱性条件下发生反应形成蓝色化合物，用蛋白酶分解酪蛋白生成含酚基的氨基酸与Folin试剂呈蓝色反应，通过分光光度计测定可知酶活大小。

二实验目的⏹学习用选择平板从自然界中分离胞外蛋白酶产生菌的方法⏹学习并掌握细菌菌株的药瓶液体发酵技术⏹掌握蛋白酶活力测定的原理与基本方法三实验器材1 菌株从自然界筛选获得的蛋白酶产生菌株2 溶液和试剂蛋白胨，酵母粉，脱脂奶粉，琼脂，干酪素，三氯醋酸，NaOH，Na2CO3,Folin试剂，硼砂，酪氨酸，水等3 仪器和用品三角烧瓶，培养皿，吸管，试管，涂布棒，玻璃搅拌棒，水浴锅，分光光度计，培养摇床，高压灭菌锅，尺，玻璃小漏斗和滤纸四操作步骤1 培养基和试剂的配制（1）牛奶平板：在普通肉汤蛋白胨固体培养基中添加终质量浓度为1.5%的牛奶（2）发酵培养基：玉米粉4%，黄豆饼粉3%，Na2HPO4 0.4%,KH2PO4 0.03%,3 mol/l NaOH 调节pH到9.0,0.1MPa 灭菌20min,250ml三角烧瓶的装瓶量为50ml。

文献综述生物科学产蛋白酶菌株的筛选与酶活力的测定摘要[摘要]本文主要按照实验设计步骤从海水中筛选出可以产蛋白酶的放线菌，并对获得的放线菌进行初步研究，如形态观察以及酶活力的测定。

从舟山沿海中分离得到几株产蛋白酶的放线菌，并通过酪蛋白平板培养基，水解酪蛋白试验可对菌株的产酶情况进行定性研究，酶活较高的菌株都能产生较大的水解圈。

对其中2株产酶活性较高的菌株进行了以酪蛋白为底物的紫外分光光度法进行酶活性的测定。

[关键词]：蛋白酶；分离纯化；透明圈；酶活力1蛋白酶的简介水解蛋白质肽键的一类酶的总称。

按其水解多肽的方式，可以将其分为内肽酶和外肽酶两类。

内肽酶将蛋白质分子内部切断，形成分子量较小的肽。

外肽酶从蛋白质分子的游离氨基或羧基的末端逐个将肽键水解，而游离出氨基酸，前者为氨基肽酶后者为羧基肽酶[1]。

按其活性中心和最适pH值，又可将蛋白酶分为丝氨酸蛋白酶、巯基蛋白酶、金属蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶。

按其反应的最适pH值，分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶。

工业生产上应用的蛋白酶，主要是内肽酶。

根据蛋白酶对所作用的反应底物的选择性，一种蛋白酶仅能作用于蛋白质分子中一定的肽键。

种类很多，重要的有胃蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶等。

如胰蛋白酶催化水解碱性氨基酸所形成的肽键。

2蛋白酶的广泛应用蛋白酶广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中。

微生物蛋白酶，主要由霉菌、细菌，其次由酵母、放线菌生产。

例如，乳酸菌(lacticacidbacteria,LAB)是一大类能在可利用的碳水化合物发酵过程中产生大量乳酸的细菌，目前已知有200多种LAB[2]。

相当多的LAB是益生菌，其作为益生菌有如下依据：其属于肠道正常菌群，对人和动物的健康是有益的[3]。

在农业、兽医、医学以及食品工业[4、5]中是很重要的。

如果对产蛋白酶的乳酸菌种进行了筛选，并将所产的蛋白酶进行了分离纯化，就可以为酸奶的生产研制和微生态制剂的研发提供更优良的菌种。

蛋白酶产生菌的筛选组别：第*组班级：生工**班组员：***指导老师：***一、实验目的学习从自然界中分离蛋白酶产生菌二、实验内容蛋白酶产生菌的分离三、实验原理许多细菌和霉菌产生蛋白酶，细菌中的芽孢杆菌是最常见的蛋白酶产生菌。

本实验将土壤样品悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其他微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到奶粉培养平板并进行培养，根据奶粉平板的水解圈做初筛。

将初筛的蛋白酶产生菌接入产酶培养基振荡培养，测定蛋白酶的活力，最终得到产蛋白酶的芽孢杆菌。

也可直接将细菌接种到奶粉培养平板进行培养，分离筛选其他蛋白酶产生菌。

四、实验材料和用具1.材料：土壤样品2.试剂：牛肉膏蛋白胨培养及平板、奶粉培养基平板、45mL无菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液、3.仪器及用具：紫外分光光度计、显微镜、恒温水浴锅、摇床、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、量筒、容量瓶、漏斗、试剂瓶、漏斗、载玻片、滤纸、擦镜纸。

