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膜片钳实验技术系列讲座：第十一部分2p麒拭,广膜片钳实验技术系列讲座第军太轰西安10032)岁一,(第四军医大学基础都解剖学教研室.攀悻琚脯研究中心.西安7I～第十一部分钙荧光测光和膜片钳相结合的同时测定技术(梗车洁一古家喜四夫t日本生理学杂志199557;u7～126)前言超活体染色技术是使活细胞摄入色素,观测其经时程的形态学变化的技术.因为经过超活体染色的细胞仍具有生理活性,所以可以对活细胞的特定细胞内器官的形态学变化和生理活动进行经时程的观察.用此技术已获得了很多关于细胞间缝隙连接(gapjunction),分泌颗粒的释放和细胞内吞功能等的信息.此技术不仅用于形态学观察,而且通过开发反映细胞内的状态(如pH值,ca和电位等)的各种色素可进行定量分析研究.特别是荧光色素由于其敏感性高,用量甚微.所以近年已逐渐推广.最具有代表性的物质是Tslen的研究组开发出来的.这是一系列以EGTA为基础而设计出来的分子,从Quin-2…开始到fura-22_.indol嘲等多种钙敏感性荧光色素.特别是fi~ra一2和indo1与钙结合可发生激发光波长和荧光波长的改变(shiK),利用此性质在两种波长上求出它们的荧光比值(ratiomeasurementofnuorescenceintensity);可在不依赖所导入荧光素量和细胞膜厚度的情况下,求出与钙浓度有直接关系的值.Ts]en等叉将这些承蒋性色素结合上Ace—toxymethy](AM)基使之成为疏承性.藉此只从细日细作发展了起来0].用此技术可以观察和记录一十分子通遭(单通遭)的电变化.膜片钳技术是在实时(real- time)状态下记录单一分子时回变化的唯一方法.应用膜片钳技术,可以通过膜的穿破记录到细胞的整体电流(wholecellrecording)}也可进一步将电极内物质导入细胞内或进行细胞内容物的交换.用此技术.业已在G蛋白磷酸肌醇代谢等细胞内信息传递系统的研究方面取得了飞跃进展.膜片钳技术也适用于过去用细胞内电艟难以记录到的小细胞.由于细胞内钙测定法和全细胞膜片钳法已较昔及.两种方法的并用已是大势所趋.我们为了观测乳腺上皮细胞的自发性超极化电位震动和细胞内钙震动是否同时发生,并为了对细胞内第二信使的测定. 使用膜片电撮注入有关物质测定了钙的反应如果具备了细胞内钙浓度光学测定法t~-T]和通过膜片钳等进行的电测定法等所用的仪器,则对两者同时进行测定和记录并不是很困难的.有关这两种测定技术的介绍,请分别参看有关较详细的综述.本文重点以自身经验为基础以两种技术的结台使用中出现的实际问题及解决办法为中心进行叙述.设备条件1.显徽镜等显微镜应根据所使用的各种实验材料来选择如倒置显微镜,正置显微镜(上下移动,承浸物镜即可)或实体显徽镜等,但无论何种显微镜都一定要装睬军?钙荧光珂光和膜片钳相结合的同时测定技术285 有荧光装置(落射型).如果用紫外光(uv)激发的fura一2和indo1通过荧光强度比来定量钙则需使用与uV相对应的光学系统和物镜.在观察荧光的屙时,为了使膜片电极抵近细胞并与之接触,需使用相差或Nomar~i微分干涉等装置以观察其透过像.最近已有将荧光和Nomarski同时观察的显徽镜问世(有的也可能不和uv对应),但在使用时常颓更换镜头和转动Nomarski微分干涉聚光镜,造成不能对准细胞进行钳制的状态.另外t为了测光必须更换光路时,震动也成为问题.解决的办法有二一种是将聚光镜的光圈垒部关闭截断Koehler氏照明的透射光I另一种方法是将电极在透过像上边观察边调节至细胞的正上方,然后把荧光测光装置装配到显微镜上,接着慢慢地下移电极并通过示坡器来观察电阻抗变化以判断电极已否接触细胞.如果实验者再下些功夫,则可以在荧光最I光的同时通过电视监视屏观察其透射像.