固相萃取-高效液相色谱法测定水溶液中的腺嘌呤核苷
【实验目的】
1. 掌握固相萃取前处理样品的基本步骤及方法
2. 熟悉高效液相色谱仪的一般使用方法
【实验原理】
固相萃取（SPE）分离是利用固体吸附剂将液体样品中的目标化合物吸附，使其与样品的基体或干扰化合物分离，然后再用适当的溶剂洗除杂质，最后用适当溶剂洗脱目标化合物从而达到分离和富集目标化合物的目的。
腺嘌呤核苷是生物细胞维持生命活动的基本组成元素之一，参与DNA的代谢过程,在体内许多系统和组织有着广泛的生理学作用，具有抗肿瘤、抗病毒、基因治疗等多种生物活性。
本实验利用固相萃取—高效液相色谱的方法，实现了水溶液中的腺嘌呤核苷与其结构类相似物2’-脱氧鸟嘌呤核苷，鸟嘌呤核苷，胞7嘧啶核苷，尿嘧啶核苷，胸腺嘧啶核苷的定量分离。
当样品杂质的极性＞目标物的极性，用反相模式。采用固相萃取C18柱。
洗脱剂的选择，洗杂质、目标物时极性相似。目标物与杂质同时吸附，而样品中杂质的极性＞目标物的极性时，先用极性大的溶剂，将杂质洗下来（15％甲醇），再用极性小的溶剂洗脱目标物（50％甲醇）。
必须活化，才能与溶质产生重线性。先用强溶剂预洗，以消除小柱上在生产或储存过程中可能带入的污染物，避免在色谱图上出现与样品无关得杂质峰。反相选甲醇。然后再用较弱的甲醇－水，洗脱润湿小柱，从而保证样品在柱上有足够的保留与回收率。润湿能打开卷曲在硅胶表面上的烷基链，使溶质与键合相之间充分接触。上样溶剂：水；淋洗：5～10弱溶剂（水－缓冲液或甲醇－水）；洗脱剂：溶剂强度＞上样溶剂，用小体积洗目标产物。
分别接洗脱后溶液，进色谱C18柱，极性小的后出柱。
【仪器和试剂】
高效液相色谱仪；ODS色谱柱；固相萃取仪；C18固相萃取柱；
腺嘌呤核苷（A），2’-脱氧鸟嘌呤核苷（2’-dG），鸟嘌呤核苷（G），胞嘧啶核苷（C），尿嘧啶核苷(U)，胸腺嘧啶核苷(T)，甲醇，混合磷酸盐缓冲液等。
【实验步骤】
1. 色谱条件色谱柱：ODS柱（250×4.6mmID, 5 m）；流动相：1
2.5％甲醇+PH4.0磷酸盐缓冲液；检测波长：260nm；柱温：25℃；流速：1.0mL／min；进样量：20μL。腺嘌呤核苷t R：10.6min，2’-脱氧鸟嘌呤核苷t R：6.7min，鸟嘌呤核苷t R：5.8min，胞嘧啶核苷t R：
3.4min，尿嘧啶核苷t R：
4.7min，胸腺嘧啶核苷t R：8.0min。
2. 溶液的配制 1.0mM/L标准储备液：分别精密称取鸟嘌呤核苷0.0071g,2’-脱氧鸟嘌呤核苷0.0067g,腺嘌呤核苷0.0067g,胞嘧啶核苷0.0061g,胸腺嘧啶核苷0.0061g,尿嘧啶核苷
0.0061g于25mL容量瓶中，用三蒸水定容至刻度，摇匀。
20μM/L混和标准储备液：分别精密吸取上述各标准储备液0.5mL于25mL容量瓶中，用三蒸水定容，摇匀。
3. 标准曲线的制备精密吸取20μM/L混和标准储备液，用三蒸水逐级稀释成10，5，2.5，1.0，0.5μM/L，用微量注射器分别吸取上述各混和标准溶液，进样20μL，记录色谱图。以各核苷的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，用最小二乘法回归成线性方程。
4. 固相萃取
4.1 固相萃取柱的活化将C18固相萃取柱依次用10mL甲醇及10mL的纯净水活化。
4.2 上样取2mL样品溶液，开启真空系统，使溶液连续通过活化过的C18萃取柱，保持流速1-2ml／min进行固相萃取，收集上样溶液。当所有的样品穿过萃取柱后，继续真空抽吸1min，使柱子干燥，记录样品体积，关闭真空泵。
4.3 淋洗开启真空系统，用3mL15%甲醇淋洗C18萃取柱，收集淋洗样品，记录体积。
4.4 洗脱开启真空系统，用3ml50%甲醇洗脱MIP小柱，收集洗脱液，记录体积。
5. 固相萃取样品的检测用微量注射器吸取固相萃取样品（上样，淋洗，洗脱），进样20μL，记录色谱图，代人标准曲线，计算腺嘌呤核苷的浓度。
6. 结果计算
6.1 标准曲线
对照品回归方程相关系数(r2)
A y=10879x-4670.2 0.991
G
2’-dG y=4582.2x+659 0.997
C y=5386.4x-346.92 0.9992
T y=7058.9x-44.406 0.9997
U y=7310.8x-274.28 1
6.2 样品浓度计算
【注意事项】
1.在活化及萃取过程中，不要让萃取柱变干，柱床始终保持湿润。
2.固相萃取上样时速度不宜过快，防止待测组分来不及与填料充分作用就从通道流失。
3.固相萃取柱最好只用一次。因为从严格的意义上来说，很多物质的吸附是不可逆的，一
次吸附，无法洗脱，若重复使用，可能影响下一次吸附。
4.高效液相色谱在进样时，为保证进样准确，进样时必须多取一些溶液，使溶液完全充满
进样环。
【思考题】
1.本实验依次用10mL甲醇及10mL的纯净水流过淋洗固相萃取小柱，上样后又依次用15%
甲醇、纯甲醇流过小柱，请解释各溶剂的作用。
用强溶剂10mL甲醇预洗，以消除小柱上在生产或储存过程中可能带入的污染物，避免在色谱图上出现与样品无关得杂质峰。
再用较弱的甲醇－水，洗脱润湿小柱，润湿能打开卷曲在硅胶表面上的烷基链，使溶质与键合相之间充分接触。从而保证样品在柱上有足够的保留与回收率。
样品中杂质的极性＞目标物的极性，用极性大的溶剂15%甲醇，将杂质洗下来.