五、操作步骤（一）配制所需培养基按照以下配方配制所需的培养基牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏 0.5g，蛋白胨 1g，NaCl 0.5g，琼脂 1.5～2.0g，水 100ml，pH 7.2配制200mL奶粉培养基：牛肉膏 0.5g，蛋白胨 1g，NaCl 0.5g，琼脂 2.0g，水 100ml，pH 7.0～7.2脱脂奶粉 3g，配制200mL（二）分离1.采集土壤样品，用无菌水植被1:10土壤悬液。

2.取1:10土壤悬液5 mL，注入已灭过菌的试管中，将此试管放入75～80℃水浴中热处理10min以杀死非芽孢细菌。

3.取加热处理过的土壤悬液100～200μL，涂布接种到牛肉膏蛋白胨培养平板，后将平板倒置，于30～32℃下培养24～48h.4.对长出的单菌落进行编号，选择表面干燥、粗糙、不透明的菌落，挑取少许菌苔涂片，做芽孢染色，判断是否为芽孢杆菌。

（三）筛选1、从判定为芽孢杆菌的菌落处，分别挑取少许菌苔，先接种奶粉斜面培养基，再转接奶粉培养基平板上，30～32℃下培养24～48h。

蛋白酶产生菌的筛选及活力的测定作者刘艳芝指导教师张玲秀（忻州师范学院生物系 1201班 034000）摘要：采用忻州师范学院校园附近土壤、农田土壤及体育场土壤作为样品，并从中筛选分离并得到产蛋白酶能力较高的菌株，经过初步鉴定该菌株属芽孢杆菌。

通过对其产酶条件进行优化，结果显示该菌产酶最佳碳源为质量浓度15g/L的乳糖，最佳氮源为质量浓度20g/L的尿素，最适初始pH值为6.5，最适发酵温度为35℃ 。

关键词：菌种筛选；鉴定；蛋白酶；条件优化蛋白酶蛋白质中肽键水解的酶，是一类广泛应用于皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面的重要工业用酶，也是目前世界上产销量最大的商业酶，其市场占有率约占整个商品酶销售量的60％，微生物蛋白酶从微生物中提取，不受资源、环境和空间的限制，具有动物蛋白酶和植物蛋白酶所不可比拟的优越性。

目前，蛋白酶的研究仍注重于新品种的发掘，并通过分离筛选、发酵条件优化和诱变育种或构建基因工程菌等综合手段获得高产蛋白酶的优良菌株。

我国的蛋白酶研究还存在如微生物资源开发不足，蛋白酶种类较少，酶制剂品种单一等问题。

本论文从以下几方面对蛋白酶产生菌株进行较为系统的研究：从土壤中筛选出产蛋白酶能力较高菌株。

对筛选出的菌株进行形态学的鉴定，将菌株初步确定到属。

研究产蛋白酶菌株发酵产酶条件，对培养基成分和发酵条件进行优化，确定最佳培养基配方和发酵条件，进一步提高菌株的产酶活力。

1、材料及方法：1.1 实验材料与仪器实验仪器：高压灭菌锅，恒温培养箱，超净工作台，电子分析天平，pH测量仪，水浴锅，微波炉，紫外光可见分光光度计，摇床、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、量筒、容量瓶、漏斗、试剂瓶、漏斗、载玻片、滤纸、擦镜纸。

1.2 实验材料：样品：取自忻州师范学院附近的土壤。

试剂：无菌水（带玻璃珠）、100ug/ml 酪氨酸溶液、PH8.0硼酸缓冲液、0.4mol/L三氯乙酸、牛肉膏蛋白胨培养基、酪蛋白培养基、产蛋白酶发酵培养基二、操作步骤（一）配制所需培养基按照以下配方配制所需的培养基牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏 0.5g，蛋白胨1g，NaCl 0.5g，琼脂 1.5～2.0g，水 100ml，pH 7.2，配制200mL酪蛋白培养基：牛肉膏0.3g，酪素 1g，NaCl 0.5g，琼脂2g ，定容于100ml产蛋白酶发酵培养基：玉米粉6g，豆粉4g，磷酸二氢钾0.03g，碳酸钠0.1g，磷酸氢二钠0.4g，定容于100ml（二）分离1.洗涤培养皿、试管等实验器具，与121℃高压灭菌20min2.采集土壤样品，用无菌水植被1:10土壤悬液。

