绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达
背景知识
绿色荧光蛋白( green fluorescent protein ， GFP)是一类存在于包括水母、水螅
和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时， GFP 发射绿色荧光。它产生荧光无需底物或辅因子。发色团是其蛋白质一级序列固有的。 GFP 由 3 个外显子组成，长 2.6kb ；GFP 是由 238 个氨基酸所组成的单体蛋白 ,相对分子质量为27. 0kMr ，其蛋白性质十分稳定，能耐受 60℃处理。 1996 年 GFP 的晶体结构被解
出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长 420 nm，宽 240 nm，由 11 个围绕中
心α螺旋的反平行β 折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3 个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光
活性很重要的生色团则位于大空腔内。发色团是由其蛋白质内
部第 65-67 位的 Ser-Tyr-Gly 自身环化和氧化形成 .
实验一质粒DNA 的分离与纯化
一、实验目的
掌握一种最常用的质粒 DNA 提取方法：碱裂解法。该法用
于从小量培养物中抽提质粒 DNA ，比较方便、省时，提取的
质粒 DNA 质量较高，可用于 DNA 的酶切、 PCR 甚至测序。
二、基本原理
质粒是一类在细菌细胞内发现的独立于染色体外，能够自主复制的稳定的遗传单位。迄今为止，从细菌中分离得到的质粒都是环型双链 DNA 分子，分子量范围从 1kb 到
200kb 。质粒 DNA 可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下又会可逆地
整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。在大多
数情况下质粒 DNA 复制中的酶体系和细菌染色体复制
10-200 个拷贝。当宿主细胞的蛋白
时所用的酶是相同的。有些质粒复制受宿主细胞复制作用的严格限制，因此每个细胞中只含一个或几个拷贝，称为严谨型质粒，有的质粒的复制受宿主细胞的控制不严，称为松弛型质粒，它们在每个细胞中的数目可达质合成受到抑制时（例如经氯霉素处理），细菌染色体虽不再增加，但松弛型质粒 DNA 可继续被复制，以至每个细胞内的拷贝数可以增至一千到几千。
质粒具有一定的生物功能，它们往往带有一些抗药标记，当质粒 DNA 用人为的方法转化进细菌时，转化后的细菌会表现出质粒基因所具有的新的生物表现型，例如，把一个含有抗药基因的质粒转入细菌后，原来无抗药性的细菌则表现出抗药的新表型。借助转化菌获得的新表型特征，可证实质粒已转入宿主细菌中，这样就可以作为转化菌的选择性标记。
质粒作为基因克隆载体分子的重要的条件是获得批量的纯化的质粒 DNA 分子。目前已有许多方法可用于质粒 DNA 的提取，它们都包括三个基本的步骤：细菌的生长和质粒的扩增；菌体的收集裂解，质粒 DNA 的分离；质粒 DNA 的纯化。
1、细菌的生长和质粒的扩增从琼脂培养基平板上挑取一个单菌落，接种到含适当抗生素的液体培养基中培养。对于松弛型质粒（如 pUC 系列）来说，只要将培养物放到标准的 LB 或 2YT 培养基中生长到对数晚期，就可以大量提取质粒，而不必选择性地扩增质粒 DNA 。但对于严谨型质粒（如 pBR322 ）来说，则需在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行选择性扩增。
2、菌体的收集、裂解和质粒DNA 的分离质粒分离的基本原理是利用宿主菌（一般是大肠杆菌菌株） DNA 与质粒 DNA 之间的两种主要性质差异：（ 1）大肠杆菌的染色体较一般的载体质粒DNA 大得多。（ 2）从细胞中提取得
到的大肠杆菌 DNA 主体是变性的线性分子，而大多数质粒 DNA 是共价闭合的环状分子。这里主要介绍碱裂解法的基本原理：在细菌悬浮液中加入SDS（十二烷基硫酸钠）和NaOH 使菌体
裂解（有时需要先使用溶菌酶水解细胞壁）。此处理可破坏碱基配对，故可使细菌的线状染色体 DNA 变性，但闭环质粒 DNA 链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。当条件恢复正常时（如加入酸性的 NaAc 或 Kac 中和碱性 NaOH ），质粒 DNA 链迅速得到准确配对，重新恢复成天然的超螺旋分子。通过离心，可以使染色体 DNA 与变性蛋白质、 RNA 分子一起沉淀下来，而质粒超螺旋分子仍滞留于上清中。
3、质粒 DNA 的提纯
胶电泳中不同构型的同一种质粒 DNA ，尽管分子量相同，但具有不同的电泳迁移率。其中走在
最前沿的是 SC DNA ，其后依次是 L DNA 和 OC DNA 。
三、实验材料、仪器及试剂
1. 在含有 pEGFP －N3质粒的DH5α平板上菌落上挑取菌种， 置于含有 5mL LB 培养基
的试管中。 摇晃过夜。 （DH5α是一种大肠杆菌的诱变菌株，主要表现对外源 D NA 的免疫缺乏，是用
于基因工程的菌种）
在含有 pET-28a 质粒的平板上挑取单菌落于另外一个试管中，同样摇荡培养过夜。
2、使用仪器 恒温培养箱，超净台，恒温摇床，制冰机，台式离心机，小型混合器，冰箱
四、实验步骤
1. 取1.5ml DH5 α培养液倒入 1.5mL eppendorf 管（一种离心管） 中, 13000rpm 离心1min 。
对于小量制备的质粒 DNA ，经过苯酚抽提、 蛋白质及 RNA ，达到纯化的目的。
质粒 DNA 分子具有三种构型：共价闭合
环形 构型）和线性分子（ L 构型）。在细RNA 酶消化和酒精沉淀等简单步骤除去残
余
DNA （cccDNA ，SC 构型）、开环 DNA （ OC
2. 重复 1。
3.弃上清 ,将管倒置于卫生纸上数分钟 ,使液体流尽。
4.菌体沉淀重悬浮于 100 μL溶液Ⅰ中（需剧烈振荡）, 室温下放置 10min。
（溶液I ，50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA ，pH 8.0 ；溶液I的作用；mM为mmol/L。
任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当 pH值的 Tris-Cl 溶液。50
mM葡萄糖最大的好处是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。EDTA是 Ca2+和Mg2+等二
价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物
生长。在溶液 I 中加入高达 10 mM 的 EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。）
5.加入新配制的溶液Ⅱ 200μ l, 盖紧管口，快速温和颠倒 eppendorf 管5次 ,以混
匀内容物（千万不要振荡）,冰浴 5min 。
（溶液 II ，0.2 M NaOH / 1% SDS ；溶液 II 的作用；这是用新鲜的 0.4 N 的NaOH和2％的 SDS等体积混合后使用的。要新从浓 NaOH稀释制备 0.4N的NaOH，保证 NaOH没有吸收空气中的 CO2而减弱碱性。其实破细胞的主要是碱，而不是 SDS，所以才叫碱法抽提。事实上 NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从 bilayer （双层膜）结构向micelle （微囊）结构的相变化所导致。用了不新鲜的 0.4 N NaOH，即便是有 SDS也无法有效溶解大肠杆菌（不妨可以自己试一下），自然就难高效率抽提得到质粒。这一步要记住两点：第一，时间不能过长，因为碱性条件下基因组 DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组 DNA也会断裂。）
6.加入 150 μL预冷的溶液Ⅲ ,盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡3次 ,使沉淀混匀 ,冰浴中 15分