用极性小的溶剂50％甲醇洗脱目标物。
2.实验结果说明了什么？
N
N
N N
NH 2
H O H
O H H H H
H H H
O
N NH
O
O
C
H 3H H
O H H H H
H H H
O
腺苷（A ） 10.57 min 胸腺嘧啶（T ）8.02 min
N
NH
N
N NH 2
O
H
O OH
N
NH N
N NH 2
O
H
O OH
OH
2’－脱氧鸟苷（2’－dG ）6.7min 鸟苷（G ）5.8 min
O H
O H H H H
H H H
O
N
NH O O H
N
NH
O O
H
-
OH O
OH
尿苷（U ） 4.7min 胞苷（C ）3.35min
姓名_______________________ 学号_____________________
SPE——通过固相萃取进行样品富集和纯化 为何使用固相萃取（SPE）技术 1. 您需要从样品中去除特定干扰物，以免它们在目标分析物的检测和定量过程中影响实验结果。在此处所示的示例中，不适当的样品制备方案未能去除干扰物，导致提取物呈现出残留的黄色干扰物，色谱图中目标分析物与多个干扰峰发生了重叠。 2. 您需要提高初始样品中目标分析物的浓度，以便所用的分析技术能够更轻松地对其进行检测和准确定量。如果目标分析物可被较强地保留，那么可能需要在SPE色谱柱上加载较大的样品量，随后仅以极小体积的洗脱液将此分析物洗脱下来，由此提高样品中分析物的浓度。
3. 您需要去除样品中的干扰物（即使不可见），这些干扰物会在质谱检测中抑制目标分析物的信号。在此处的示例中，蛋白沉淀法无法去除血浆提取物中的磷脂，从而造成严重的离子抑制。优化的复合模式SPE方案可获取最纯净的提取物，并可在最大程度上降低离子抑制效应。 What is Solid-Phase Extraction (SPE)? Don't be confused by the term solid-phase extraction [SPE]. A typical SPE device has 50 times more separation power than a simple, single liquid-liquid extraction. SPE is actually column liquid-solid chromatography. Since SPE is liquid chromatography [LC], its practice is
高效液相色谱仪操作注意事项 流动相： 1、流动相应选用色谱纯试剂、高纯水或双蒸水，酸碱液及缓冲液需经过滤后使用，过滤时注意区分水系膜和油系膜的使用范围； 2、水相流动相需经常更换（一般不超过2天），防止长菌变质； 3、使用双泵时，A、B、C、D四相中，若所用流动相中有含盐流动相，则A、D（进液口位于混合器下方）放置含盐流动相，B、C（进液口位于混合器上方）放置不含盐流动相； A、B、C、D四个储液器中其中一个为棕色瓶，用于存放水相流动相。 样品： 1、采用过滤或离心方法处理样品，确保样品中不含固体颗粒； 2、用流动相或比流动相弱（若为反相柱，则极性比流动相大；若为正相柱，则极性比流动相小）的溶剂制备样品溶液，尽量用流动相制备样品液； 手动进样时，进样量尽量小，使用定量管定量时，进样体积为定量管的3～5倍； 色谱柱： 1、使用前仔细阅读色谱柱附带的说明书，注意适用范围，如pH值范围、流动相类型等； 2、使用符合要求的流动相； 3、使用保护柱； 4、如所用流动相为含盐流动相，反相色谱柱使用后，先用水或低浓度甲醇水（如5％甲醇水溶液），再用甲醇冲洗。 5、色谱柱在不使用时，应用甲醇冲洗，取下后紧密封闭两端保存； 6、不要高压冲洗柱子； 7、不要在高温下长时间使用硅胶键合相色谱柱；使用过程中注意轻拿轻放。 操作过程： 1、开机操作：（1）、打开电源，用Harb相连接时，注意Harb电源，打开计算机，打开Bootp Server（一般启动时已打开）； （2）、自上而下打开个组件电源，Bootp Server里显示有信号时（有六行字符），打开工作站（先打开On line）； （3）、打开冲洗泵头的10％异丙醇溶液的开关（需用针捅抽），控制流量大小，以能流出的最小流量为准； （4）、注意各流动相所剩溶液的容积设定，若设定的容积低于最低限会自动停泵，注意洗泵溶液的体积，及时加液； （5）、使用过程中要经常观察仪器工作状态，及时正确处理各种突发事件。 2、先以所用流动相冲洗系统一定时间（如所用流动相为含盐流动相，必须先用水冲洗20分钟以上再换上含盐流动相），正式进样分析前30min 左右开启D灯或W灯，以延长灯的使用寿命； 3、建立色谱操作方法，注意保存为自己命名的Method，勿覆盖或删除他人的方法及实验结果； 4、使用手动进样器进样时，在进样前和进样后都需用洗针液洗净进样针筒，洗针液一般选择与样品液一致的溶剂，进样前必须用样品液清洗进样针筒3遍以上，并排除针筒中的气泡； 5、溶剂瓶中的沙芯过滤头容易破碎，在更换流动相时注意保护，当发现过滤头变脏或长菌时，不可用超声洗涤，可用5%稀硝酸溶液浸泡后再洗涤； 6、实验结束后，一般先用水或低浓度甲醇水溶液冲洗整个管路30分钟以上，再用甲醇冲洗。冲洗过程中关闭D灯、W灯； 7、关机时，先关闭泵、检测器等，再关闭工作站，然后关机，最后自下而上关闭色谱仪各组件，关闭洗泵溶液的开关； 8、使用者须认真履行仪器使用登记制度，出现问题及时向老师报告，不要擅自拆卸仪器。
固相萃取(SPE)原理及应用 固相萃取(SPE)是一种用在色谱分析（如 HPLC、GC、TLC 色谱）前快速、选择性制备和纯化样品的技术，通过萃取、分配和/或吸附到固体固定相上，将一种或多种分析物从液体样品之中分离。 固相萃取样品制备可让样品从原始的基质环境转换为更简单的基质环境，由此使样品更适于后续色谱分析，往往可以简化并改善最终的定性和定量分析。此外，更简单的样品基质也更容易满足分析系统要求，更有益于延长系统使用寿命。 通过理想的固相萃取处理步骤，您可以： •让样品基质变得与目标色谱方法更兼容。 •浓缩分析物（痕量富集）以提高灵敏度。 •去除可能在色谱分析过程中引起高背景、误导性峰和/或灵敏度下降的干扰成分。•保护分析柱免受污染。 •实现萃取工艺自动化。 SPE原理