在使用fura一2 荧光(波长510nm)时,困其波长与显微镜观察时常用的绿色滤色片的透射光波长相近,所以同时使用可引起点测光中出现photomultifler噪声.此时用红色滤色片(波长>610nm)过滤观察光可以解决此问题.TV摄像机对红光感度较好,不会产生像质问题.至于红色滤色片则既可使用显微镜中的Barrierfi1. ter,又可用普通照相机上用的R:filter.在用TV摄像机观察Ca荧光的情况下,可将分色镜(dichroic mirror)装入TV摄像机光路使荧光和红色光分离,然后分刖用不屑的TV摄像装置来观察为了观察荧光,应将荧光装置置于暗处,但不一定要垒暗室.可以考虑用黑幕遮盖膜片钳用的屏蔽罩,或在用铝板制的屏蔽里面涂上黑色.此外.还可以在显微镜载物台前立一块屏幕.如此即使室内稍亮也不防碍测定荧光.2.钙测光装置钙漤0光技术可用photomultifier的点(spot)测光法(如0lympusOSP一3,OSP一10.NikonP一102等) 和用高感度TV摄像机(SIT,imageintensifiertube,冷却CCD等)的图像分析法(如Hamaphoto的AR—GUS50等但在与膜片钳的电现象同时进行钙测光时,常用点测光法,其理由是:(1)点测光法的时间分解能强.但最高不过1～10ms,远较电学测定为差j但较之图像分析法的最高不过33ms却较好(2)圜膜片钳的电铡定只是在一个细胞上进行的,在一点上即可满足同时测定的需要I(3)可与电学测定较容易地同时获得数据.当然,在拟观察细胞内空间分布和在脑薄片等观测钙变化模式对,必颓使用图像处理法.在不活动的标本上只以测定钙变化为目的时.可使用图像分析法的一种变法即实时图像差分法(real—timeimaging).此方法是将Iura一2的340nm激发荧光或fluo一3等荧光像的TV摄像机输出通过实时处理图像的装置(日本AvionicsImage=1, HamaphotoARGUS—l0,DSP一1000,3000等)而取得实时差分以增强反差,最终使荧光的变化成为可视化.这是一种观察钙变化的较廉价的方法.而且可用VTR(Videotaperecoad)来保存图像.这种方法也适用于筛选适于膜片钳法的细胞.倒如钙震动只发生于局限在视野中的细胞,则可以首先用图像来检查井确定此细胞确实为钙震动的细胞,然后用膜片微电极接触这个细胞并开始记录.3.数据处理在拟将膜片钳记录数据和钙点测光数据结台时t只将取自两种装置的数据进行模拟(analog)记录即可将两种数据重台起来.然而在拟屑时取得二个快速现象的数据时,或拟对数据进行加工处理时,则应从开始即将数据存入电脑.如此,则不论膜片或钙的任何一方的程序都可简单地摄取另一方的数据(图1).一般,Ca抖取样间隔(1ms～数百ms)较膜片钳的取样间隔(1O～1ms)缓慢,因此,可在钙取样阿隔较台适的情况下将膜片钳记录数据通过A/D转换器读到钙软件上(图la)我们编制了能将A/D转换器输入到OlympusOSP一3系统上的软件(Mi—CaCkan,见后述)并实现了上述过程].图1将膜片钳测定系坑和钙刮光秉坑连结同时进行测定的方法.将膜片钳的辕出连结到电瞌B的A/D辕人(a)或将钙燕光的荧光比通过D/A逐步模拟输出(b,对向电脑A输人的方法根据目的雨分别使用.在膜片钳翰抻经解耐学杂志第1z卷第3期1996年9月出上置人可"调整gain的放大嚣和Highcutfilter即可我甘]用的电脑A是IBM兼窖机和pCLAMP,电脑B是NEC—Pc和MiCaChan.在以快速膜片钳记录数据为主的情况下,也可将钙测光数据读到膜片钳的软件上(图lb).例如.可将钙测光数据输入到膜片钳软件pCLAMP(Axon Instruments)的A/D输入2频道上.针对钙测光数据,我们使用的输出是经D/A变换了的输出,这是经D/A转换器将OSP一3的荧光比致据进行D/A变换的.