钟,13000rpm 离心 5min。
（溶液 III ，3 M 醋酸钾 / 2 M 醋酸。溶液Ⅲ含 3M 醋酸钾 / 2M 醋酸。溶液 III 加入后就会有大量的沉淀，这其实是 SDS遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（PDS），而 PDS是水不溶的，因
此发生了沉淀。而高浓度的盐，使得沉淀更完全。SDS易与蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合
一个 SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀。大肠杆菌的基因组DNA也会一起被共沉淀，因为基因组 DNA太长，容易被 PDS共沉淀，注意SDS并不与 DNA分子结合。
2M的醋酸是为了中和 NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA，所以要中和之。基因组DNA一旦
发生断裂，只要是 50－100 kb大小的片断，就没有办法再被 PDS共沉淀了。所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组DNA混入，琼脂糖电泳可以
观察到一条浓浓的总 DNA条带。很多人误认为是溶液 III 加入后基因组 DNA无法快速复性就被沉淀了，这是天大的误会，因为变性的也好复性的也好，DNA分子在中性溶液中都是溶解的。 NaOH
本来是为了溶解细胞而用的， DNA分子的变性其实是个副产物，与它是不是沉淀下来其实没有关系。溶液 III 加入并混合均匀后在冰上放置，目的是为了PDS沉淀更充分一点。）
7.上清液移入干净 eppendorf 管中,加入等体积的氯仿 /异戊醇（24 ： 1）,振荡混
匀 , 13000rpm离心 2min。
（PDS沉淀的形成后有些蛋白质不能被沉淀，因此要用酚 / 氯仿/ 异戊醇进行抽提，然后进行酒精沉淀才能得到质量稳定的质粒 DNA，不然时间一长就会因为混入的 DNase而发生降解。这里用 25： 24： 1的酚/ 氯仿/ 异戊醇是有很多道理的。酚（ Phenol ）
对蛋白质的变性作用远大于氯仿，但是水饱和酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液（比如4M的异硫氰酸胍），离心后酚相会跑到
上层，不利于含质粒的水相的回收；加入氯仿后可以增加比重，使得酚 / 氯仿始终在下层，方便水相的回收；还有一点，酚与水有很大的互溶性，如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反应（比如限制性酶切反应），而用酚 / 氯仿的混合液进行抽提，跑到水相中的酚则少得多，微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而不必担心酶切等反应不能正常进行。至于异戊醇的添加，其作用主要是为了让离心后上下层的界面更加清晰，也方便了水相的回收。）
8.将水相移入干净 eppendorf 管中 ,加入等体积的氯仿 / 异戊醇（24： 1）振荡混
匀 , 13000rpm离心 2min。
9.将水相移入干净 eppendorf 管中,加入 2 倍体积的无水乙醇 ,振荡混匀后，置于室温
下 2min，然后 13000rpm离心 5min 。
（回收后的水相含有足够多的盐，因此只要加入 2倍体积的乙醇，在室温放置几分钟后离心就可以将质粒 DNA 沉淀出来。）
10.弃上清 ,将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出,加入1mL 70 ％乙醇洗沉淀一次 , 振荡混
匀后， 13000rpm 离心 5min 。
（高浓度的盐会水合大量的水分子，因此DNA分子之间就容易形成氢键而发生沉淀。
如果感觉发生了盐的沉淀，就用70％的乙醇多洗几次，每次在室温放置一个小时以上，并用移液枪枪头（tip ）将沉淀打碎，就能得到好的样品。）
11.吸除上清液 ,将管倒置于卫生纸上使液体流尽 ,室温干燥。
12.将沉淀溶于 30μL TE缓冲液（pH8.0 ，含20μ g/mL RNaseA）中，保存在 -20℃冰
箱中。（溶解已经讲解的 RNA，防止未降解的 RNA会干扰电泳结果。）
13.按照同样的流程和方法将 pET-28a 的质粒也提出来，保存在 -20℃冰箱中。
五、实验结果
实验二质粒 DNA浓度的测定
、实验目的
学习利用核酸蛋白测定仪测算核酸的浓度和纯度。
、基本原理
核酸分子在 260nm 下有最大吸光值，因此可以通过 260nm 下核酸的吸光值计算核酸浓度mg/ml ），并通过测定与 280nm 和 230nm 的比值，估算 DNA 的纯度。
除了核酸浓度 , 分光光度计同时显示几个非常重要的比值表示样品的纯度 ,如 A 260 / A 280
的比值 ,用于评估样品的纯度，因为蛋白的吸收峰是280 nm. 纯净的样品 , 比值大于
1.8 （DNA）
或者 2.0 （ RNA）。如果比值低于 1.8 或者 2.0 ，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。 A 230 表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物, 多肽 , 苯酚等，较纯净的核酸 A 260 / A 230 的比
值大于 2.0 。A 320 检测溶液的混浊度和其他干扰因子。纯样品， A 320 一般是
0 。）
三、实验材料与仪器
1、实验材料
pEGFP－ N3和pET-28a DNA
2.使用仪器
Eppendorf 核酸蛋白测定仪，移液枪
四、实验步骤
1.按下 Eppendorf 核酸蛋白测定仪 dsDNA ，比色皿中加入 100μl ddH2O，blank 空白对照。
2.取一 0.5ml 离心管，吸取质粒 DNA 5 μ l，然后再加入 95μl ddH 2O，混匀。
3.将 100μl 的溶液转移到比色皿中，注意不要出现气泡。
4.按下 sample ，记录 260nm 下 DNA 的浓度（ mg/ml ）。并同时记录 OD
260nm/280nm，
OD260nm/230nm 的比值，估测 DNA的纯度。
5.计算质粒 DNA 母液的浓度 =OD260nm 下的浓度× 20（ mg/ml ），
DNA的纯度： OD260nm/280nm=1.8±0.1（如果低于 1.7 ，说明样品中蛋白质去除的不完全，或样品中有苯酚的污染；如果高于 1.9 ，说明样品中 RNA去除的不完全。）正常 OD260nm/230nm 约为 2.5， OD 260nm/230nm 小于 2.0 ，表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物 , 多肽 , 苯酚等盐和小分子。
实验三琼脂糖凝胶电泳
一、实验目的
学习掌握一种最常用的分离、鉴定、纯化 DNA 片段的比较方便、省时的技术：琼脂糖凝胶电泳的基本原理和操作方法。
二、基本原理
影响 DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素主要有：（ 1）DNA分子的大小双链 DNA 分子在凝胶基质中迁移的速率与其碱基对数的常用对数成反比。分子越大，迁移的越
慢，因为摩擦阻力越大，也因为大分子通过凝胶孔径的效率低于较小的分子。（2）琼脂糖浓度给定大小的线
状 DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中迁移速率不同。在 DNA电泳迁移速率的对数和凝胶浓度
之间存在线性相关。（ 3）DNA的构象超螺旋环状（Ⅰ型）、切口环状（Ⅱ型）和线状（Ⅲ型） DNA在琼脂糖凝胶中以不同速率迁移。其相对迁移速率主要取决于琼脂糖凝胶的浓度和类型，其次是电流强度、缓冲液离子强度和Ⅰ型超螺旋绞紧的程度或密度。一些条件下，Ⅰ型DNA比Ⅲ型迁移得快；在另一些条件下，顺序可能相反。（4）所用的电压低电压时， DNA 片段迁移
率与所用的电压成正比。电场强度升高时，高分子量片段的迁移率遂不成比例的增加。所以，当电压增大时琼脂糖凝胶分离的有效范围反而减小。要获得大于2kb DNA 片段的良好分辨率，
所用电压不应高于 5-8V/cm 。（5）电泳缓冲液 DNA 的泳动受电泳缓冲液的组成和离子强度的影响。缺乏离子则电导率降低， DNA或者不动或者迁移很慢。高离子强度时（如