在SPE过程中，固定相（吸附剂或树脂）通过强效但可逆的相互作用与分析物或杂质结合，从复杂样品中可靠、快速地萃取目标分析物。 由于不同的分析物和基质有多种吸附剂和洗脱条件可选，故SPE兼具选择性和通用性。常见的SPE吸附剂包括： •硅基 o反相（C18、C8、氰基、苯基） o正相（二氧化硅、二醇基、NH2） o离子交换（SAX，WCX，SCX） •碳基 •基于聚合物（各种组分、不同功能） •其他吸附剂，例如Florisil®（硅酸镁）或氧化铝 •混合床：连续层形式的上述任意吸附剂组合 SPE策略 默克Supelco® 温馨提示“吸附-洗脱SPE”：通过吸附剂捕获目标分析物，让基质干扰成分通过小柱。“干扰物去除SPE”：通过吸附剂捕获基质干扰成分，让目标分析物通过。HybridSPE和QuEChERS SPE方法均采用干扰物去除工作原理。 最适宜的SPE方法取决于分析物结构、溶解度、极性和亲脂性（分散系数）。默克为此提供了选择指南，可帮助根据自身目标应用选择最适宜的固定相和溶剂。 常见SPE应用 广泛用于制药、临床和高通量诊断检测、法医学、环境和食品/农业化学行业，适用于以下成分分析： •生物体液中的药物化合物和代谢产物 •生物体液中的违禁药物 •饮用水和污水中的环境污染物 •食品/农业基质中的农药、抗生素或霉菌毒素
液相色谱法测定水产品中的抗生素残留 随着我国养殖业的发展，越来越多的抗生素被应用于渔业生产中，这些药物的使用几乎贯穿养殖的全过程，由于养殖户不遵守休药期规定及未正确使用药物，造成在水产品中的高水平残留。人长期摄入含抗生素残留的水产品后，药物不断在体内蓄积，当浓度达到一定量后，就会对人体产生毒性作用，四环素类药物的毒性反应主要表现为对胃、肠、肝脏的损害及牙齿的染色等。还会造成过敏反应，二重感染，致畸胎作用。而氯霉素有严重的副作用，它能抑制人体骨髓造血功能而引起再生障碍性贫血和粒状白细胞缺乏症等疾病，对人类的健康构成潜在的危害。因此，水产品中抗生素残留量的检测技术，日益受到国内外学者的关注。本文研究了用全自动固相萃取(AUTOSPE)-高效液相色谱法进行4种抗生素的同时固相萃取和测定的最佳条件，结果令人满意。现将研究结果总结如下： 一、实验部分 1、仪器与试剂 LC7000型高效液相色谱仪，LC7060 二极管阵列检测器，LC7050自动进样器;SUPELCO DISCOVERY C185μm 250×4.6mm色谱柱。固相萃取小柱为ZORBAX SPE C18Cart。12头固相萃取真空富集装置(Alltech Scientific Limited)。超声波清洗器KS—500D，超速离心机LD4 —2，搅肉机，涡旋混合器。甲醇(色谱纯)，磷酸二氢钠(分析纯)，EDTA(分析纯)，高氯酸溶液(优级纯)、硝酸(优级纯)。土霉素、四环素、金霉素、氯霉素标准品(SIGMA公司)。 2、高效液相色谱分析条件 色谱柱为SUPELCO DISCOVERY C185μm 250×4.6mm，流动相为0.O1mol/L磷酸二氢钠+0.001 mol/L EDTA:甲醇=60:40(V/V，pH=2.0)，流速为0.8ml/min，检测波长为268nm柱温为25℃，进样量为20μl。 3、实验方法 (1)土霉素、四环素、金霉素、氯霉素标准储备液的配制 分别称取O.0100mg土霉素、四环素、金霉素、氯霉素标准品置于4个1Oml容量瓶中，分别加入甲醇溶解并定容至刻度，此溶液浓度分别为1.00mg/ml，置于冰箱冷藏室保存。 (2)混合标准中间液的配制 分别吸取土霉素、四环素标准储备液各1.00ml，金霉素、氯霉素标准储备液各2.00m1.置于100ml容量瓶中，用流动相A液定容至刻度，此溶液浓度分别为：土霉素(10μg/m1)、四环素(10μg/m1)、金霉素(20μg/m1)、氯霉素(20μg/m1)，置于冰箱冷藏室保存。 (3)标准使用液的配制 准确吸取混合标准中间液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0ml分别置于1Oml容量瓶中，用流动相A液定容至刻度，得到的标准系列为：0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0μg/m1(土霉素、四环素);0.2、0.4、1.0、2.0、4.0、8.0、12.0、16.0、20.0μg/m1(金霉素、氯霉素)。 (4)流动相A液的配制 0.01mol/L磷酸二氢钠+0.001mol/L EDTA，用30%硝酸调至pH=2.0，经0.45μm双层水系滤膜过滤。 (5)流动相B液的配制
固相萃取-高效液相色谱法测定水溶液中的腺嘌呤核苷 【实验目的】 1. 掌握固相萃取前处理样品的基本步骤及方法 2. 熟悉高效液相色谱仪的一般使用方法 【实验原理】 固相萃取（SPE）分离是利用固体吸附剂将液体样品中的目标化合物吸附，使其与样品的基体或干扰化合物分离，然后再用适当的溶剂洗除杂质，最后用适当溶剂洗脱目标化合物从而达到分离和富集目标化合物的目的。 腺嘌呤核苷是生物细胞维持生命活动的基本组成元素之一，参与DNA的代谢过程,在体内许多系统和组织有着广泛的生理学作用，具有抗肿瘤、抗病毒、基因治疗等多种生物活性。 本实验利用固相萃取—高效液相色谱的方法，实现了水溶液中的腺嘌呤核苷与其结构类相似物2’-脱氧鸟嘌呤核苷，鸟嘌呤核苷，胞7嘧啶核苷，尿嘧啶核苷，胸腺嘧啶核苷的定量分离。 当样品杂质的极性＞目标物的极性，用反相模式。采用固相萃取C18柱。 洗脱剂的选择，洗杂质、目标物时极性相似。目标物与杂质同时吸附，而样品中杂质的极性＞目标物的极性时，先用极性大的溶剂，将杂质洗下来（15％甲醇），再用极性小的溶剂洗脱目标物（50％甲醇）。 必须活化，才能与溶质产生重线性。先用强溶剂预洗，以消除小柱上在生产或储存过程中可能带入的污染物，避免在色谱图上出现与样品无关得杂质峰。反相选甲醇。然后再用较弱的甲醇－水，洗脱润湿小柱，从而保证样品在柱上有足够的保留与回收率。润湿能打开卷曲在硅胶表面上的烷基链，使溶质与键合相之间充分接触。上样溶剂：水；淋洗：5～10弱溶剂（水－缓冲液或甲醇－水）；洗脱剂：溶剂强度＞上样溶剂，用小体积洗目标产物。 分别接洗脱后溶液，进色谱C18柱，极性小的后出柱。 【仪器和试剂】 高效液相色谱仪；ODS色谱柱；固相萃取仪；C18固相萃取柱； 腺嘌呤核苷（A），2’-脱氧鸟嘌呤核苷（2’-dG），鸟嘌呤核苷（G），胞嘧啶核苷（C），尿嘧啶核苷(U)，胸腺嘧啶核苷(T)，甲醇，混合磷酸盐缓冲液等。 【实验步骤】
