膜片钳的发展和应用1．背景细胞是生物的基本组成单元，细胞外围有一层薄膜，彼此分离又互相联系，细胞间与细胞内的通信、信号传递依靠其膜上的离子通道来进行，离子和离子通道是细胞兴奋性的基础，亦是产生生物电的基础。
生物电信号通常是用电学或电子学的方法进行测量。
早期多采用双电极电压钳技术作胞内记录，近年来逐渐被膜片钳所取代，这项技术为从细胞和分子水平了解生物膜离子单通道“开启”和“关闭”的门控动力学及各种不同离子通道的通透性和选择性等膜信息提供了最直接的手段。
膜片钳记录(patch clamp recording)是利用玻璃微电极吸引封接面积仅为几个um2的细胞膜片，在10-12A水平，记录单个或几个通道的离子电流，已达到当今电子测量的极限。
此技术广泛用于细胞膜离子通道电流的测量和细胞分泌、药理学、病理生理学、神经科学、脑科学、植物细胞的生殖生理等领域的研究。
从而点燃了细胞和分子水平的生理学研究的生命之火，并取得了丰硕的成果。
2．膜片钳技术简介2.1 基本原理和记录方法电压钳(V oltage-clamp)是由英国学者Huxley和Katz最先应用的[1]。
其实质是通过负反馈微电流放大器在兴奋性细胞膜上外加电流，保持细胞跨膜电位不变，并迅速控制其数值，以观察在不同膜电位条件下膜电流的情况。
膜电流的改变反映了膜电阻和膜电容的变化，因此电压钳可用来研究整个细胞膜或一大块细胞膜上所有离子通道的活动，但该技术由于在细胞内插人两根电扳，对细胞损伤很大，在小细胞中难以实现，又因细胞形态复杂，很难保持细胞膜各处生物特性的一致，而逐渐被膜片钳所取代。
膜片钳技术(patch-clamp)是在电压钳基础上发展起来一种新技术，与电压钳的主要区别有二：一是钳制膜电位的方法不同；二是电位固定的细胞膜面积不同，即所研究的离子通道数目不同。
与电压钳一样，膜片钳也是利用负反馈电子线路，将微电板尖端所吸附的一个至几个平方微米的细胞膜电位固定在一定水平，观察流过通道的离子电流。
其实现膜电位固定的关键是在玻璃微电极尖端边缘与细胞膜之间形成高阻封接，使电极尖开口处与相接的细胞膜小区域(膜片)形成无论是从机械上还是电学上都极为紧密地封接，从而可反映细胞上单一(或多数)离子通道的分子活动[2]。
1976年，德国科学家Neher和Sakmann首先用此技术对蛙胸皮肌细胞膜上的己酰胆碱受体通道进行了研究，记录出了量值在皮安级(10-12 A)的微弱电流[3,4]。
1981年，经Hamill等[5]后人的进一步完善，其电流测量灵敏度已达1pA，时间和空间分辨率达10 us和1 um。
随着膜片钳技术的出现，目前有几种不同的记录方式：(1)细胞吸附式(cell-attached patch)将两次拉制后，经热抛光的微管电极置于清洁的细胞膜表面, 形成高阻封接，在细胞膜表面隔离出一小片膜，即通过微管电极对膜片进行电压钳制，从而测量膜电流。
(2)内面向外模式(inside-out patch)高阻封接形成后，将微管电极轻轻提起，使其与细胞分离，电极端形成密封小泡，在空气中短暂暴露几秒钟后，小泡破裂再回到溶液中，使小泡的外半部分破裂即得。
(3)外面向外模式(outside-out patch)高阻封接形成后，继续以负压抽吸，膜片破裂，再将玻管慢慢从细胞表面提起，断端游离部分自行融合形成脂质双层而得到。
(4)全细胞模式(whole-cell mode)在细胞吸附式的基础上，继续以负压抽吸，使电极管内细胞膜破裂，电极内液与胞内液直接相通而得到。
此方式既可记录膜电位又可记录膜电流。
