膜片钳技术SOP关键词：膜片钳目的：研究膜片上几个甚至一个离子通道的电流，对单个离子通道在各种电位状态及每种电位状态下对产生电流的离子作出定性、定量的分析，来反映细胞膜上离子通道活动，为研究离子通道结构与功能关系提供关于生物电特性的新资料。
基本原理：膜片钳制技术（patch clamp technique)是对一块单独的细胞膜片（或整个细胞）的电位进行钳制的一项电生理技术。
通过对膜电位的钳制可以观察通过离子通道的电流，膜片钳放大器正是通过维持电压的恒定而测出这种电流。
运用膜片钳技术记到的最小电流可达到pA级(10-12 A)。
膜片钳的本质属于电压钳范畴，其基本工作原理是：采用经典的负反馈放大技术作电压固定，但改用细胞外微吸管作电极，将微电极管尖端与细胞膜表面接触，经负压抽吸，形成具极高阻抗的紧密封接，其电阻值高达10-100千欧（即GΩ=109Ω）。
只有在这种封接存在时，通过膜电极引导记录的电流才是通过该膜的离子通道电流。
膜片钳技术原理示意图Rs是膜片阻抗相串联的局部串联电阻（输入阻抗），Rseal是封接阻抗。
Rs通常为1～5MΩ，如果Rseal高达10GΩ（1010Ω）以上时，IP/I=Rseal/(Rs+ Rseal)-1。
此Ip可为在I－V转换器（点线）内的高阻抗负反馈电阻(Rf)的电压降而被检测出。
药品和试剂：根据不同的实验设计选择不同的药品和试剂。
主要仪器设备与材料：①屏蔽防震实验台(TMC 63-544)②数字式超级恒渐浴槽（HSS-1 CHENDU INSTRUMENT China）③微管电极拉制器（PP-83 NARISHIGE Japan）④微管电极抛光仪（ME-83 NAEISHIFE Japan）⑤电子刺激器（SEN-2030, NIHON KOHDEN, Japan）⑥膜片钳放大器（AXOPATCH 200B Axon Instruments U.S.A）⑦倒置相差显微镜（AXIOVERT 135 ZEISS Germany）⑧计算机（PⅢ 800）⑨A/D、D/A转换器（DIGIDATA-1200 Axon Instruments U.S.A）⑩pClamp软件（10.0）Axon Instruments U.S.A )实验对象：兔、大鼠、猪、和人的组织细胞（直径小于30μm的细胞），都可用于膜片钳实验。
动物由泸州医学院（许可证号：SYXK（川）2008-063）提供；人体组织来源于临床手术丢弃物。
本SOP以猪冠状动脉平滑肌细胞为例，选取体重约120～150 Kg的猪，雌雄不拘，猪心脏购自泸州市屠宰场。
实验环境：常温（22o C）下进行, 湿度（70-80%）操作步骤：1.液体配制主要根据研究通道的不同，所用细胞的不同，配制相应的液体，可参考相应的文献进行调整。
包括：电极液；细胞外液等。
基本原则是保持2个平衡，渗透压平衡和酸碱平衡。
另外，所有液体在使用前必须过滤，以保持液体洁净。
（详见细胞的分离与培养SOP：L Y-XJD-SYJS-014/015）2.标本制备膜片钳实验一般是在单个细胞上进行。
实验用单细胞主要来自培养细胞或急性酶分离的细胞，也可来自脑片细胞中的原位细胞。
常用的酶是胶原酶和蛋白酶，单独或联合使用，有些组织还要加用其它酶，如弹性纤维酶等。
（详见细胞的分离与培养SOP：L Y-XJD-SYJS-014/015）3.微管电极的制备一般采用常规二步法完成，电极尖端直径在1~2μm之间，抛光与涂布液体硅酮树酯后，充灌电极液。