如单纯看荧光变化,则可将photomultifier(点铡光器)或photodiode(光电转换装置)置于显微镜图像处理装置上来测定荧光强度变他.在荧光图像上同时测量离子通道电现象时,如何将荧光图像与膜片钳记录致据结合起来使用是十问题.用A/D转换器可将膜片钳记录数据读入,而且也可用图像输入输出板将其重叠在画面上_1.但它虽可以在学会上做录相展示,却很难制成论文的插图.最简单的方法是将荧光图像与膜片钳记录数据分别记录,然后将两种数据的起始点和时间轴重合起来使用.如果只需将图像中某一点的致据抽出,则可通过在TV画面上装上一十光电管(phototran- sistor)以使图像的明暗度信号化".或使用图像输入输出板将荧光和差分图像输入电脑,然后计算要测定部位的浓度并再经D/A转换器输出使其经与膜片钳输入的同一通道进行同时记录0(图5).图2显示的是我们实验装旨的植式圈.Analogr~order).点测光激发光滤色片转换和珂光控制系统经GpIB辕入B电脑而进行.执田1中可见钙信号和膜片钳记录艘完好地结台起来然后通过电脑或Analogrecorder记录.荧光图像是用与imageintensifier(1)相连接的超高感度丁V摄像装置和图像处理装置摄取的,然后用vTR或videoprinter打印记录出来.另外.经Im一日gememory将图像棺人B电脑.将特定情况下的荧光强度做模拟输出.同时用红色透射光观察细胞.各种问题及其对策1.电噪声田同时启动膜片钳记录装置和钙测光装置可造成装置过大,容易使噪声(50Hz或高频波)混入膜片钳记录的电信号中.特别是钙测光装置原来并未考虑用于测定电信号,所以更易出现干扰噪声问题.就噪声对策而言,彻底杜绝噪声源和完善地接好地线是重要的.测噪声的方法是,在膜片钳时,首先不在放大器探头上接任何物件而对连结机器的噪声进行测试,然后装上电撮对来自空中的噪声进行检查.连接地线的基本原则是应尽量避免将地线绕在一起形成地线环路而产生电磁噪声.另外应注意之点是要将电源地线(仪器外壳)与连接仪器的电导线地线(如BNC接头的外层部)完全分离.首先要对法拉第箱(FaradayCage,电导体箱)内部如显微镜周围的仪器一一用检测仪表测试并确定是否所有仪器都确实接地.要对显微镜载物台,聚光镜和微操纵器粗调部,微调部等进行接地处理,否则会出现意想不到的高阻抗干扰.如有未接地的仪器存在,它即可象天线一样接受5O周干扰.其次要将记录仪器和电脑的外壳,台架,防震台和法拉第箱的地线统一整理后连接到电源地线上.对于台上型箱来说.固为法拉第箱的地线容易和台架的地线接触,所以应加以注意.如果能将连接仪器导线的地线与电源线地线完全分离开则不易出现噪声问题.在记录仪器中,有时会有仪器间电导线的地线与电源地线未分开的情况.此时,电源地线处于半接地状态.西为钙测光装置和电脑的A/D转换器等未特地将两者分离开,所以不可能将电导线地线与仪器外壳地线完全分隔开.如果使用带绝缘系统的仪器则可以实现以上要求,但固价格过高和需要双数, 所以不是理想的选择.在此情况下,如果有噪声干扰只能一十一十测试而哉出噪声源,然后再设法接好地线.在用台上型法拉第箱时,50周干扰也可以来自陈军t钙荧光光和膜片钳相结告的同时酬定技术天花板上荧光灯,应将箱的前方全部或上半部用金属网罩起或在显馓镜载物台的前面加屏蔽.在膜片钳放大器测定频率<10kHz时,激发光源氙放电管和超高压汞灯不会造成噪声干扰做为显微镜透射光源的卣素灯在灯的周日电源线常暴露,此时可在接通交流照明时产生s0周干扰,但可用铜网或铝铂遮覆进行屏蔽.电源导线也要做同样的屏蔽处理.然而对显微镜来说,因为镜身已与仪器连接导线的地线相接,所以可不子处理.最近用于电生理实验而设计的显馓镜多采用直流照明,所以大大减少了由它所带来的噪声干扰.容易引起噪声的另一个原因是电脑,特别是从CRT(阴设射线管)显示屏处来的高频干扰噪声.这个噪声虽然可固与仪器连接导线的地线完全分离而不应出现干扰问题,但如果不能防止这种干扰时一可在CRT电缆上缠绕上toroida]coret或在CRT上罩上防干扰屏.