10×
buffer ），电
导率升高，使得应用适中的电压也会产生大量的热能，最严重时凝胶会熔化，DNA变性。
三、实验材料、仪器及试剂
1、实验材料
质粒 DNA
2、使用仪器
核酸电泳仪，小型混合器，冰箱，蓝盾可见光透射仪
四、实验步骤
1、1% 琼脂糖凝胶的配制
（1）加 20ml 1×TBE 缓冲液于三角瓶中。
（TBE缓冲液为 Tris 硼酸 -EDTA缓冲溶液，适合长时间电泳，但测得分子质量大于实际分子质量，； TAE缓冲液为 Tris 醋酸 -EDTA缓冲溶液，运用最广泛，较准确但不适合长时间； TPE缓冲液为 Tris 磷酸 -EDTA 缓冲溶液，磷酸盐易在乙醇沉淀
过程中析出，不适合DNA回收。）
（ 2）精确称取 0.2g 琼脂糖加到三角瓶中，于微波炉中加热至完全熔化，
（ 3）冷却至 60℃左右，
（4）轻缓倒入封好两端和加上梳子的电泳胶板中，静置冷却30 分钟以上，
（5）将胶板除去封胶带，放入电泳缓冲液（TBE ）中，使电泳缓冲液刚好没过凝胶约1mm，轻轻拔除梳子，
（6）取 5μl 质粒 DNA 及 2μl Genefinder 混匀上样。（也可使用 GelRed荧光核酸凝胶染色试剂，用凝胶成像仪显影）
（7）50-100v 约电泳 0.5-1 小时。
（8）蓝盾可见光透射仪观察结果。
五、实验结果
实验四酶切及连接学习使用限制型内切酶进行 DNA酶切的原理和方法。
1. 实验目的
3.1 实验材料
2. 实验原理
迄今已发现了 3000 多种限制性内切酶。传统上将限制性内切酶按照亚基组成、酶切位置、 识别位点、辅助因子等因素划分为三大类。 II 型酶在其识别位点之中或临近的确定位点特异地 切开 DNA 链。它们产生确定的限制片段，因此是三类限制性内切酶中唯一用于 DNA 分析和克隆
的一类。
II 型限制性内切酶中最普遍的是象 EcoR I 、Hind III 、 BamHI 和 Not I 这样在识别序列中 进行切割的酶。这一类酶是构成商业化酶的主要部分。大部分这类酶都以同二聚体的形式结合
到 DNA 上，因而识别的是对称序列；但有极少的酶作为单聚体结合到 D NA 上，识别非对称序列。
一些酶识别连续的序列（如 EcoR I 识别 GAATTC ；Hind III 识别 AAGCTT;BamH 识I 别 G ↓ GATCC;
Not I 识别 GC ↓ GGCCG ）C ；而另一些识别不连续的序列（如 Bgl I 识别 GCCNNNNNG ）G 。C 限制
性内切酶酶切 DNA 后形成两种类型的末端： （i ） 两条链断裂的位置是交错地， 产生粘性末端，如
DNA 连接酶能够催化在两条 DNA 链之间形成磷酸二酯键，这种酶需要在一条 DNA 链的 3'-
EcoR I 酶切后产生
5' -G ↓AATTC-3'
3' -CTTAA ↓G-5' 末端；（ii ） 两条链的断裂位置处在一个对称结构 的中心，产生平末端，如 HaeIII 酶切后产生
5' -GG ↓ CC-3'
3' -CC ↓ GG--P ）。
3.实验材料、仪器及试剂
pEGFP－N3和pET-28a DNA 3.1 实验材料
3.2 仪器准备水浴锅、移液器、电泳槽、电泳仪、振荡器、制冰机、蓝盾可见光透射
仪、凝胶成像仪
3.3 试剂
BamH I（10U/ μ L）（TaKaRa公司）; Not I （10U/ μ L）（TaKaRa公司）,T4 ligase
4.操作步骤
4.1 酶切
按如下双酶切体系（ 30μL）混合：
反应物（μ L）pEGFP-N3 pET-28a
质粒18 18
BamH I 2 2
Not I 2 2
10×buffer K 3 3
0.1%BSA缓冲液 3 3
（BSA缓冲液为牛血清白蛋白，稳定酶的活性。）
1. 离心 10s，混匀。
2. 37℃水浴酶切 3-4h 。
3.配制 1.0%（ M/V）普通琼脂糖凝胶 30ml。
（1%（m/v）指：一般是固体溶于液体的， 1g 固体溶于 100mL水中。）
4.适当放置冷却， 45℃左右倒于电泳胶板上，插好梳子。
5.待凝胶凝固好以后，拨下梳子。
6.酶切样品中加入 5μl溴酚蓝 -GeneFinder 混合液混匀，上样。
7.1×TBE Buffer ， 80V（3-4V/cm）下电泳 30min。
8.荧光激发器观察质粒 DNA 条带的酶切情况，并照像。
4.2 回收酶切产物（采用天为时代 DNA回收试剂盒进行回收）
4.3 连接
1) 配30mL 1 ％进口琼脂糖凝胶，尽量长一些(用粗梳子)，对酶切产物进行电泳分离；
2) 将酶切产物全部加入加样孔中 3) 跑胶，观察结果，并且拍照。
4) 用干净的刀片将需要的 DNA 条带从凝胶上切下来，称取重量。 5) 以0.1g 凝胶对应 300μ L 的体积加入 PN(溶胶液) 。
6) 50℃水浴放置 10min ，期间不断温和上下翻动离心管至胶完全融解。 7) 将上一步得到的溶液加入到一个吸附柱中，吸附柱再放入收集管，
弃掉废液。
吸附柱，用于吸附层析)
8) 加入800μ L 漂洗液 PW ，13000rpm 离心 60s ，弃掉废液。 (PW 是去盐的洗脱液，目的是洗脱脂类、蛋白及盐类等杂质) 9) 加入500μ L 漂洗液 PW ，13000rpm 离心 60s ，弃掉废液。 10) 将离心吸附柱放回收集管， 13000rpm 离心 2min 。
11) 取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间位置加入适量洗脱缓冲液
EB 30μL ，洗脱缓冲液先在 65℃水浴预热，室温放置 2min ，13000rpm 离心 1min ，然后将离 心的溶液重新加回离心吸附柱中， 13000rpm 离心 1min 。 12) 置于－ 20 ℃保存。 按照连接体系进行， 16℃连接过夜。
13000rpm 离心 60s ，
反应物体积 / μL
回收纯化的 pET-28a 质粒
5
gfp 基因片段12
T4连接酶 1
缓冲液（ 10×） 2
实验五大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
一、实验目的
了解和掌握大肠杆菌感受态细胞的制备方法的原理和操作要点，以及质粒 DNA 转化大肠杆菌细胞的原理和方法。
二、基本原理
外源 DNA 只有转化到大肠杆菌细胞内才能得到扩增。感受态指细菌细胞具有的能够接受外源 DNA 的一种特殊生理状态。大肠杆菌的感受态可用 CaCl2 处理而诱导产生：将正在生长的大肠杆菌细胞在 0℃下加入到低渗的 CaCl2溶液中，便会使细胞膜的透性发生改变，此时的细胞即呈现为感受态。这一方法可以用于批量制备感受态细胞，其转化效率可达到5× 106-2× 107
个转化克隆子 /μg 超螺旋质粒 DNA 。制备好的大肠杆菌感受态细胞可在 -70℃冻存。
在 0℃下外源 DNA 可吸附到感受态细胞表面，短时间的热刺激（42 ℃， 90s）诱导细胞吸
收 DNA 。（Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域，诱导细胞成为感受态细胞。将该体系热激，细胞膜的液晶结构会发生剧烈扰动，并随机出现许多间隙，外源DNA就可能被细胞吸收。进入细胞的外源DNA分
子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。）转化了质粒DNA的大肠杆菌随后在培养基中 37℃培养1hr ，可使质粒DNA中编码
抗生素抗性的基因得以表达，因此，转化了质粒DNA的大肠杆菌细胞可在含有相应抗生素的培养基上
生长，而没有转化的细胞则无法生长。
三.实验材料、仪器 1. 实验材料
DH5α， BL21，pET-28a重组质粒 DNA
2. 使用仪器
水浴锅，高压灭菌锅、移液器、超净工作台、离心机、振荡培养箱，制冰机
四、操作步骤
1. LB （Luria-Bertain ）液体和固体培养基的配制（参考附录）
氨苄青霉素和卡那霉素等抗生素不抗热，如果培养基温度过高，容易导致抗生素失效，应
使培养基降温至 60℃左右后，再加入抗生素。但也不应使培养基的温度过低，否则容易出现气
泡。 75mm 直径的培养皿约需 15ml 培养基。
2．感受态细胞的制备（CaCl 2法）
（1）挑一大肠杆菌单菌落放入 3ml LB液体培养基（含 Kan+）， 37℃培养过夜。（2）活化大肠杆菌：取 3ml新鲜的 LB液体培养基加入 50-150 μ l 的过夜菌，培养2-3个小时。