(5)穿孔膜片钳记录(perforated patch mode)，为克服常规全细胞模式的胞质渗漏问题，有学者将与离子亲和的制霉菌素或二性霉素B经微电极灌流到含有类甾醇的细胞膜上，形成只允许一价离子通过的孔，用此法在膜片上做很多导电性孔道借此对全细胞膜电流进行记录。
由于此模式的胞质渗漏极为缓慢，局部串联阻抗较常规全细胞模式高，所以钳制速度很慢，故也称为缓慢全细胞模式。
2.2 膜片钳的技术特点膜片钳技术是用微玻管电极(膜片电极或膜片吸管)接触细胞膜。
以吉欧姆(GΩ)以上的阻抗使之封接．使与电极尖开口处相接的细胞膜的小区域(膜片)与其周围在电学上绝缘，在此基础上固定电位，对此膜片上的离子通道的离子电流(pA级)进行监测记录的方法。
膜片钳记录技术的优点有：①最主要的是在GΩ封接形成的结果使漏出的电流极少，所以能正确地进行电压固定；②GΩ封接使背底噪声水平达到极低。
因为由热噪声(Johnson噪声)引起漂动的标准误差与阻抗的平方根值成正比，所以，巨阻抗封接时可达到最小；③膜片钳法对一般较小细胞也能在电位固定的条件下记录出膜电流；④膜片钳技术可以直接控制细胞内环境。
2.3 应用领域和最新进展膜片钳技术广泛用于细胞膜离子通道电流的测量和细胞分泌、药理学[6]、病理生理学、神经科学[7]、脑科学、植物细胞的生殖生理等领域的研究。
从而点燃了细胞和分子水平的生理学研究的生命之火，并取得了丰硕的成果。
在体膜片钳技术在体膜片钳是指在麻醉动物上直接对其脊髓或大脑神经元进行膜片钳记录的技术。
与分散神经元或组织片膜片钳技术比，最突出的优点是能够在整体条件下研究中枢神经元离子通道和突触活动的生理特点，还可通过口服及注射等整体给药途径观察药物作用，为从宏观角度研究和探讨作用于中枢神经系统药物的作用机制提供了新的途径。
在体膜片钳面临的难点在于：1）前期准备步骤复杂。
动物麻醉后，还要继续静脉滴注麻醉剂以维持深度麻醉状态，同时适量补偿葡萄糖；另外还需要做胸廓切开术，使用人工呼吸机，同时检测CO2潮气量、血压、心跳等。
2）形成高阻封接困难。
目前在体全细胞记录仍采用“盲插”，即在看不到细胞的情况下进行电极穿插。
由于在体神经元的体积较小，这样电极是否遇到细胞就很难判断。
另外，在体情况时，软脑膜几乎不可能剥离，并且神经元周围有大量的胶质细胞和纤维包围，这样电极在穿插过程中很容易堵塞。
目前只有通过施加正压保持电极清洁。
有实验室尝试使用辅助电极清理神经元表面。
辅助电极的尖端略大于膜片电极，施加较大正压，吹散周围组织，暴露神经元。
但这样增大了操作难度，并很可能损伤脑或脊髓组织，违背应用在体膜片钳技术的初衷。
德国马普研究所在最新研究报告中提出了靶向定位的方案，通过结合双光子显微镜、基因操作表达荧光标志技术，建立了双光子靶向膜片钳技术(two-photon targeted patching，TPTP)，进行在体全细胞记录研究[8]。
首先通过基因操作在动物脑内目标神经元中构建特异表达的荧光标记。
同时，在电极内液中也加入荧光剂，然后利用浸水荧光显微镜锁定神经元特异表达的荧光标志和玻璃电极内的荧光，以此为标记，在可视条件下，进行玻璃电极和神经元的封接和全细胞记录。
这样基本可以做到对特定神经元亚群的靶向研究。
如图1。
总之，整体动物实验反映的生理活动是体内各种生命过程的综合表现。
不仅视觉听觉触觉等必须应用整体动物模型，其他基本的神经生理活动的本质也将随着高新技术的出现，以无损伤非侵入式的方式，在整体动物模型上得到证明。
因此，应用在体膜片钳技术将会成为必然的选择。