3.1微管电极拉制电极经两步拉制，经过一次粗拉使玻璃管中间拉成一窄细状，第二次拉制窄细部位断成两根。
调节第一步和第二部拉制时的加热线圈电流，就可得到所需要的尖端直径。
拉制电极的毛细玻璃管(Hematocrit Tubes，Drummond,U.S.A.)长度约为75mm。
首先设定电极两步拉制参数: 第一步为59mA，第二步为54mA; 然后将制备电极的毛细玻璃管固定于PC-10垂直微管电极拉制仪上。
经过两步拉制后电极尖端直径约为1~2μm，充灌电极液后电极阻抗为2~4 MΩ。
3.2绝缘树脂涂抹为了克服热噪声和封接阻抗噪声及电极浸入溶液产生的浮游电容噪声，需要在微电极尖颈部（距微电极尖端50nm）的表面薄薄地涂一层硅酮树脂，将涂好的电极移放到镍铬电阻线圈制成的电炉上烘干待用。
3.3电极热抛光将两步拉制成的电极置于MF-83微管电极抛光仪的垂直推进架上，在低倍镜下（15×4）找到电极尖端和加热电阻丝，然后换成高倍镜（15×33）。
将加热电阻丝和电极尖端调整到一个平面内，进行瞬间加热，可使电极尖平滑并烧去多余的硅酮树脂薄层，使电极尖端圆钝平滑有利于高阻封接的形成。
3.4电极液充灌用注射器反向充灌，即用拉细的聚乙烯胶管从电极尾部插入到电极尖端，再注入溶液。
充灌后用左手夹住电极使其尖端向下，用右手指轻弹电极排出电极尖端的少许气泡。
4.高阻抗封接形成4.1在恒温条件下，将细胞贴壁良好的载玻片移入有浴液的浴槽中。
浴槽不能太深，以尽量减少电极进入浴液的深度，从而减少浮游电容；4.2倒置相差显微镜下选择立体感强、活性好的细胞进行实验；4.3使用新拉制的微管电极，用细塑料管以反充灌方式灌电极液入电极尖端，若含有气泡，可手持微电极使其尖端朝下，用手指敲弹几下管壁即可排除，然后再将微电极安装在探头上。
4.4当微管电极在微推进器帮助下进入浴液时，用注射器向电极施加一正压（1~2cm H2O），以防液气表面颗粒堵塞微管电极尖端；调节放大器上pipette offset旋钮，将电极电压补偿到零。
同时由膜片钳放大器向微管电极发放—电压为5mV、波宽40ms的方波脉冲信号，用于观察封接过程。
4.5微推进器将微管电极送入到即将接触细胞时，撤去正压，并继续向选定的细胞表面推进，当电极尖端轻触到细胞表面时其应答电流变小，这时只要给微管电极尖端管腔内施加一负压（10~20cm H2O），若在计算机屏幕上看到应变电流突然下降至零，电流噪声随之减少，则提示微管电极尖端与细胞形成近似电绝缘，其阻抗约10~100GΩ，说明高阻抗封接（giga seal）形成，这时的膜片为细胞贴附式膜片。
在此基础上，根据不同的实验要求，再制成不同类型的膜片构型。
5.膜片钳制技术记录方式5.1细胞贴附式膜片（cell-attached patch）由于细胞牢固贴附于微管电极的尖端而得名。
它可用于记录各种细胞的单通道电流，而且是在细胞完整无损的状态下研究通道的活动。
优点：不破坏细胞的完整性，不需要胞内灌流，不影响细胞质且调制系统完整。
可研究通过细胞对单通道的调制，也可在正常离子环境中研究递质和电压激活的单通道活动。
缺点：不能改变细胞内成分，也不能精确测定膜电位。
同时由于许多细胞膜上存在有牵张激活的离子通道，细胞膜与电极间轻微的张力变化往往会增加记录的背景噪声。
5.2内面向外式膜片(inside-out patch)细胞贴附式膜片形后，提起电极时，与电极尖端相接的细胞膜被撕脱下来开成小泡，将电极尖端在空气中暴露几秒钟后小泡很快破裂，形成胞浆侧向外的内面向外式膜片。