（3）将昨夜摇出来的 DH5α 或BL21培养液转入离心管中 , 冰上放置 10min, 然后于4℃下
4000rpm离心 5min 。
（4）弃去上清 ,用预冷的 0.1mol/L 的CaCl2溶液600μL轻轻悬浮细胞 , 冰上放置20min, 4 ℃下 4000rpm离心 5min 。
（5）弃去上清 , 加入 300μ L预冷的 0.1mol/L 的CaCl2 溶液 , 轻轻悬浮细胞 , 冰上放置 5min, 即成感受态细胞悬液，可 -80 ℃长期保存。
3.转化涂板
（1）取2个无菌离心管，分别加入 100μL DH5α感受态细胞悬液，第 1管加5μl 无菌水，第 2管
加入质粒 DNA溶液 5μl, 轻轻摇匀 , 冰上放置 30min 。
（2）42℃水浴中热激 90s, 热激后迅速置于冰上冷却 5min。
（3）分别向管中加入 100μL LB液体培养基 ,混匀后在 37℃振荡培养 30min。
（4）从管1中取50μL涂布于含抗生素和不含抗生素的平板上 , 从管2中取50μL和100μL涂布
于含抗生素的平板上。正面向上放置约10分钟 , 待菌液完全被培养基吸收后倒置培养
皿 ,37 ℃培养 20小时。
绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取 南方医科大学 2011预防医学（卫生检验检疫） 摘要 目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，以及对其进行粗提取。方法：从E.coli DH5ɑ中用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFP-N3和质粒pET-28a。然后用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。再用限制性内切酶BamHI和NotI 对成功提取的质粒进行酶切，并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，用以确定已经提取了GFP基因。将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞E.coli BL-21中，用LB培养基对转化后的E.coli进行扩大培养。用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。结论：本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术，为进一步的实验奠定基础。 关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化粗提取
1 前言 (3) 2 实验目的 (4) 3 实验设备 (4) 4 材料及试剂 (5) 5 实验操作步骤 (5) 5.1操作流程 (5) 5.2质粒DNA的分离与纯化 (6) 5.2.1 质粒的培养 (6) 5.2.2 质粒的DNA的碱提取法 (6) 5.2.3 质粒DNA的鉴定与纯化 (7) 5.3酶切及连接 (7) 5.3.1 双酶切 (7) 5.3.2 回收酶切产物（采用DNA回收试剂盒进行回收） (8) 5.3.3 连接 (9) 5.4大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 (9) 5.4.1 LB（Luria-Bertain）液体和固体培养基的配制（参考附录） (9) 5.4.2．感受态细胞的制备(CaCl2法) (9) 5.4.3 转化涂板 (10) 5.5GFP蛋白的诱导表达 (10) 5.6绿色荧光蛋白的粗提取 (11) 参考文献 (11) 附录 (12) 1LB培养基的配制： (12) 2.溶液Ⅰ (12) 3.溶液Ⅱ (12) 4.溶液Ⅲ（100ML） (12) 5.DN ASE-FREE RN ASE A (12) 6.TE缓冲液（P H8.0） (12) 7.20×TBE (13) 8.G ENE F INDER-溴酚蓝上样缓冲液 (13) 9．PEGFP-N3质粒全图谱 (13) 10．P ET-28A质粒全图谱 (14)
绿色荧光蛋白的克隆 摘要：目的：研究绿色荧光蛋白基因的基因克隆。方法：分别提取DH-5α(pEGFP-N1)和DH-5α(pMD-18T)质粒，将两个质粒酶切并连接形成重组质粒pMD-18T-GFP，将重组质粒导入DH-5α克隆菌中进行转化，用抗生素抗性筛选后，通过限制性核酸内切酶EcoR I 和 Hind III对所建质粒进行分析鉴定。 关键词：绿色荧光蛋白 DNA重组 The cloning of green fluorescent protein Abstract：Objective: Studies indicated the cloning of the GFP gene.Methods: Extract the plasmid of the DH-5α(pEGFP-N1) and DH-5α (pMD-18T). Then cutting by enzyme and connecting the two plasmids to form pMD-18T-GFP recombined plasmid. The recombinant plasmid confirmed by restriction enzyme and PCR was transferred into E.coli DH-5αto ensure the expression of green fluorescent protein. After resistant screening with antibiotics, analyze and identify the recombined plasmid. Keywords: Green Fluorescent Protein DNA recombination 随着分子生物学和基因工程技术的迅速发展和广泛应用，重组DNA技术在发展蛋白质、多肽类药物与疫苗、转基因和基因敲除动物、HGP、基因诊断和基因治疗等方面得到广泛应用。 重组DNA技术又称分子克隆或DNA克隆技术，是将体外的目的DNA片段与载体连接，形成重组DNA分子，进而通过转化宿主菌（受体细胞）在其中复制、扩增，经筛选、鉴定获得单一DNA分子的大量拷贝（即克隆）。 基因标记技术是近年来发展起来的分子生物学技术。荧光蛋白基因在标记基因方面由于具有独特的优点而引起了科学家的广泛关注，现已被普遍应用到分子生物学研究的各个方面。荧光蛋白是海洋生物体内的一类发光蛋白，分为绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、
绿色荧光蛋白的克隆表达——分子实验设计报告 安平20 蒋云凤20 一、引言 2008年，三位科学家在一种学名Aequorea victoria的水母中发现了绿色荧光蛋白（GFP），其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色荧光。从此，绿色荧光蛋白作为一种新型标记蛋白被广泛应用于细胞生物学与分子生物学中，在DNA重组技术的配合下，绿色荧光蛋白独特的发光机制使我们能够更清晰地观察到细胞内部的结构和活动，从而极大地推进了微观生物学的发展。 本次试验的目的即为通过DNA重组技术，将GFP基因导入大肠杆菌质粒中并诱导表达，从而获得能发出绿色荧光的大肠杆菌。 实验中使用了pEGFP-N3质粒，其上携带有EGFP蛋白表达基因，EGFP是一种优化的突变型GFP，使其产生的荧光较普通GFP强35倍，大大增强了其报告基因的敏感度。将pEGFP-N3上的EGFP基因转移至大肠杆菌中，需要的载体为pET28a，pET质粒是最有效的原核表达系统之一，将pEGFP-N3质粒与表达载体pET28a重组，并将重组质粒转化感受态细胞，基因在细胞中表达后即可观察到发光的大肠杆菌。 二、实验流程