固相萃取－高效液相色谱法测定食品中6种对羟基苯甲酸酯王萍亚，周勇，陈皑，黄鹂，赵华，张薇英 (国家海洋食品质量监督检验中心, 浙江舟山316021) 摘要：建立了固相萃取－高效液相色谱法（SPE-HPLC）同时测定食品中6种对羟基苯甲酸酯（对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸异丙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸异丁酯、对羟基苯甲酸丁酯）含量的方法。考察了2种不同提取液和3种不同流动相体系对6种对羟基苯甲酸酯分析的影响，最终分别选择乙醇和甲醇－柠檬酸缓冲液为提取剂和流动相。样品提取液经Oasis HLB固相萃取柱净化和甲醇定容后，紫外检测器258 nm处测定。结果表明，6种对羟基苯甲酸酯在0.1 ~ 20.0 mg/L范围内呈现良好线性关系，各组分的检出限分别为0.1 mg/kg、0.1 mg/kg、0.1 mg/kg、0.1 mg/kg、0.2 mg/kg和0.2 mg/kg（S/N=3），不同剂量的加标回收率为82.8% ~ 115.5%，相对标准偏差（RSDs）为0.2% ~ 6.8%。该方法简便、快速、灵敏，准确度和重现性较好，可作为食品中测定多种对羟基苯甲酸酯类添加剂的有效方法。 关键词：对羟基苯甲酸酯；食品；高效液相色谱法 中图分类号：O658 文献标识码：A文章编号：栏目类别：研究论文 Determination of 6 p-Hydroxybenzoates in Food Using Solid Phase Extraction-High Performance Liquid Chromatography WANG Ping-ya, ZHOU Yong, CHEN Ai, HUANG Li, ZHAO Hua, ZHANG Wei-ying (National Marine Food Quality Supervision and Testing Center, Zhoushan, Zhejiang 316021, China) Abstract: A methd was developed for determination of 6 p-hydroxybenzoates (methyl p-hydroxybenzoate, ethyl p-hydroxybenzoate, isopropyl p-hydroxybenzoate, propyl p-hydroxybenzoate, isobutyl p-hydroxybenzoate and butyl p-hydroxybenzoate) in foods using the combination of solid phase extraction (SPE) and high performance liquid chromatography (HPLC). Two different extraction solution and three different mobile phase were tested for p-hydroxybenzoates analysis, and finally ethanol and methanol-citric acid solution were selected as optimal. Samples were extracted with ethanol solution and purified by Oasis HLB solid-phase extraction cartridge. p-hydroxybenzoates were redissolved in methanol and determined by UV-detection at wave length of 258 nm. Results showed that the calibration graphs was linear in the concentration rang of 0.1 ~ 20.0 mg/L. The limits of detection were 0.1 mg/kg for methyl p-hydroxybenzoate, ethyl p-hydroxybenzoate, isopropyl p-hydroxybenzoate, propyl p-hydroxybenzoate and 0.2 mg/kg for isobutyl p-hydroxybenzoate, butyl p-hydroxybenzoate（S/N=3）. The average recoveries were between 82.8% ~ 115.5% with relative standard deviations（RSDs）of 0.2% ~ 6.8%. The method is simple, rapid, sensitive, accurate and reproducible. It can be used for the routine analysis of the p-hydroxybenzoates in foods. Key words: p-hydroxybenzoates; food; high performance liquid chromatography（HPLC）防腐剂是食品生产、加工、储存等过程中广泛使用的一类化合物，它们能够抑制微生物的繁殖，以达到延长食品保质期目的，如苯甲酸、山梨酸、对羟基苯甲酸酯类等[1-2]。但防腐剂的过量加入亦会危害人体健康，而且我国对防腐剂的使用量和残留量也有着严格的规定和要求。因此，高效、快速、高选择性和高灵敏度测定食品中的各种防腐剂对确保人类健康具有重要的意义。————————————— 通讯联系人：王萍亚，女，高级工程师，主要从事食品检测技术研究。Tel：(0580)2080538, E-mail: zxhuaxueshi@https://www.doczj.com/doc/fe19235398.html,. 基金项目：浙江省重大科技计划项目（2007C13067）
水体中雌激素的高效液相色谱法分析 李甜甜指导老师：凌婉婷 1 前言 目前, 环境内分泌干扰物( endocrine disrupting chemicals, edcs) 被列为继臭氧层空洞和地球变暖之后的又一新的环境污染问题, 成为当前国际上研究的热点。至今所报道的各种内分泌干扰物中, 雌性天然激素及其合成激素被认为是最重要的干扰物之一。这些外源性化学物进入体内后通过和内源性雌激素相同的作用机制( 主要是核受体蛋白介导作用) 干扰内分泌系统而产生一系列的不良作用, 包括致癌、损伤生殖功能导致神经系统和免疫系统异常等。 环境中的雌激素主要是由人类和动物的新陈代谢而产生的，随着尿和粪便等排泄物而进入废水中，经过污水处理厂处理后进入到自然水体中，并在城市水系统中的固液相之间进行迁移和转化。再者，由于激素类药物在人类日常生活和养殖业中被大量使用，不同种类的雌激素因此会进入城市污水管网，经污水处理厂处理后，排放进入环境。edcs 是城市水循环过程中长期存在的一类典型污染物，虽然其含量较低，但是在极低的浓度( ng·l-1 )水平下就能造成动物内分泌紊乱、雌性化、发育不良以及畸形化等不良影响，而且有可能和水体中残留的其他雌激素类物质发生协同作用, 因此这类物质对生态环境潜在的危害性是不可忽视的。同时由于edcs 的亲脂和难降解特性，在城市水循环的过程中会逐渐积累，威胁到城市居民的身体健康，对生态环境存在潜在的危害性，已经成为城市环境保护的核心问题，急需针对城市水体中的edcs 开展基础研究工作。