蛋白酶产生菌的筛选、鉴定及酶学性质研究作者：李婵娟，王婧，杨洁来源：《湖北农业科学》 2015年第19期李婵娟１，王婧２，杨洁２（１．华中农业大学楚天学院，武汉４３０２０５；２．湖北省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，武汉４３００６４）摘要：采用干酪素平板透明圈法从垃圾附近的土壤中分离得到１株产蛋白酶的优良菌株，通过测定其１６ＳｒＤＮＡ基因序列，鉴定该菌为铜绿假单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）。

以酪蛋白为底物对该菌所产蛋白酶粗酶液进行了酶学性质研究，结果表明，该酶最适反应ｐＨ为８．５，为碱性蛋白酶；在ｐＨ６．０～９．０的缓冲液中于４℃放置１２ｈ后仍有９０％以上的酶活性，说明该酶在中性和碱性条件下非常稳定。

该酶最适反应温度为５５℃，在７０℃和８０℃处理３０ｍｉｎ后仍分别保有６８％和４５％的残余酶活性，从而表明该酶具有较好的热稳定性。

Ｍｇ２＋和Ｆｅ２＋对该酶活性几乎没有影响，Ｋ＋和Ｍｎ２＋对该酶活性有轻微的抑制作用，ＥＤＴＡ对该酶活性有明显的抑制作用；Ｃｕ２＋对该酶活性也有２６％的抑制作用，只有Ｃａ２＋对该酶活性有１０％左右的促进作用。

关键词：蛋白酶产生菌；分离；鉴定；酶学性质中图分类号：Ｑ８１４．１文献标识码：A文章编号：0439－８114（２０15）19－4794-04DOI:10.14088/ki.issn0439-8114.2015.19.035ＩｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＡＰｒｏｔｅａｓｅ－ＰｒｏｄｕｃｉｎｇＢａｃｔｅｒｉａａｎｄＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＩｔｓＰｒｏｔｅａｓｅＬＩＣｈａｎ－ｊｕａｎ１，ＷＡＮＧＪｉｎｇ２，ＹＡＮＧＪｉｅ２（１．ＣｈｕｔｉａｎＣｏｌｌｅｇｅ，ＨｕａｚｈｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｈａｎ４３０２０５，Ｃｈｉｎａ；２．ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＱｕａｌｉｔｙＳｔａｎｄａｒｄａｎｄＴｅｓｔｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙｆｏｒＡｇｒｏ－Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＨｕｂｅｉＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗｕｈａｎ４３００６４，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｂａｃｔｅｒｉｕｍｐｒｏｄｕｃｉｎｇｈｉｇｈｐｒｏｔｅａｓｅｗａｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｓｏｉｌａｒｏｕｎｄｔｈｅｄｕｍｐｂｙｍｅｔｈｏｄｏｆｃａｓｅｉｎｐｌａｔｅ．ＴｈｅｓｔｒａｉｎｗａｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄａｓＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａｂｙｍｅａｓｕｒｉｎｇｉｔｓ１６ＳｒＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ｔｈｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｔｈｅｃｒｕｄｅｐｒｏｔｅａｓｅｐｒｏｄｕｃｅｄｂｙｔｈｉｓｓｔｒａｉｎｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄｂｙｕｓｉｎｇｃａｓｅｉｎａｓｔｈｅｓｕｂｓｔｒａｔｅ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｃｒｕｄｅｐｒｏｔｅａｓｅｄｉｓｐｌａｙｅｄｔｈｅｍａｘｉｍｕｍａｃｔｉｖｉｔｙａｔｐＨ８．５，ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｔｈｉｓｅｎｚｙｍｅｗａｓａｎａｌｋａｌｉｃｐｒｏｔｅａｓｅ．Ｔｈｅｃｒｕｄｅｅｎｚｙｍｅｓｔｉｌｌｈａｄ９０％ｏｆｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔａｃｔｉｖｉｔｙａｆｔｅｒｏｖｅｒｎｉｇｈｔｉｎｃｕｂａｔｉｏｎａｔ４℃，ｐＨ６．０～９．０，ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇｔｈａｔｔｈｅｅｎｚｙｍｅｗａｓｖｅｒｙｓｔａｂｌｅｕｎｄｅｒｎｅｕｔｒａｌｏｒａｌｋａｌｉｎｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｏｆｔｈｅｅｎｚｙｍｅｗａｓ５５℃．Ａｆｔｅｒｉｎｃｕｂａｔｉｏｎａｔ７０℃ ａｎｄ８０℃ ｆｏｒ３０ｍｉｎ，ｉｔｒｅｍａｉｎｅｄ６８％ａｎｄ４５％ｏｆｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔａｃｔｉｖｉｔｙ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｓｏｔｈｅｐｒｏｔｅａｓｅｗａｓｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄｔｏｈａｖｅａｓｕｐｅｒｉｏｒｔｈｅｒｍａｌｓｔａｂｉｌｉｔｙ．Ｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｔｈｅｐｒｏｔｅａｓｅｍａｙｂｅｄｅｐｅｎｄｅｎｔｏｎｄｉｖａｌｅｎｔｍｅｔａｌｉｏｎｓ，ｂｅｃａｕｓｅｉｔｗａｓｎｏｔａｆｆｅｃｔｅｄｂｙＭｇ２＋ｏｒＦｅ２＋ａｎｄｗａｓｓｌｉｇｈｔｌｙｉｎｈｉｂｉｔｅｄｂｙＫ＋ａｎｄＭｎ２＋，ｂｕｔｗａｓｏｂｖｉｏｕｓｌｙｉｎｈｉｂｉｔｅｄｂｙＥＤＴＡ，ｓｔｒｏｎｇｌｙｉｎｈｉｂｉｔｅｄｂｙＣｕ２＋，ｒｅｄｕｃｉｎｇｂｙ２６％ｏｆｉｔｓａｃｔｉｖｉｔｙ，ａｎｄｏｎｌｙＣａ２＋ｃｏｕｌｄｉｎｃｒｅａｓｅｄｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｂｙ１０％．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｐｒｏｔｅａｓｅ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇｂａｃｔｅｒｉａ；ｉｓｏｌａｔｉｏｎ；ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ｅｎｚｙｍａｔｉｃｐｒｏｐｅｒｔｙ收稿日期：２０１５－０６－１５基金项目：湖北省农业科技创新中心资助项目（２０１４－６２０－０００－００１）作者简介：李婵娟（１９８３－），女，湖北武汉人，讲师，硕士，主要从事微生物工业应用和酶分子工程研究，（电话）１５６２３０１７３５８（电子信箱）２１４８０７８２４＠ｑｑ．ｃｏｍ；通信作者，杨洁（１９６９－），女，湖北武汉人，副研究员，主要从事食品分析与应用研究，（电话）１３２９７９４９６３１（电子信箱）jiangjie１１２７＠１６３．ｃｏｍ。