三、实验步骤 1、Pet28a导入细菌并扩大培养 1.1实验原理：由于实验材料只有少量的pet28a质粒，需要对它进行扩增，于是我们首先要将pet28a转化入大肠杆菌中进行扩大培养。转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组DNA分子导入细菌的过程。其原理是细菌处于0℃，在有氯化钙存在的低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-磷酸钙复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热击处理，促进细胞吸收DNA。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型得到表达，然后将此细菌培养物涂在含有抗生素的选择培养基上。为了提高转化成功率，我们选择使用能够摄入外源DNA的DH5α受溶菌。将pet28a导入DH5α细胞后，将细胞涂布在含有卡那霉素的LB培养基上扩大培养，由于pet28a 上带有卡那霉素抗性基因，能在培养基上正常生长的菌落即为成功转入pet28a的细菌。1.2实验目的：扩增pet28a载体 1.3实验材料 1.3.1材料 少量pet28a基因，大肠杆菌DH5α细胞，平板，涂布器，酒精灯，EP管等 1.3.2试剂 LB固体培养基（pH=7）：酵母粉0.5 g，蛋白胨1.0 g，NaCl 1.0 g，琼脂粉1.5g，蒸馏水，5mol/L的NaOH溶液 卡那霉素：50mg/ml，配制后抽滤灭菌，分装，-20℃冻存。 1.4实验方法 1）取100 μl感受态DH5α加入1.5ml离心管中，冰上慢速解冻，溶化后加入2 μl pet28a质粒，轻轻混匀，冰上静置10-30 min 2）30分钟后取出混合物42℃水浴热冲击90 s，之后立即冰浴5分钟 3)5分钟后向混合物加0.8mlLB液体培养基，于37摄氏度摇床震荡培养1小时 4）之后将混合物离心，6000转3分钟，离心后去掉上清，保留沉淀（菌细胞） 5）吸取80微升菌液于含有卡那霉素的LB固体培养基上，涂布均匀，在超净工作台上放置30分钟 6）平板做好标记，用封口膜封好，置于37度恒温培养箱中培养过夜，第二天观察结果。 1.5实验结果预期 在培养基上生长出了大量菌落，即转导入pet28a的大肠杆菌DH5α细胞。 1.6实验结果讨论、注意事项 1）这一步实验建立在已有DH5α细胞的基础上，若没有现成的DH5α，则需要制备。 2）DH5α、pet28a、培养基的用量来自于查阅文献，可能并不适用于这个实验，需要再次确认。 3）整个操作在无菌条件下进行，所用材料都要经过灭菌，并严防污染。 2、碱裂解法提取质粒 2.1实验原理 1）质粒是一种染色体外的遗传因子，大小在1kb~200kb之间，是具有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制能力，，能使子代保持他们恒定的复制数，可表达它携带的遗传信息。它可以独立游离于细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主细胞就不能复制，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。 2）从大肠杆菌中抽提质粒DNA的方法很多，可以在实验中根据不同的需要采用不同的方法。
3 结果与分析 3.1质粒提取 用醋酸铵法提取pET-28a 和pEGFP-N3质粒后，进行琼脂糖电泳检测质粒是否提取成功。得到电泳结果，如图一所示，3、4号泳道有明显清晰的条带说明pEGFP-N3提取成功。1、2泳道同样有明显清晰的条带，说明pET-28a 提取成功。 3.2 双酶切 用BamH1和Not1分别对pEGFP-N3和pET-28a 双酶切。1、2号泳道为pEGFP-N3的酶切结果，如图二所示，电泳会得到两条带，说明pEGFP-N3酶切成功。4号泳道为pET-28a 的酶切产物的电泳有明显条带，证明酶切成功。 3.3 抗性筛选 通过氯化钙法制备DH5α感受态细胞，用热激发将pET-28a-GFP 转入DH5α感 图 1 pET-28a 和pEGFP-N3质粒提取电泳图 1、2泳道为pET-28a 电泳结果 3、4号泳道为pEGFP-N3电泳结果 图 2 BamH1、Not1双酶切 pEGFP-N3和pET-28a 1、2号泳道为pEGFP-N3酶切产物 3号泳道为pEGFP-N3原始质粒 4号泳道为pET-28a 酶切产物 5号用泳道为pET-28a 原使质粒
受态细胞。转化重组质粒后涂平板，进行重组质粒的抗性筛选。因为28a中含有 抗卡那基因，所以筛选后可以得到含28a的重组质粒。从图中可以看出1号平板 长出较多菌落，说明DH5α感受态细胞存活。2号平板无菌落生长，说明DH5α中 不含抗卡那基因。3号板生长出较少菌落，证明卡那有活性。4号板无菌落生长。 失败原因其一可能是在倒了第一个平板加入卡那后，由于倒平板速度太慢，导致 培养基凝固，影响了卡那的浓度和活性。其二可能是在转化过程中，离心后，弃 上清的过程中，将沉淀和上清混在了一起，影响了溶液的浓度。 图3重组质粒转化DH5α感受态细胞 1号图为不含卡那的阴性对照 2号图为含卡那的阴性对照 3号图为含卡那的自提pET-28a的阳性对照 4号图为含卡那的连接产物结果 3.4PCR鉴定 经PCR扩增后，进行琼脂糖凝胶电泳检测是否扩增成功，得到电泳结果如图 四所示，结果表明，1、2泳道的条带约为700bp，说明成功扩增出含有GFP的基 因。DNA电泳检验扩增片段,选出能够得到700bp左右片段的阳性克隆。 图4阳性重组菌的PCR鉴定 1、2号泳道为重组质粒转化结果
绿色荧光蛋白在原核生物中的表达 一.实验目的 1、了解表达用基因克隆引物设计的原理和方法。 2、了解利用原核表达系统表达外源基因的原理、流程及方法。 3、掌握PCR、DNA片段的酶切与连接、细菌转化、阳性克隆筛选、质粒提取、DNA样品的纯化、核酸电泳等分子生物学基本技术。 二．实验原理 基因工程一般包括四个步骤：一是取得符合人们要求的DNA片段，这种DNA 片段被称为“目的基因”；二是将目的基因与质粒或病毒DNA连接成重组DNA；三是把重组DNA引入某种细胞；四是把目的基因能表达的受体细胞挑选出来。本实验根据绿色荧光蛋白（GFP）的基因序列设计一对引物，用该引物将GFP 基因从含GFP基因的质粒中扩增出来。再利用双酶切切开表达载体pET23b和目的基因的两端接头，通过T4连接酶GFP基因与表达载体重组。将含GFP基因的重组表达载体导入宿主菌BL21(DE3),在IPTG的诱导下，使GFP基因表达三．仪器设备 超净工作台、PCR仪、核酸电泳设备、灭菌锅、培养箱、恒温摇床、微量移液器、核酸蛋白图像分析仪、离心干燥仪、低温离心机、常温台式离心机、微量分光光度计、水浴锅、微波炉、金属浴、涡旋仪、掌中宝离心机等 四．实验试剂 质粒提取试剂盒、DNA回收试剂盒、高效感受态制备试剂盒、T4连接酶、NheI、XhoI、Taq酶、氨苄青霉素（Amp）、IPTG、Goldview、核酸分子量标准、核酸电泳试剂、细菌培养用培养基 五．实验菌株载体及引物 大肠杆菌BL21.表达载体PET23b PET23Bgfpf PET23Bgfpr T7Pomotor Primer T7 Terminnator Primer 第一天 一、实验药品的配制： LB培养基的配方如下: 胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L；酵母提取物(Yeast extract) 5g/L 氯化钠(NaCl) 5g/L 另外根据经验值用NaOH调节该培养基的pH，使其达到7.4，固体培养基加入琼脂粉20g/L 。 1、含Amp LB固体培养基的配制： 准备500ml锥形瓶1个，配制LB固体培养基250ml。 121℃灭菌20min。待培养基冷至60℃左右（以不烫手背为标准），加入Amp(50mg/ml)300μl至终浓度为60μg/ml，倒平板备用。 2、液体LB培养基的配制： （1）配制LB液体培养基100ml： （2）准备试管20个，每支分装5ml。121℃灭菌20min，备用。 3、10×TBE（89mM Tris碱，89mM硼酸，2mMEDTA） Tris碱108g
绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达 背景知识 绿色荧光蛋白( green fluorescent protein ， GFP)是一类存在于包括水母、水螅 和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时， GFP 发射绿色荧光。它产生荧光无需底物或辅因子。发色团是其蛋白质一级序列固有的。 GFP 由 3 个外显子组成，长 2.6kb ；GFP 是由 238 个氨基酸所组成的单体蛋白 ,相对分子质量为27. 0kMr ，其蛋白性质十分稳定，能耐受 60℃处理。 1996 年 GFP 的晶体结构被解 出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长 420 nm，宽 240 nm，由 11 个围绕中 心α螺旋的反平行β 折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3 个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光 活性很重要的生色团则位于大空腔内。发色团是由其蛋白质内 部第 65-67 位的 Ser-Tyr-Gly 自身环化和氧化形成 . 实验一质粒DNA 的分离与纯化 一、实验目的 掌握一种最常用的质粒 DNA 提取方法：碱裂解法。该法用 于从小量培养物中抽提质粒 DNA ，比较方便、省时，提取的 质粒 DNA 质量较高，可用于 DNA 的酶切、 PCR 甚至测序。 二、基本原理 质粒是一类在细菌细胞内发现的独立于染色体外，能够自主复制的稳定的遗传单位。迄今为止，从细菌中分离得到的质粒都是环型双链 DNA 分子，分子量范围从 1kb 到 200kb 。质粒 DNA 可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下又会可逆地 整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。在大多 数情况下质粒 DNA 复制中的酶体系和细菌染色体复制 10-200 个拷贝。当宿主细胞的蛋白
分子生物学综合实验论文题目: 绿色荧光蛋白(GFP)的基因克隆及表达 中国·黄石 2010年12月 绿色荧光蛋白（GFP）基因的克隆与表达 胡丽丹 （湖北师范学院生命科学院0803班湖北黄石 43500）
摘要：绿色荧光蛋白（GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。用碱裂解法提取的的质粒pEGFP-N3和pET-28α经过Bam H I和Not I双酶切连接后，得到pET-28α-pEGFP-N3重组质粒。取部分的重组质粒做酶切实验，验证重组质粒的存在性，剩下的重组质粒导入表达菌E. coLi BL-21大肠杆菌感受态细胞中。重组有GFP基因的E. coLi BL-21，在含有1 μL/mL 的卡纳霉素的LB培养基上培养。当A600达到0.7时，用终浓度为0.8 mM的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导培养3小时，离心得到下层绿蓝色沉淀物即可。 关键词：绿色荧光蛋白 GFP 基因的克隆荧光蛋白水母 CLoning and Expression of Green FLuorescent Protein Gene HU Li-Dan ( Class three Grade eight, College of Life Sciences department, Hubei Normal university ,Huangshi 435000) Abstract：Green fluorescent protein（GFP）,one kind of bioluminenscent proteins ,has
been found existing in the internal of Coelenterates,such as fellyfish,polyp and coral pEGFP-N3 and pET-28αwas harvested by sodium dodecylsulfate(SDS) alkaline process extraction and Agarose Gel Electrophoresis.After treating the two targeted plasmids with Bam H I and Not I, the recombinant plasmid,namely pET-28α-pEGFP-N3, can be retrieved by furthermore Agarose Gel Electrophoresis. Taking slight recombinant plasmid proves that recombinant plasmid does exist by dienzyme cutting(Bam H I and Not I).The recombinant plasmid lefting would be transported to E. coLi BL-21the competent cells. E. coLi BL-21containing recombinant GFP gene was grown overnight in LB solid medium containing kanamycin (Final concentration: 1 μL/mL). When absorbance at 600 nm value was 0.7, isopropyL β-D-thiogalactopyranoside was added to 0.8 mM and the incubation was continued an addition 3 h. Key words:Green fluorescent protein Fellyfish Genetic Cloning Fluorescin 目录 1.前言： (1) 1.1绿色荧光蛋白（GREEN FLUORESCENT PROTEIN，GFP） (1) 1.1.1 GFP研究背景 (1) 1.1.2 GFP研究应用 (2) 1.2基因的克隆与表达 (3)
生物技术实验报告 姓名：张龙龙 学号：2011506066 班级：11级生技02班
前言：绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水 母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的。GFP 由3 个外显子组成，长2.6kb；GFP 是由238 个氨基酸所组成的单体蛋白,相对分子质量为27. 0kMr，其蛋白性质十分稳定，能耐受60℃处理。1996 年GFP 的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420 nm，宽240 nm，由11 个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由 3 个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。发色团是由其蛋白质内部第65-67位的Ser-Tyr-Gly自身环化和氧化形成. 一.实验目的 1、了解表达用基因克隆引物设计的原理和方法。 2、了解利用原核表达系统表达外源基因的原理、流程及方法。 3、掌握PCR、DNA片段的酶切与连接、细菌转化、阳性克隆筛选、质粒提取、DNA样品的纯化、核酸电泳等分子生物学基本技术。 二．实验原理 基因工程一般包括四个步骤：一是取得符合人们要求的DNA片段，这种DNA片段被称为“目的基因”；二是将目的基因与质粒或病毒DNA连接成重组DNA；三是把重组DNA引入某种细胞；四是把目的基因能表达的受体细胞挑选出来。 本实验根据绿色荧光蛋白（GFP）的基因序列设计一对引物，用该引物将GFP基因从含GFP基因的质粒中扩增出来。再利用双酶切切开表达载体pET23b 和目的基因的两端接头，通过T4连接酶GFP基因与表达载体重组。将含GFP 基因的重组表达载体导入宿主菌BL21(DE3),在IPTG的诱导下，使GFP基因表达 三.实验材料及仪器 1、实验材料：含有GFP的质粒；DNA Marker；DH5α；BL21； 2、仪器：恒温培养箱、超净工作台、恒温摇床、制冰机、台式离心机、涡旋振荡器、冰箱、电泳仪、透射仪、PCR仪、PCR管、刀片、玻璃涂棒、酒精灯、无菌牙签、吸水纸、微型离心管、台式冷冻离心机、塑料手套、1.5ml离心管。 四.实验内容 4.1 质粒的提取、酶切及电泳鉴定： 1)实验试剂：LB培养基；溶液Ⅰ；Tris-HCl（pH=8）；溶液Ⅱ；溶液Ⅲ； 酚/氯仿抽提液；无水乙醇；电泳缓冲液；加样缓冲液；GoldView核酸 DNA 染色剂；1%的琼脂糖凝胶；XhoⅠ(10U/μl)；NdeⅠ（10U/μl）；T 4 lisase。 2)实验步骤： 质粒的提取与鉴定