特点：较易改变细胞内的离子或物质浓度，也能把酶等直接加入膜的内侧面，适宜研究胞内物质对通道活动的影响。
但实验中改变膜外侧物质困难，且需侵入低钙液中，以免小泡形成。
应用：可研究胞内信使物质cAMP、cGMP、Ca2+，三磷酸肌醇（IP3）等对受体型通道的调节，以及胞内激素对通道的调节。
这种方式可使通道与细胞的调节机制脱耦联，使第二信使直接作用于膜内，引起通道开闭。
5.3外面向外式膜片(outside out patch)细胞贴附式膜片形成后，向微管电极内给予较强的负压将膜片吸破，再将电极从细胞膜上拔起，但不暴露于空气中，被撕脱下来的膜便形成外面向外式膜片。
优点：可以任意改变胞外物质的浓度，有利于研究递质对膜离子通道外侧面的作用。
缺点：实验中难以改变胞内成分，电极管必须充以低钙溶液以防小泡形成。
应用：可研究腺苷酸环化酶、蛋白激酶C等活性变化，以及细胞膜上信使物质二酰甘油、花生四稀酸、GABA、Ach等对受体型的离子通道研究。
5.4全细胞记录构型(whole cell recording)在细胞贴附式膜片形成的基础上，向微管电极内给予较强的负压将膜片吸破，而高阻封接稳定，即形成全细胞记录构型。
记录的电流属于宏观电（macroscopical current），是整个细胞离子通道活动形成的总和电流。
若采用膜片钳放大器内的电流钳模式，还可以记录细胞的静息电位和动作电位。
特点：①电极管内与细胞之间弥散交换与平衡快，因而容易控制细胞内液的成分；②记录的是许多通道的综合电流，需改变内部介质以分离电流；③适合于对小细胞的电压钳位，对直径大于30μm的细胞很难实现钳制；④该方法使电生理研究的重点从无脊椎动物大细胞中解脱出来，而向人类和哺乳类细胞发展。
5.5穿孔膜片记录技术（perforated patch recording technique）Hom和Marty于1988年首次建立了一种对传统全细胞记录法改进的方法，该方法是基于某些抗生素如制霉菌素（Nystatin），两性霉素B（Amphotericin B）等具有在生物膜上形成通透性孔道的特性，将这类抗生素充灌在电极液中，在形成高阻封接后，可使电极液与细胞内液在电学上相通，因而称作穿孔膜片记录技术。
配制方法如下：首先在避光条件下配制二性霉素B的二甲基亚砜(DMSO)储备液。
用EP管称取适量二性霉素B，按照二性霉素B(mg)：DMSO(µL)=1:4的比例加入DMSO，在超声震荡器中加速溶解至其呈现澄清透明的橘黄色液体，然后置于－20οС冰箱中低温保存备用。
实验前用微量移液管吸取5µL二性霉素B的DMSO液加入到含5mL电极液的棕色小瓶内，适当吹打后经超声振荡助溶。
穿孔电极液中二性霉素B的终浓度为250µg/mL，其中DMSO的浓度为0.1%。
配制好的穿孔液转入用锡箔纸包裹的注射器后置于4οС冰箱中备用。
优点：与全细胞记录相比，该技术相比有如下优点①由抗生素形成的孔道对于等于或大于葡萄糖的分子均不能通过。
因此，在全细胞记录时可避免对胞内重要物质的渗析影响，通道电流衰减现象显著减慢，那些对细胞内通讯及通道调控具有重要作用的第二信使物质仍可正常运行。
②因抗生素形成的孔道对多价离子不通透，故胞内的这些离子的浓度就不受电极液的影响。
因此可在全细胞电流记录的同时用Ca2+染料测定胞内游离的Ca2+水平。
③对细胞的损伤作用明显小于微电极细胞内记录及膜片钳全细胞记录，记录时间可持续3小时。
④高阻封接不易被破坏，而全细胞记录的负压脉动式抽吸和电压脉冲易致高阻封接破坏。