或在CRT与膜片钳放大器之间树立一块铝扳以消睬干扰噪声.如果能将电脑摆放在离膜片钳放大器较远处则效果更好些.2.机械震动和噪声当膜片钳微电极接触刘细胞时,可以见到在记录电流渡上有一个低频波振幅变化,将电柽拔出则可消失出现这种情况,首先应考虑的是地板震动.如用足踏地板可以看到有衰减震动.可断定即是由此造成的.最好的解决办法是使用充气垫将台面隔开的防震台.防震台有台上型和台型两种,台型要比台上型好很多,但价格太贵,搬动不方便.在铁台扳下放置网球,也可将自行车或轻型摩托车内胎医疗用气垫置于防震台中央.网球应半年更换一次.但这些都不如出售的商品防震台效果好.关于由地板震动所引起的干扰噪声,有时与实验室内仪器的摆放位置也有关.在同一房间内,仪器摆放在四周和中央也有不同,也与房上横粱处于什幺位置有关.要特别注意由空调造成的低频波.将听诊器贴在墙壁上听可判断何处有震动.如在震动最大的地方放置仪器,则即使使用防震台也无济于事, 只能将仪器迁移到无震动的位置.另外,还有必要注意防止固更换钙测光装置的漶片而引起的机械震动.用两种波长激发[ura一2时, 转换滤片可以引起震动,这是防碍膜片钳记录的主要原因.我们解决的办法是将滤色片转换装置从显馓镜上分离下来并将之固定在防震台框架上.使用光纤维照射系统则可不出现此问题.3.灌流系统在进行钙测光时,为了冲洗掉漏出的色幕而进行麓流是非常重要的因为就钙测光法本身而言,麓流所引起的液面摇动或吸引时产生的声音不影响钙测定,所以无关紧要.但是,在与膜片钳记录相结台使用时,上述情况常是造成干扰噪声的原因.因此,为了防止这种噪声,可考虑采用虹吸(通过调节流出口的高度来调节液面的高度)或毛细管现象(在麓流槽周边放置滤纸条等进行引流),对于流人液可使用高悬的麓流瓶来控制重力,由此调节流^液体的速度,并用输液装置的活塞调节流速.关于灌流槽(chamber),在使用倒置显馓镜的情况下,要充分考虑物镜的工作距离和标本的厚度如用可见光激发时,可以使用塑料皿和长焦物镜然而,如用紫外光激发荧光色素时.剥固塑料皿发荧光而不能使用.在使用这样的荧光色幕时,要用与紫外光对应的荧光用的物镜.困为这种物镜工作距离短要用盖玻片作chamber的底.盖玻片不一定用石英玻璃,用日本松浪社的No.1(O.13～0.17ram)即可.如图3所示.将园形盖玻片置于塑料皿底部在其上面培养(图3).使用2O×以下物镜时可移动培养皿进行测棍}但使用4O×以上或油镜时,要自己制作可以直接培养细胞的Chamber.或将带培养细胞的盖玻片直接在Chamber内进行计数.A日out~//]图3甩于黄光刮光的在盖玻片上进行细胞培养和茬谎用的Chamber.A,将3枚直径15mm的盖片{c)置^直径35mm的塑料培养皿中在其上面进行细胞培养.B,蒲流用Chamber是用塑料扳加工制成的底上睛着盖玻片,灌流维通过两杀细曾进出(in,out).将无关电楹(E)在婀方横向固定在Chamber上测定的准备工作色囊的负荷有两种方法可供选择:一种是使用结台AM基神经解剖学杂志第l2卷第3期1996年9月的脂溶性荧光素,将其直接置于细胞外液中另一种是将荧光素直接注入膜片微电撮然后在全细胞状态下将其导入细胞内.虽然使用结合AM基的荧光素方法简单,只需将其加入细胞外液中即可但是此方法对细胞缺乏选择性而用膜片电撮导入法可选择性地染色某一细胞,但技术上有一定难度如果是神经细胞,可以从神经断端注入fura-2dextran.我们是将2～4u1的fura一2一AM(用DMSO溶解,l raM)在petri皿中用35mM培养液2ml稀释(终维度为1～2M),然后放置3O～45分钟再进行观察. 如果长时问负荷,则钙反应消失或荧光在细胞内. AM基荧光色素是非水溶性的,所以要设法使之在水中扩散得充分些.