因此在环境中建立一套科学、完善、高效的雌激素类物质检测方法是十分必要的。 近年来，随着色谱、质谱及色谱-质谱联用技术等的快速发展，微量雌激素类污染物的检测技术也随之有较快的发展。目前测定edcs 的方法有gc- ms 法、hplc法, 荧光光度法 , 酶联免疫分析法(elisa), 极谱法等。其中gc - ms 和hplc是比较常用的方法。gc- ms 法需对样品进行酯化处理, 操作繁琐, 重复性差。本文采用固相萃取(spe) 浓缩净化技术, 通过高效液相色谱(hplc)分离, 荧光检测器进行定性定量分析, 建立了快捷、便利、有效的对水中内分泌干扰物ee2的测定方法, 并可在污水监测中得到应用。 2 实验材料 2.1 仪器与试剂 lc-20a高效液相色谱仪，rf-10axl荧光检测器。色谱柱：inertsil ods-sp-c18（150mm ×4.6mm,5μm）。固相萃取仪（hp-6019-12 spe），圆周形氮气吹干仪，固相萃取柱（6ml）。 炔雌醇（2μg/ml,ee2），实验用水（超纯水），甲醇、乙腈均为hplc级试剂。c18，玻璃棉。 2.2 标准溶液及模拟水样的配制 分别取2μg/ml ee2 0.25ml，0.5ml，1ml，2ml，5ml，7.5ml于棕色容量瓶中，并用甲醇稀释定容至10ml，摇匀，配制成不同浓度的标准溶液，保存待用。 取2μg/ml ee2 0.5ml于容量瓶中，用超纯水定容至100ml，摇匀，配制模拟水样，保存待用。 2.3 c18 spe柱的制作 订制6ml固相萃取玻璃柱管，在柱管底部填入一定量的玻璃棉，称取0.2gc18填料加入柱管中，轻轻敲打柱身使其均匀，将填料填平、压实，上层再覆盖一层玻璃棉，再以清洁的玻璃棒按压使其装填紧密，保存待用。 2.4 色谱条件 色谱柱：inertsil ods-sp-c18（150mm×4.6mm,5μm）；流动相为甲醇/乙腈/水（体积比为25:30:45）；流速：1.0ml/min；柱温：40℃；进样量：20μl；荧光检测器波长：激发波
SPE-HPLC法测定水中硝基苯酚类化合物 秦承华;王晶晶;张军;彭华;王玲玲;南淑清;李红亮;吴立业 【摘要】建立了以固相萃取为前处理条件，用液相色谱法测定水中10种硝基苯酚类化合物的分析方法。实验使用HLB （6 L／150 g）固相萃取柱富集水样中的目标化合物，二氯甲烷与乙酸乙酯体积比1∶2的混合溶剂洗脱，采用Phenyl柱 （4�6 mm ×250 mm，5μm）分离目标化合物，以乙腈（1％甲酸）／水（1％甲酸）为流动相进行梯度洗脱，二极管阵列检测器检测。10种硝基苯酚类物质在 0�02～10 mg／L范围内呈现良好的线性。方法检出限为0�1～0�3μg／L，水样加标相对标准偏差为5�19％～18�2％，平均加标回收率为49�8％～124％。该方法适用于水中10种硝基苯酚类化合物的测定。%A method had been established to determine ten kinds of nitrophenols in water by solid phase extraction and high performance liquid chromatography. In this study,HLB SPE column(6 L/150 g)was used to extract the target compounds and the target compounds on the HLB SPE column were desorbed by a mixed solvent of dichloromethane and ethyl acetate(1∶2,V∶V). Then,the target compounds were separated by using a Phenyl column(5 μm,4�6 mm × 250 mm) with acetonitrile (1% formic acid) /water (1% formic acid) as the mobile phase and were detected by diode array detector. The study showed that decent linearity between concentration and peak area was achieved in the concentration range of 0�02⁃10 mg/L for the ten target compounds. The method detection limit for each target compound ranged from 0�1 μg/L to 0�3 μg/L. The recovery for the samples is between
固相萃取-高效液相色谱法测定养殖污水中强力霉素残留 一、引言 随着养殖业的发展，养殖污水中的抗生素残留问题日益严重，其中强力霉素是一种广 泛使用的抗生素，其残留会对环境和人体健康造成一定的危害。对养殖污水中强力霉素的 残留情况进行监测和分析具有重要意义。本文将采用固相萃取-高效液相色谱法（SPE-HPLC）对养殖污水中强力霉素进行测定，为养殖污水治理和环境保护提供科学依据。 二、实验材料与方法 1. 实验材料 （1）仪器设备：高效液相色谱仪（HPLC）、固相萃取仪（SPE） （2）色谱柱：C18反相色谱柱 （3）色谱条件：流动相A为甲醇，流动相B为0.1%甲酸水溶液，梯度洗脱 （4）样品：养殖污水样品 （5）标准品：强力霉素标准品 2. 实验方法 （1）样品处理：将养殖污水样品通过固相萃取仪进行处理，提取强力霉素残留物质。 （2）色谱分析：将提取的样品通过高效液相色谱仪进行分析，采用梯度洗脱的方法进行分离和定量测定。 三、实验结果 经过对养殖污水样品的固相萃取和高效液相色谱分析，得到了如下实验结果： （1）强力霉素标准曲线：在不同浓度下制备了强力霉素的标准品，并进行了色谱分析，得到了相应的标准曲线。 （2）养殖污水样品分析：对养殖污水中强力霉素残留进行了测定，得到了样品中强力霉素的含量。 四、实验讨论
通过本次实验，我们成功地采用了固相萃取-高效液相色谱法对养殖污水中强力霉素 进行了测定。通过测定结果我们可以得知养殖污水中强力霉素的残留情况，为环境保护和治理提供了科学依据。 六、参考文献 1. 赵明芳等. 高效液相色谱法测定环境水样中的强力霉素残留[J]. 环境科学, 2008, 29(5): 1399-140 2. 2. 李红波等. 固相萃取-高效液相色谱法测定水体中微量强力霉素的研究[J]. 分析 测试学报, 2011, 30(5): 34-37.