阵列膜片钳技术膜片钳阵列最初的设想足在一个384孔微板的每一个孔底部安装电极，每一个电极都连接一个放大器，并能进行全细胞记录，从而完成离子通道活性的大规模平行筛选[9]。
随着研究的不断深入，膜片钳阵列技术主要向2个方向发展，即基于微管的膜片钳电极阵列技术及平面膜片钳电极阵列技术。
由于平面膜片钳电极阵列技术是在平面材料上刻蚀孔来代替电极进行细胞的吸附，相对于微管电极阵列技术，可以达到更大的通量，成为科研人员目前研究的主要技术。
平面膜片钳阵列方法避免了电极微操作过程、显微镜的使用以及电极震动分离的可能性。
而且由于它的电容、通路电阻和绝缘体噪音更低，可以达到更高的记录水平。
由于电极的表面平坦，阵列装置完全适合于探针扫描技术的应用。
当扫描和电记录能同时进行时，一种新的阐明离子通道结构与功能关系的实验方法将变得可行。
另外，透明的平面电极也适合于光学测量。
但是，平面电极阵列技术仍然面临一些挑战，如寻找制作平面电极的合适材料(如硅、玻璃、塑料等)以及能够提高精密度和一致性的构建技术等。
相信新的电极技术将极大地简化传统的膜片钳记录技术[10]。
全自动膜片钳技术随着科学的进步，时代的发展，使用传统微管电极进行膜片钳记录的自动化已基本实现。
有许多文献报道了膜片钳技术自动化方面取得的成绩。
Sophion公司已经研制了一个机器人膜片钳系统，在这个系统中，机器可以在显微镜下自动定位细胞、定位管和建立记录。
在CeNeS公司研究的装置中，细胞悬浮在一滴溶液中，一根玻璃电极从下面接近液滴，并与集中在气水界面的细胞接触，吸附以后自动进行电记录的操作。
自动化降低了仪器对操作者的依赖性，但显然仍不适于高通量应用。
近年来，在自动化技术基础之上，微管电极阵列开始逐渐发展。
Straub等在硅片芯片上设计晶体管微阵列与细胞形成高阻封接进行电记录，与传统膜片钳记录方法比较，使用这种方法形成封接之后通道的功能是完全的。
Csicsvari等使用硅电极微阵进行了神经细胞活性的平行记。
Nanion公司的PatchLiner NPC-16 ，Molecular Devices公司的Ionworks HT和PatchXpress 7000A全部采用的是平板微阵列技术。
其技术特点如下：在平板电极上打磨或者使用金属离子轰击成孔，每孔都是大小均一的直径约1～21xm的小孔，每个小孔下面有电极连接到放大器，可对实验过程中的电流变化进行记录。
将细胞悬浮液加载到平板玻璃孔上，通过调节压力和吸力，一个细胞便可以自动定位在小孔上(相当于微管电极的尖端)，自动进行封接，自动判断封接并进一步施加负压破膜以进行全细胞模式实验。
Flyion公司采用的是翻转膜片钳技术(FLIP-THE-TIP)，全部操作过程由软件设定机器人完成。
流程如下：机器人自动将细胞注入Fliptip微管(Flyion公司专利技术)，然后自动把细胞冲洗到管尖底部，在负压的吸引下形成传统的吉欧封接。
自动判断封接形成是否良好并自动破膜形成全细胞模式。
随后，药物化合物等可以被自动应用到管内进行全细胞模式实验。
这种方式形成的膜片钳完全排除显微镜和显微操作，从而革命性的实现膜片钳技术的全自动化。
3．在生物医学工程中的应用生物医学工程(Biomedical Engineering, BME)是综合生物学、医学和工程学的理论和方法而发展起来的新兴边缘学科，其主要研究方向是运用工程技术手段，研究和解决生物学和医学中的有关问题。
多学科的交叉，使不同于那些经典的学科，也有于生物医学和纯粹的工程学科。