根据细胞不同,也会出现染色不好的情况加入2左右的界面活性剂(CremophorEL等)或将色素溶液配成20u]左右则可改善染色效果通过电极将荧光色素向细胞内注入时,在电极内液中注入活性型色素(非AM基)30～100M左右Ⅲ.成为全细胞状态时色素即在细胞内扩散.2膜片龟极即使将全细胞膜片钳记录法与钙测光方法结台使用,前者在方法上也无什么大的改变用全细胞记录法时,电极内液进入胞内可影响细胞内钙浓度.为使电极内液与细胞内组成成分相同,通常用钙和EGTA来进行钙缓冲钙缓冲强砌可缓冲到细胞活动时的钙变化实际上所用的Ca/EGTA缓冲液是将ca抖调节至0.1～O.oltaM的程度,钙缓冲液的浓度为平时的i/Io或者用不加钙ca的电极内液也完全可以.在无钙的情况下.也可以用10d左右的fura一2代替EGTA_I因为电撮内蒗的缓冲蒗弱,所以要使用超纯水在塑料容器中配制.在电极内液中含有钙,EGTA等鳘台剂的情况下计算钙离子浓度时,须考虑离子强度和ATP共存等,日而不能简单视之.我们是使用shareware的IBM-PC软件Chelator(SehoenmakvrT,lg92)或{}1{崎开发的NEC—I软件"ca"来计算的Chelator是从电脑通信的NiftyServe的FBio获得的.测定的实际操作1.在点测光的同时进行测定measlarement)是指对位于浏膜钳制.将膜片钳放大器的输出与用于钙测光的电脑A/D转换器相连接,用MiCaChan软件对荧光和膜片钳记录数据进行同时测定和记录在形成巨阻抗封接后,将放大器的功能模式置于电流钳挡(currentclamp).在监视膜电位及膜电阻的同时,向电极腔内加负压则膜电位突然落到静息电位,即形成全细胞模式(图4A).在乳腺上度细胞,如果加入ATP则嘌呤受体被激活,细胞内钙增加,同时膜电位超极化(图4A).此超撮化是由细胞内钙增加而引起钙依赖性K通道开放所致_I.在从全细胞模式形成的瞬问到引起钙浓度变化,出现由机械性刺激弓f起的钙增加或电撮腔内钙过高的可能性.在发生机械性刺激时,如同时观察荧光图像则可得到钙波增宽的情报,A15rqi--10}05L;町∈一2O凸_一'0}z一6OL/\I\,B2O—O16妄12O-80'一0>一20t-一'0凸_一6O上一801300J湖00u5Ol88—300=200三1O0S50【,,20sec4同时记录fu2荧光比和膜电位的实倒.使甩的标车取自小鼠乳癌树立细胞系(MMT 060562).电楹内液古高K+0.18mMCa用078 mMEGTA进行弱鳘台.上,下的A和B图分别表示fum2黄光比和膜电位,上图右便I表示钙浓度推定值. A,ATP的作用,首先可见在细胞吸附模式下,在观察膜阻抗监视器的脉冲的阿时.递渐向电极腔内加负压而突瞎形成全细胞膜模式,此时静息电位<W)可被记录,向细胞外藏中口^100gMA TP时,同时可看到细胞内钙增加(上)和超极化电位(下).趋极化是由～睁l;军.钙荧光光和膜片钳相结合的同时定技术于细胞内钙增加所引起的钙傲犊性K通道的活化所致. B,显示的是『P,细胞冉导^的结果.这是事先将20FM,洼^徽电极内而同样地盎行的记录.记景显示丁从细胞嗳附模式形成垒细胞模式的■问(箭头)而发生的一过性细胞内钙增加和嘎电位超极化.用膜片电极也可以将细胞第二信使等物质直接导人直径小于10Fm的小细胞内.如此时同时铡定钙则可根据钙的变化鉴定活性的有无.图4B是用充填了含肌醇1.45--3磷酸(I)的电极对乳腺培养细胞进行的膜片锩记录的实例.在进行全细胞模式时在观察细胞内钙上升的同时可看到膜电位超极化现象.此反应显示只以高K溶液做为电投内液或加入IP.时并不发生反应的乳腺细胞有峨敏感性的胞内ca抖库的存在.2.使用圉诹转换器的同时测量我们根据用340nm擞发光所激发fura一2的荧光图象适合实时图像差分法的原理,使钙的变动可视化(图2).通过把TV信号梏出通过图像输入输出板(Micxotechnica,MT9801FMM)将差分图像导入记忆存贮器.