高效液相色谱—原子荧光法同时测定饮用水中甲基汞和乙基汞 摘要：建立了固相萃取-高效液相色谱-原子荧光（SPE-HPLC-AFS）联用测定饮用水中的甲基汞和乙基汞的方法。实验采用固相萃取净化浓缩样品，使用高效液相色谱流动相为含有5% （v/v）乙腈-0.462% （v/v）乙酸铵-0.12% （v/v）半胱氨酸溶液，色谱柱为C18反相柱。甲基汞和乙基汞检出限分别为0.56ng/L 和1.32ng/L。 关键词：饮用水甲基汞乙基汞 有机汞（如甲基汞和乙基汞等）系亲脂性毒物，主要侵犯神经系统，可通过呼吸道、肠胃及皮肤吸收，它与无机汞不同，经肠道吸收率很高。无论任何途径入侵，均可发生口腔炎；口服可引起急性胃肠炎；神经精神症状有神经衰弱综合症，精神障碍、谵妄、瘫痪、震颤、共济失调、向心性视野缩小等；可发生肾脏损害，重者可致急性肾功能衰竭。此外尚可致心脏、肝脏及皮肤损害[1]。 目前，测定地表水及污水中的甲基汞和乙基汞等采用巯基棉富集-气相色谱法和HPLC-ICP- MS [1-3]。但是前者由于样品中杂质（硫醇、硫醚吧、噻吩等）的存在会影响柱分离效率，干扰甲基汞的测定；而后者虽然处理简单，具有较高的灵敏度，测定快度速，但是在测量时使用较多的有机溶剂，易造成二次污染，对操作人员亦有损害，并且仪器昂贵，普及性有待提高。 本文采用C18固相萃取柱处理水样，用SPE-HPLC-AFS检测水质中的烷基汞。由于C18柱对甲基汞和乙基汞的吸附能力不同，样品通过C18固相萃取柱时，流动相可将甲基汞和乙基汞依次洗脱，洗脱液先和氧化剂混合，再和空气混合，通过紫外光照射，将有机汞氧化成无机汞，最后混合还原剂和盐酸发生氢化反应，进入原子化器，与原子荧光联用进行数据收集和处理。 一、实验部分 1.仪器 SAP-10形态分析预处理装置和原子荧光光谱仪（北京吉天仪器有限公司）；LC-10ATvp高效液相泵配手动进样阀（日本岛津公司）；超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；超纯水制备仪（美国Millipore公司）；色谱柱（C18150×4.6mm （i.d）），5μm；固相萃取柱（C186mL，Agilent）。 2.仪器条件[5] 流动相：5% （v/v）乙腈-0.462% （v/v）乙酸铵-0.12% （v/v）半胱氨酸，经0.45μm滤膜过滤后，在超声波清洗器中超声20min；流速：1mL/min；进样体积：100μL。 载流：7% （v/v）；盐酸；还原剂：0.5% （v/v）氢氧化钾-1.5% （v/v）硼氢化钾；氧化剂：0.5% （v/v）氢氧化钾-1% （v/v）过硫酸钾；清洗液：10% （v/v）甲醇；泵速：60转/分；紫外灯：开。 总电流：30mA；负高压：300V；载气流速：300mL/min；屏蔽气流速：600mL/min；载气流量：0.3MPa。 3.试剂及标准溶液 甲基汞和乙基汞（分别为86.2±3.3μg/g和77.3±2.8μg/g，甲醇溶剂，中国）。甲醇（色谱纯，TEDIA，美国）；乙腈（色谱纯，TEDIA，美国）；硫脲和盐酸（优级纯）；二乙基二硫代氨基甲酸钠（分析纯）。 混合标准溶液：甲基汞浓度为68μg/L，乙基汞为61μg/L的混合标准溶液，
固相萃取-高效液相色谱(SPE-LC)法测定生活污水阴离子 表面活性剂 固相萃取-高效液相色谱(SPE-LC)法测定生活污水阴离子 表面活性剂 引言： 随着社会经济的快速发展和人口数量的不断增加，生活污水的处理成为一个重要且紧迫的问题。生活污水中存在着各种有机物质，包括表面活性剂。表面活性剂是一类广泛存在于生活污水中的物质，由于其强大的溶解能力和分散能力广泛应用于日常生活和工业生产中。然而，过量的表面活性剂可能对水环境造成负面影响，因此对其测定和去除具有重要意义。 本文将介绍一种新的分析方法——固相萃取-高效液相色 谱(SPE-LC)法用于生活污水中阴离子表面活性剂的测定。该方法结合了固相萃取和高效液相色谱技术的优势，能够快速、准确地测定生活污水中的阴离子表面活性剂。 实验方法： 1. 样品处理： 首先，收集生活污水样品，并经过初步处理去除大颗粒物质。然后，将样品置于加热搅拌下，在其中加入适量的盐酸进行酸化处理，使阴离子表面活性剂转化为相应的负离子态。 2. SPE-LC测定： 将经酸化处理的样品经过固相萃取柱进行富集。固相萃取 柱选择合适的固相吸附材料，具备强大的吸附能力和高选择性，可以有效地富集阴离子表面活性剂。随后，采用高效液相色谱仪进行定量分析。高效液相色谱仪配备合适的色谱柱和检测器，能够快速、准确地分离和检测样品中的阴离子表面活性剂。
结果与讨论： 通过对不同浓度的阴离子表面活性剂标准溶液进行测试，得到了线性范围和灵敏度。通过检测实际生活污水样品，确定了该方法对生活污水中阴离子表面活性剂的测定具有较高的准确性和重现性。此外，本方法还具有较短的分析时间和所需样品量较少的优点。 结论： 固相萃取-高效液相色谱(SPE-LC)法是一种可行的方法，用于 生活污水中阴离子表面活性剂的测定。该方法具有准确性高、重现性好、分析时间短和样品消耗少的特点，为生活污水处理过程中对阴离子表面活性剂的监测和控制提供了有效手段。然而，仍需要进一步研究优化该方法的操作参数，并对其他污水中的阴离子表面活性剂进行测定，以更好地解决生活污水处理中的问题 通过使用盐酸进行酸化处理，将阴离子表面活性剂转化为相应的负离子态。随后，经过固相萃取柱的富集和高效液相色谱仪的定量分析，我们确定了固相萃取-高效液相色谱(SPE-LC)法在生活污水中阴离子表面活性剂测定方面的可行性。该方法具有准确性高、重现性好、分析时间短和样品消耗少的优点。通过对阴离子表面活性剂标准溶液和实际生活污水样品的测试，我们证实了该方法对生活污水中阴离子表面活性剂的测定具有较高的准确性和重现性。然而，为了更好地解决生活污水处理中的问题，我们仍需进一步研究优化该方法的操作参数，并对其他污水中的阴离子表面活性剂进行测定