蛋白酶产生菌的筛选蛋白酶是一种能够水解蛋白质的酶类，广泛应用于医药、食品、饲料等多个领域。

因此，对蛋白酶产生菌的筛选具有重要意义。

下面将对蛋白酶产生菌的筛选进行详细介绍。

一、菌种的选取菌种的选取是筛选蛋白酶产生菌的第一步。

一般来说，优秀的蛋白酶产生菌应具备以下特点：1.适应性强：具有广泛适应环境的能力，能够在多种环境中生存繁殖；2.高酶产量：产酶量高且稳定，生产成本低；3.酶活性好：酶活性高，能够快速、高效地降解蛋白质；4.易于培养：易于培养和维护，适应不同的培养条件。

根据以上要求，我们可以选取一些常见的微生物菌株，如大肠杆菌、真菌、放线菌等。

此外，一些原产于自然界中的微生物资源也是优秀的菌株来源，在筛选蛋白酶产生菌时应予考虑。

二、菌群的分离菌群的分离是筛选蛋白酶产生菌的关键步骤。

在这一步骤中，我们需要将每一种菌株分离出来，以便进行后续的酶活性检测和分析。

常用的分离方法包括平板法、液体培养法、筛选法等。

其中平板法是最为常见的方法，其步骤如下：1.准备培养基：根据选取的菌株特性，准备适宜的培养基，以促进菌株的生长和繁殖；2.分离：将样品按照一定稀释倍数涂布在平板上，然后放入培养箱进行培养；3.单菌分离：观察培养基的著色情况，辨别每一个菌落，最后用无菌酒精燃烧消毒的针头将每个菌落刺到含有相同培养基的试管中进行液体培养；4.鉴定：确定单菌培养基量大于10^6时，进行细胞分类和鉴定。

三、酶活性检测酶活性检测是筛选蛋白酶产生菌的重要环节，可以通过掌握酶活性信息来评估菌株的产酶能力以及蛋白酶的种类和活性等。

我们可以通过以下方法进行酶活性检测：1.酶联免疫吸附测定法（ELISA）：其原理是将特异性抗体与酶偶联，加入样品中，利用抗体与酶偶联物发生特异性相互作用，用底物染色，观察染色情况以确定酶活性；2.凝胶电泳：将分离纯化的酶嵌入聚丙烯酰胺凝胶中进行分离和检测；3.酶活性测定：以酶降解底物的反应速度作为酶活性的指标，通过比色、荧光和放射等不同方式进行检测。