井对某部分的图像浓度进行积分计算,将其经D/A转换器输出从而实现与单一通道同时记录的目的枷(图5).在事先用实时图像差分法对有钙震动变化的细胞进行判定的同时,用膜片钳法对单一离子通道进行记录.这样荧光变化可做为此细胞的监视指标.然后经D/A转换器对其浓度进行输出处理.1ImeIsBc.I图5单一离子通道活动和fura一2荧光的同时记景[.这是用340nm紫外光激发的负荷丁fura一2的乳癌缅胞,用宴时差分击观察荧光变化的结果.用0nm触发的荧光增加和钙增加相对应.对测量单通道变化的细胞的黄光变化通过图像记忆桓进行宴时模托}自出(real—timeanalogout)关于程序软件~(MiCa》.我们用Olympus的OSP?3开发出了能够同时对fura.2荧光进行点测光和对同一细胞进行膜片钳记录的程序软件(Measurement0fIntracellularc丑1-cium"MiCa").对荧光和电学现象同时记录时,此程序软件的名称为:Me丑surem∞tofIntraeellular CalciumandChannel,爱称为MiCaChan.目为应用此软件可同时使用荧光测光和A/D,D/A转换器,在荧光测光的同时即可摄人analogdata,而且可将荧光比进行直接analog输出.此软件也适台于长时间同断照明方法所进行的长时程记录.另外对用单波长激发的单波长荧光索如Fluo?3,Rhod?2等也适用. 如果在电现象记录较慢的情况下(图4A,B),也可以从A/D转换器中将荧光测光的每一点都取一点进行铡定.而在如电冲动那样经时迅速的情况下,每次取样只衙几十s,在UPS?3其时问分解能是不够的, 所以不能直接读取数据.此时可将fura?2荧光比或荧光强度经D/A转换器输出,然后将此输出与膜片钳记录同时存贮在数据记录仪中f或经A/I)转换器将Ca抖测光结果与膜片钳的电现象做同时记录(图2).用此方法所需的硬件包括?OlympusOSP?3, NECPC.9801,GPIB转换板,A/D转换器用Canopus DMA板,ArlaloEProNeolog.而D/A转换器用CanopusDMA或Ado如ck.CMiCa》是免费软件.登记在NiftyServe的FBio上(电脑通信的公司)结语荧光冽光法不仅限于钙测光,也广泛适用于其它用荧光观察生理活性和形态变化的研究.另外膜片钳技术在离子通道和电流测定以外也用于膜电容冽定和细胞内第二信使导入的研究将两种技术完美地结合起来更有利于取得新的研究信息.纵观本章所述的内容,大多数还是以膜片钳技术的设置为。
膜片钳实验技术入门------基本原理与操作关兵才 李国华 刘理望按：本文乃于2003年根据较旧型号的仪器写成，后被《机能实验科学》 （郑先科主编，北大医学版，2006）收入。
因新旧仪器基本原理和操作步骤大同小异，现对原文略作修改和标注，供同学们参考。
【实验目的】1. 了解膜片钳技术的基本原理和操作。
2. 初步学习电压依赖性离子通道电流的基本记录方法。
【实验原理】一、膜片钳技术原理简介膜片钳(patch clamp)是一种主要用于检测细胞膜离子通道活动的电生理技术，按工作方式可区分为电压钳(voltage clamp)和电流钳是最基本的工作方式，即对细胞膜电位进行人为控制，如将膜电位钳制于某一固定水平，或在此基础上再施以阶跃(step)式或斜坡式(ramp)电压刺激，同时记录跨膜电流，从而分析细胞膜通道的活动。
电流钳即人为控制经微电极对细胞进行注射的电流（等于离子通道电流与细胞膜电容电流之和），同时记录膜电位及其变化。
若注射电流为零即常用的零位钳流，用于测量细胞膜静息电位，若注射方波脉冲刺激电流，用于诱发、观测动作电位。
另外，膜片钳技术还常用于观测细胞膜电容, 从而推测分泌细胞的活动情况。
下面主要介绍其电压钳工作方式的基本原理。
（注：在电生理资料中，因通常将细胞外液和记录系统的“地”点相连作为参考点即零电位点，所以电位和电压两个概念经常混用。