HPLC - 液相色谱 什么是液相色谱? 历史概述和定义 液相色谱的定义是二十世纪早期由俄罗斯植物学家Mikhail S. 茨维特提出 的。他最先尝试在装满颗粒的柱子上使用溶剂来分离从植物中提取的化合物[树叶色素]。茨维特用颗粒填满开口的玻璃柱。他发现两种特殊的材料，粉笔末(碳酸钙)和氧化铝很有用。他将样品[混匀植物叶的溶剂提取物]倒入柱中，并让样品流过颗、粒床。随后加入纯溶剂。随着样品由于重力自上而下流过柱子，可看到不同颜色的谱带被分开，因为有些组分比另外一些移动得快。他将这些分开的不同颜色的谱带与样品中原有的不同化合物相关联。他还根据每一种化合物对填料的化学亲和性强弱，提出了分析这些化合物的分离规律。与颗粒填料有较强亲和性的化合物移动慢，与溶剂有较强亲和性的化合物移动快。这个过程可这样描述:样品中的化合物在流动的溶剂(流动相)与固体颗粒(固定相)间的分布不一样。这样使每一种化合物以不同的速度移动，从而产生了化合物之间的分离。 茨维特使用色谱法chromatography [来自希腊字，chroma 意思是颜色，graphy 意思是记录- 直译为颜色记录] 来描述他的彩色试验。[令人好奇的是, 俄罗斯名字茨维特意思是颜色。]今天，液相色谱法,以各种形式，已成为分析化学中最有力的工具之一。 技术1. 样品被点在固定在玻璃板上的薄层色谱颗粒[固定相]上，并流过薄层[图B]。玻璃板的底端放置在溶剂中。由毛细作用产生的流动使溶剂[流动相]扩散到干燥的颗粒层并沿玻璃板向上移动。这种技术被称为薄层色谱法或TLC。
技术 2.在图 C 中, 样品被点在纸上[固定相]。溶剂[流动相] 加在样品点的中心以产生向周围的辐射流动。这是纸层析的一种方式。[传统的纸层析色谱和直线流动的薄层色谱是类似的操作方式。]上图中，相同的黑色FD 和 C 染料被点在纸上。 图C: 纸层析法 当和薄层色谱板比较的时候，请注意这种特殊纸张分离能力的区别。绿色圆环表示这张纸无法分离黄色和蓝色染料，但它可以将红色染料分离开来。下图中，由同样的黄色和蓝色染料组成的一个绿色样品点在纸上。如你能预料的，这张纸无法分离这两个染料。在图中，由红色和蓝色组成的紫色样品被点在纸上，它们被
SPE-HPLC法测定酒、糖果、巧克力中的喹啉黄 孙小杰;张玲;宋佳;凌睿 【摘要】建立了固相萃取-高效液相色谱(SPE-HPLC)测定酒、糖果、巧克力中喹啉黄的方法.样品分别经水、70％甲醇水溶液提取,提取液经聚酰胺固相萃取柱净化,采用C18色谱柱,以0.02 mol/L乙酸铵溶液和甲醇为流动相进行梯度洗脱,用高效液相色谱仪对酒、糖果、巧克力中喹啉黄的含量进行了测定.喹啉黄的质量浓度在5.0～100.0mg/L范围内与其色谱峰面积呈良好的线性关系,线性相关系数大于0.9999,方法的检出限酒为2.5 mg/L、糖果和巧克力2.5 mg/kg.样品的平均加标回收率为83.2％～92.2％,测定结果的相对标准偏差均小于4.4％(n=6).该方法快速,定量准确,可用于酒、糖果、巧克力中喹啉黄的测定. 【期刊名称】《化学分析计量》 【年(卷),期】2015(024)006 【总页数】4页(P19-22) 【关键词】高效液相色谱;喹啉黄;固相萃取 【作者】孙小杰;张玲;宋佳;凌睿 【作者单位】南京市食品药品监督检验院,南京210008;南京市食品药品监督检验院,南京210008;南京市产品质量监督检验院,南京210028;南京市食品药品监督检验院,南京210008 【正文语种】中文 【中图分类】O657.7
食品添加剂喹啉黄为水溶性偶氮类合成色素，食品安全标准中仅允许在配制酒中添加，且最大使用量为0.1 g／L［1］。食品中食品添加剂违规或过量添加时有发生，如美国进口的巧克力、法国进口的家乐福牌混合糖果、匈牙利进口的哈斯儿童维生素C泡腾片、比利时进口的HAMLET的进口棉花糖均存在违规使用化学物质喹啉黄。但我国食品中喹啉黄检测的方法标准一直未能及时跟上，造成了喹啉黄检测项目的缺失，因此研究喹啉黄的检测方法对于保障食品安全具有重要意义。 目前国内外用于喹啉黄的检测方法主要有液相色谱法、分光光度法、高效液相串联质谱法等。液相色谱法由于色谱条件的不同，喹啉黄部分组分由于未得到有效分离而造成色谱峰个数存在差异［2-7］，马晓燕等和伊熊海等采用液质联用法以喹啉黄二钠盐对喹啉黄进行定量［8-9］，Feng Feng等以喹啉黄作为一钠盐来定量［10］，而单独测定喹啉黄一钠盐、二钠盐并不能准确反映喹啉黄的实际含量。 样品处理方法有聚酰胺吸附法，液-液分配法等，采用固相萃取柱处理样品的报道 很少。笔者在前期成功分离喹啉黄各组分并对其各组分进行定性定量的基础上［11］，利用固相萃取-高效液相色谱技术建立了酒、糖果、巧克力中喹啉黄的检测方法。 1.1 主要仪器与试剂 高效液相色谱仪：Agilent 1260型，配有二极管阵列检测器(DAD)，美国Agilent 公司； 电子天平：XS205型，瑞士Metler-Toledo公司； 固相萃取装置：Wat200609型，美国Waters公司； 聚酰胺固相萃取柱：500 mg，3 mL，上海安谱实验科技股份有限公司； 氮吹仪：N-EVAP型，美国Organomation公司； 离心机：ROTINA 35型，德国Hettich公司； 具塞塑料离心管：50 mL，上海安谱实验科技股份有限公司；