）根据膜片钳实验中受检细胞膜的型式（configuration）不同，又可将膜片钳分为全细胞式(whole-cell)、细胞贴附式(cell-attached 或on-cell)、内面朝外式(inside-out)、外面朝外式(outside-out)等四种模式。
(一)全细胞式1．电压钳制和电流记录的实现图9-9为全细胞式膜片钳工作原理示意图。
图9-9 全细胞膜片钳实验原理示意图A1：运算放大器；A2：单倍增益差动放大器；R f：反馈电阻；V p：电极电位（A1反向输入端电位）；V c：A1同向输入端电位；C in：输入端杂散电容；C p：电极电容；Rs：串联电阻；C m：细胞膜电容；R m：细胞膜电阻；E m：细胞膜内在电位(指钳压时的细胞膜诸通道状态决定的内在Goldman-Hodgkin-Katz平衡电位)；V o：A2输出端电位；V-offset：偏移电位补偿电位；C c：用于电容补偿的电容；V c(app)：表观钳制电压即欲施加于受试膜片的电压；图中⊕和表示求和电路将充有电解质溶液的玻璃微电极（glass microelectrode或 recording pipette）利用负压紧密吸附于细胞表面，形成吉欧即千兆欧（109Ω）级高阻封接，进一步对微电极内施加负压、将放大器（以下简称运放）A1在深度负反馈工作状态下的“虚短路（virtual short circuit）”原理实现，即只要A1工作于线性范围内，其反向输入端的电位V p总是等于同向输入端的电位V c，这两个输入端之间虽非短路却类似于短路。
膜片钳技术及其应用21世纪被称为生物学世纪，近数十年来，生命科学与生物技术取得了迅猛发展。
任何一项新的生物技术的诞生，均意味着生命科学的某个或某些领域将获得新的生命，其内容和内涵将得到扩大和延伸。
膜片钳技术的创建也为生命科学的研究带来了一场革命性的变化。
简介细胞是动物和人体的基本组成单元。
细胞外围有一层薄膜，彼此分离又互相联系。
细胞间与细胞内的通信，主要依靠其膜上的离子通道来进行。
离子和离子通道是细胞兴奋性的基础，亦即产生生物电现象的基础。
生物电信号通常是用电学或电子学方法进行测量，由此形成一门用以揭示细胞生理过程的细胞电生理学。
早期的研究多使用双电极电压钳技术作胞内记录，自40年代末细胞膜和离子学说建立以来，细胞电活动的研究逐渐深入。
在1976～1981年期间，两位德国细胞生物学家Erwin Neher和Bert Sakmann所开创的膜片钳技术（patch clamp technique）为细胞生理学的研究带来了一场革命性的变化，膜片钳实验技术是对细胞和分子水平的生理学研究方法的一次革命，因而两位科学家于1991年荣获诺贝尔生理学或医学奖。
膜片钳实验技术为生理学、神经科学、细胞生物学等生命科学专业的研究和发展带来了新的生命。
膜片钳技术的发展历史膜片钳技术的发展历史也是一个科学的发展历程，回顾此过程或许对我们现在的研究和对问题的看法有所启示。
膜片钳技术的创立是建立在前人发明的电压钳(V oltage-clamp)和电流钳（Current-clamp）以及玻璃微电极(Glass micro-pipettee)的基础之上。
电压钳首先是由George Marmont和美国学者Kenneth S. Cole等提出，随后英国学者Alan L. Hodgkin、Andrew F. Huxley和Bernard Katz等最先应用的。
早在19世纪末20世纪初，Julius Bernstein就神经的电脉冲提出了“细胞膜假说”（membrane hypothesis）（1902和1912年），推测神经细胞的静息电位（resting potential）是由细胞膜对K＋离子的选择性通透所形成，而神经元的兴奋（即动作电位，action potential）是由于细胞膜对K＋离子的选择性通透性丧失所造成。