固相萃取-高效液相色谱-质谱联用法检测环境水样中五种持久 性有机污染物 罗黄世;覃国飞;王献 【摘要】持久性有机污染物(POPs)是指能通过环境降解,持久存在于各种大气、残留物、土壤、水及生物体内,通过生物食物链累积、并对人类健康造成有害影响的化学物质.本文建立了固相萃取(SPE)和高效液相色谱-质谱联用分析方法(HPLC-MS),同时定量测定环境水样中全氟辛酸(PFOA)、全氟辛磺酰酸(PFOS)、全氟己酸(PFHA)、双酚A(BPA)、3-羟基-四溴联苯醚(3-OH-BDE-47)5种持久性有机污染物.该方法在1～1 000 ng·mL-1的范围内具有良好的线性关系,检测限在1～8 ng·L-1,水样加标回收率为93.2％～110.1％,相对标准偏差(RSD)为2.7～9.1％,可以满足复杂水样中相关POPs的分析检测. 【期刊名称】《能源环境保护》 【年(卷),期】2016(030)002 【总页数】6页(P42-45,21,27) 【关键词】固相萃取;液相色谱-质谱联用;环境水样;全氟辛酸;全氟辛磺酰酸;全氟己酸;双酚A;3-羟基-四溴联苯醚 【作者】罗黄世;覃国飞;王献 【作者单位】中南民族大学化学与材料科学学院分析化学国家民委重点实验室,湖北武汉430074;中南民族大学化学与材料科学学院分析化学国家民委重点实验室,
湖北武汉430074;中南民族大学化学与材料科学学院分析化学国家民委重点实验室,湖北武汉430074 【正文语种】中文 【中图分类】U268.5+2 全氟化合物广泛应用于厨具、纺织、包装、皮革和灭火泡沫等工业领域［1］，大量研究表明在粉尘、空气、土壤等环境介质中均能检测到全氟类化合物的存在，且C-F共价键化合键能极高，不易降解，其免疫毒性、发育毒性、内分泌干扰毒性等潜在危害引起了人们的关注［2-4］。其中全氟辛磺酰酸（PFOS）、全氟辛酸（PFOA）应用最为广泛，已于2009年作为需严格控制的新型持久性有机污染物（POPs）而被列入斯德哥尔摩公约［5］。双酚A （BPA）主要用于生产聚碳酸酯、环氧树脂等高分子材料，是一种具有弱雌激素活性的内分泌干扰物［6］。多溴联苯醚（PBDEs）是广泛使用的溴代阻燃剂，常作为添加型阻燃剂应用到复合 材料中［7］。这些持久性有机污染可以随着工业产品的广泛使用而迁移到环境介质及水体生物中，并逐步通过食物链富集最终到达人体［8］，因此对环境水样中持久性有机污染物的监控非常重要［9］。 由于持久性有机污染物在环境水样中的含量很少，且环境水体中水质情况复杂，容易产生干扰，为了提高检测灵敏度排除干扰，需要对水样进行富集萃取等预处理。相对于传统的样品前处理技术，固相萃取（SPE）具有效率高、溶剂用量少等优点，且可同时完成样品富集与净化［10，11］。本次实验使用的SampliQ PS-DVB是一种高度交联的聚苯乙烯-二乙烯基苯（PS-DVB）共聚物，具有大表面积（600 m2·g-1）和高容量，尤其适用于提取那些在C18或C8吸附剂上保留不够的极性 分析物。高效液相色谱-质谱联用法（HPLC-MS）是近年来发展起来的对有机物检测很有效的方法。高效液相色谱能够有效的将待测样品中的有机物成分分离开，而
固相萃取-高效液相色谱法测定水中多环芳烃PAHs 梁焱;王碧云 【摘要】Seven kinds of SPE - HPLC methods for the detection of PAHs in water were introduced in this article, and the extraction efficiency was the highest when ACCUBOND ODS C18 and Oasis HLB were used as the solid phase extraction column, it not only had good recovery efficiency and high detection sensitivity, but also had the characters of easy operation and little solvent dosage, and all above corresponded with the basic requirements of PAHs detection. The peak area had good linear relation with the mass concentration, with the correlation coefficient of more than 0.9990. The average recovery rate was 81.8% ～107.4%, and the relative standard deviation was 1.80%～5.73%.%介绍了7种水中多环芳烃高效液相色谱的检测方法,其中以ACCUBOND ODS C18作为水中PAHs固相萃取柱的萃取效率最高,不仅各组分的回收效率和检测灵敏度高,而且具有操作简便、溶剂用量小的特点,符合水中多环芳烃检测的基本要求,其峰面积与质量浓度呈现良好的线性关系,相关系数≥0.9990,平均加标回收率为81.8％～107.4％,相对标准偏差为 1.80％～5.73％. 【期刊名称】《江西农业学报》 【年(卷),期】2011(023)008 【总页数】4页(P153-155,163) 【关键词】液相色谱;多环芳烃;甲醇;固相萃取