gfp表达质粒的构建实验报告 1.实验目的 本实验旨在构建含有绿色荧光蛋白（GFP）表达质粒，以便在细胞中实现GFP的高效表达，为后续的生物荧光成像等应用提供支持。 2.实验原理 质粒是一种小型、自主复制的DNA分子，可与细菌染色体DNA分离。质粒上有多个限制性酶切位点，可用于插入外源基因。通过将目的基因插入质粒，并导入受体细胞，可以实现目的基因的表达。本实验将使用含有GFP基因的质粒，将其导入大肠杆菌细胞中，使其表达出绿色荧光蛋白。 3.实验材料 3.1仪器设备：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、恒温培养箱、恒温水浴锅。 3.2试剂：质粒提取试剂盒、限制性核酸内切酶、DNA连接酶、DNA聚合酶Ⅰ、dNTPs、电泳缓冲液、琼脂糖凝胶。 3.3细胞系：大肠杆菌细胞。 4.实验步骤 4.1获取含有GFP基因的质粒：从公共数据库中获取含有GFP基因的质粒序列，并通过PCR扩增获得大量质粒。 4.2酶切质粒：使用限制性核酸内切酶对质粒进行酶切，获得含有GFP基因的片段。 4.3连接质粒：将酶切后的质粒片段与连接酶的作用下，将其连
接至具有相同黏性末端的大肠杆菌质粒上。 4.4转化大肠杆菌：将连接后的质粒转化至大肠杆菌细胞中，通过抗生素筛选出含有重组质粒的大肠杆菌。 4.5验证重组质粒：通过PCR和DNA测序等方法验证重组质粒是否正确插入目的基因。 5.实验结果 通过本实验，我们成功构建了含有GFP基因的重组质粒，并成功导入大肠杆菌细胞中。通过荧光显微镜观察，发现大肠杆菌细胞发出绿色荧光，表明目的基因已正确表达。 6.结果分析 通过本实验结果，我们可以得出以下结论：首先，本实验成功构建了含有GFP基因的重组质粒；其次，通过荧光显微镜观察到目的基因已在大肠杆菌细胞中表达出绿色荧光蛋白；最后，本实验为后续的生物荧光成像等应用提供了支持。 7.结论 本实验成功构建了含有GFP基因的重组质粒，并在大肠杆菌细胞中实现了目的基因的高效表达。该实验结果为后续的生物荧光成像等应用提供了有力支持，具有重要价值。同时，本实验也为其他类似基因的表达提供了参考方法。
gfp 实验步骤 GFP实验步骤 GFP（绿色荧光蛋白）是一种广泛应用于生物学研究中的荧光标记物质，它可以通过荧光显微镜观察到其在细胞或组织中的分布情况。下面将介绍GFP实验的步骤。 1. GFP基因的克隆 需要将GFP基因克隆到感兴趣的载体中。通常，可以使用限制性内切酶对GFP基因和载体进行酶切，并通过连接酶将两者连接在一起。连接后的重组载体可以通过大肠杆菌的转化来复制。 2. 细胞培养 接下来，将含有重组载体的大肠杆菌进行培养，以扩增GFP基因。培养条件要求适当的温度和培养基。当细菌生长到一定程度时，可以进行提取。 3. GFP的纯化 提取细菌后，需要进行GFP的纯化。纯化步骤可以使用亲和层析、离心、电泳等方法。通过这些步骤，可以得到高纯度的GFP。 4. GFP的表达 将纯化后的GFP溶液加入到感兴趣的细胞中，使其表达GFP。可以通过转染、转化等方法将GFP引入到细胞中。在细胞培养的过程中，
可以观察到GFP表达的情况。 5. 荧光显微镜观察 使用荧光显微镜观察GFP在细胞中的分布情况。荧光显微镜可以通过激发光源激发GFP发出的绿色荧光，并通过镜头观察到荧光现象。可以通过调节显微镜的对焦、放大倍数等参数来观察GFP的细节。 6. 数据分析 观察到GFP的荧光后，可以进行数据分析。可以计算GFP的表达量、观察GFP在细胞中的定位、动力学等。通过数据分析，可以得到关于GFP在细胞中的信息。 7. 应用 GFP广泛应用于生物学研究中。例如，在细胞生物学中，可以利用GFP标记蛋白质、细胞器等，观察它们在细胞中的动态变化；在遗传学研究中，可以利用GFP标记基因，观察其在不同组织中的表达情况。 总结： GFP实验的步骤包括GFP基因的克隆、细胞培养、GFP的纯化、GFP的表达、荧光显微镜观察、数据分析和应用。通过这些步骤，可以获得GFP在生物体内的相关信息，为生物学研究提供重要的实验手段。GFP作为一种荧光标记物质，在生物学研究中具有广泛的应用前景。
绿色荧光蛋白（EGFP）的基因克隆 南方医科大学学院 摘要 本实验旨在学习基因克隆并检验，绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，是常用的报道基因，便于实验。本实验通过将含有目的基因GFP的pEGFP-N1质粒和pMD18-T载体进行酶切、电泳、回收、连接、转入、筛选之后，把GFP基因成功导入到大肠杆菌DH5α(克隆菌)中，从而实现荧光蛋白基因的克隆和表达。 关键词：绿色荧光蛋白克隆表达 实验名称绿色荧光蛋白的基因克隆 实验日期2015- ~ 2015- 实验地点 合作者指导老师 评分教师签名批改日期 一、实验目的 1.学习使用限制性切酶进行DNA酶切的原理和方法。 2.学习掌握琼脂糖凝胶电泳的基本原理和操作方法。 3.掌握PCR技术原理和PCR仪的操作方法。 4.学习PCR产物的TA克隆的基本原理和操作步骤。
5.了解和掌握大肠杆菌的制备方法的基本原理和操作要点以及DNA转化大肠杆菌的原理和 方法。 6.掌握双酶切法鉴定重组DNA的基本原理和操作步骤，以及菌落PCR鉴定重组DNA的基本 原理和方法。 7.掌握IPTG诱导GFP基因表达的基本原理和操作步骤 二、实验原理 1.pEGFP-N1质粒 2.T载体
三、材料与方法： 1.实验材料： 质粒：pEGFP-N1 T载体：pUCm-T 菌种：DH5(克隆菌) PCR引物： F——GGCATATGGTGAGCAAGGGCGA R——CGGGATCCCTTGTACAGCTCGTC Tm=56 实验试剂： 即用型蓝白T载体（pMD18-T vector cloning kit）快速DNA连接试剂盒 限制性切酶：EcoR I（Fermentas） Axygen质粒提取试剂盒
分子生物学实验设计报告 绿色荧光蛋白的克隆表达 ——闵霞（2013141241165）李彩云（2013141241095） 一、引言 基因标记技术是近年来发展起来的分子生物学技术。荧光蛋白基因在标记基因方面由于具有独特的优点而广受科学家们的关注。荧光蛋白是海洋生物体内的一类发光蛋白，分为绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白。 绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP发射绿色荧光。它产生荧光无需底物或辅因子，发色团是其蛋白质一级序列固有的。 基因克隆技术包括把来自不同物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组DNA，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。采用重组DNA技术，将不同来源的DNA分子在体外进行特异性切割，重新连接，组装成一个新的杂合DNA 分子。在此基础上，这个杂合分子能够在一定的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子。 本次实验中，分子克隆质粒载体所携带的外源基因是EGFP绿色荧光蛋白，实验的最终目的是将EGFP基因插入表达载体pET-28a中，组成重组子，并导入到大肠杆菌细胞中并诱导其表达，培养出绿色的大肠杆菌菌落。为此，我们要利用碱变性法将大肠杆菌中的质粒DNA提取出来，并通过Bam HI和NotⅠ两种酶的双酶切作用，从而获得目的外源基因片段EGFP和表达载体pET-28a质粒的DNA，然后通过连接酶连接后形成重组子，并通过氯化钙法导入大肠杆菌感受态细胞中，让其在含有Amp和IPTG的LB琼脂平板上生长繁殖，最后通过观察大肠杆菌能否在含有Amp和IPTG的LB平板上长出绿色的菌落，来判断EGFP基因工程菌的构建效果 二、主要路线： 1、质粒DNA的提取 2、琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA 3、酶切连接重组质粒 4、重组质粒的扩增 5、菌落PCR法鉴定阳性克隆 6、目的荧光蛋白基因的表达 1、质粒DNA的提取 实验原理： 1）质粒是一种染色体外的遗传因子，大小在1kb~200kb之间，是具有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制能力，，能使子代保持他们恒定的复制数，可表达它携带的遗传信息。它可以独立游离于细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主细胞就不能复制，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞
基因克隆和表达的实验设计 实验目的研究绿色荧光蛋白（Greed Fluorescent Protein，GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达。 实验方法；通过分别将0M-5a（pEGFP-N3）和0M-5a（pET-28a）提取质粒、酶切并连接形成重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入0M-5a感受态细胞中进行转化，通过限制性核酸内切酶Not l与Bam H1和PCR对所建质粒进行分析鉴定后，通过转化的方法把含绿色荧光蛋白（GFP）外源基因转入大肠杆菌体Bl-2/内进行表达，再用IPTG诱导GFP 基因表达，如果可以看到显现绿色，判断GFP基因在大肠杆菌中成功表达。 材料与方法： 实验材料 克隆菌0W-5a、表达菌6l-21为本实验室收藏菌种，质粒pET-28a 和pEGFP-N3，引物，限制性内切酶Bam H 1、Not I仪器设备 Eppendof 离心机、电泳仪、电子天平、台式离心机、控温磁力搅拌器、调温电热套pH计、冰箱、台式冷冻恒温振荡器、紫外灯、生物洁净工作台、电热恒温水温箱、琼脂糖凝胶电泳电泳装置、凝胶成像分析系统、酒精灯、培养皿、、移液枪、枪头、接种环、酒精棉球、灭菌枪头、平板
封口膜、离心管。 实验原理 生物的大部分或几乎全部DNA都集中在细胞核或类核中。DNA在体内通常都与蛋白质结合，蛋白质对DWA制品的污染常影响到以后的DWA操作过程，因此需把蛋白质除去，一般采用酚氯仿抽提法。苯酚、氟仿对蛋白质有极强的变性作用，而对DNA无影响。经苯酚、氟仿抽提后，蛋白质变性而被离心沉降到酚相与水相的界面，DNA则留在水相，少量的或与DNA紧密结合的蛋白质可用蛋白酶予以去除。DNA制品中少量的RNA无影响，必要时可加入不含DNase的RNase 去除RNA污染。 实验步骤 1、100ml细菌过夜培养液，5000rpm离心10分钟，去上清液。 2、加TE悬浮沉淀，并加10%S0S，50ul20mg/ml（或1mg干粉）蛋白酶K，混匀，37℃保温1小时。 3、加5mol/L Nacl，混匀。 4、加CTAB/NaCI溶液，混匀，65℃保温20分钟。 5、用等体积酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）抽提，5000rpm离心10分钟，将上清液移至干净离心管。 6、用等体积氯仿：异戊醇（24：1）抽提，取上清液移至干净管中。 7、加1/10体积3mol/LNaAc，及
发绿光的细菌获得实验设计 小组成员：樊鑫2013141241103 李晓丽2013141241148 注：周五单周实验 前言: 绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。 EGFP （Enhanced GFP)即增强型绿色荧光蛋白，它的27k Da的单体由238个氨基酸构成，本身就是一个生物发光系统，附带有激发后能发射生物荧光的发光色基。其发光过程不同于其它生物发光组织，是不需荧光素酶参与的。在紫外光激发下可发绿色荧光，常用作信号蛋白或报告基因。 载体(Vector)：要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，转化到细胞中去外源基因进入受体进行繁殖和表达，需要运载工具，携带细胞的这种工具就叫载体。pEGFP-N3质粒是一个用于在哺乳动物细胞系中表达EGFP融合蛋白的质粒，它编码了EGFP蛋白，是野生型绿色荧光蛋白（wtGFP）经技术改造而成的遗传突变体。pET原核表达质粒是最有效的原核表达系统之一。目的基因被克隆到pET质粒载体上，受噬菌体T7强转录及翻译信号控制；表达由宿主细胞提供的T7RNA聚合酶诱导。宿主菌带有受lacUV5控制的T7RNA聚合酶基因，可以通过IPTG来启动表达。充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几小时，目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50％以上。 本实验将目的基因与EGFP基因插入载体重组表达，形成融合蛋白，在细菌中表达，通过荧光显微镜、共聚焦显微镜或紫外灯观察，可直接在活细胞中检测其荧光信号，简易方便地定性检测目的基因的表达，以及进一步研究目的蛋白的定位与动态过程。 1、总实验流程 ⑴准备实验所需试剂和器材 ⑵pEGFP-N3和pET-28a质粒的提取与检测（实验一） ⑶pEGFP-N3和pET-28a质粒双酶切及连接反应（配制LB固体培养基平板（含Kana抗生 素40μg/ml）,每个人5个平板）（实验二） ⑷pET-28a-GFP重组质粒转入DH5α扩增，菌落PCR鉴定阳性克隆（实验三） ⑸提取重组质粒转入BL21中诱导表达绿色荧光蛋白（实验四） 2、试剂配制量 LB培养液（100ml），五瓶 (胰蛋白胨)：10g/L Yeast Extract(酵母提取物)：5g/L NaCl(氯化钠)：10g /L 若配置固体培养基，则再加入15g Agar(琼脂粉)。 质粒提取溶液I , II , III，各100ml 溶液I：50 mM葡萄糖、25 mM Tris-Cl 、10 mM EDTA，pH 8.0； 溶液II：0.2 M NaOH、1% SDS； 溶液III ：3 M 醋酸钾、2 M 醋酸 1xTAE电泳缓冲液（1L） 称量Tris 4.84g于1L烧杯中；向烧杯中加入约800ml去离子水，充分搅拌均匀；加入0.5M EDTA 2ml ,冰乙酸1.142ml，充分溶解；加去离子水定容至1L后，室温保存。
石河子大学 分子生物学实验结课论文绿色荧光蛋白（GFP）原核表达分析 学生姓名 学号 专业 年级、班级 指导教师 所在学院 中国·新疆·石河子 2016年1月 绿色荧光蛋白（GFP)原核表达分析
摘要：本实验主要探讨目的蛋白(GFP）在大肠杆菌中的表达的情况以及鉴定目的蛋白形成的是包涵体还是可溶性蛋白。本实验先对菌液进行培养、活化、然后采用IPTG分别对其不同时间点的诱导，用SDS-PAGE来确定目的蛋白的可溶性及其分子量，掌握GFP 诱导不同时间的表达情况的检测方法。 关键词：绿色荧光蛋白；SDS—PAGE;原核表达 1 前言 1.1实验目的 掌握聚合酶链式反应（PCR)的原理和操作方法；了解重组载体的构建方法; 锻炼学生查阅文献资料、设计与优化实验的能力；加强学生对化学生物学中常用研究方法的认知。 1.2实验背景 绿色荧光蛋白（green fluorescent protein GFP) 是源于多管水母属等海洋无脊椎动物的发光蛋白,其在蓝光或紫外光下可发出明亮的绿色荧光,可以作为报告基因检测蛋白的特异性表达或进行细胞定位研究。与以往lacZ、CAT 等报告基因相比，有很多无可比拟的优越性: GFP 不具有种属依赖性,在多种原核和真核生物细胞中都表达；荧光强度高，稳定性高;不需要反应底物与其他辅助因子，受蓝光激发产生绿色荧光，尤其适用于体内的即时检测；另外GFP 分子量小,易于融合，适用于多种转化方式，对受体无毒害，安全可靠；并且通过替换一些特殊氨基酸，可以使之产生不同颜色的光,从而适应不同的研究需要.正是由于GFP 检测具有高灵敏度,操作简单，无需使用同位素等优点，近年来广泛用于基因的表达与调控、蛋白质的定位、转移以及相互作用、信号传递、转染与转化，以及细胞的分离与纯化等研究领域.绿色荧光蛋白还在监测目的基因表达、研究细胞内物质代谢及追踪细胞系的分化等方面有着广泛应用.采用GFP作为标记基因，可直接收集转化细胞供实验,缩短了筛选时间、减少对细胞活性的影响并可作为活体标记,为研究发育的基因调控和分子机制提供了一种简洁有效的手段.同时也正因为其荧光反应不是酶反应，所以当细胞本身还存在一些可以受蓝光激发和产生绿色荧光的物质,或者GFP表达频率不高的情况下，GFP的检测可能会产生一些假相，不易对荧光进行定量的测定。我们利用基因工程手段在大肠杆菌中高效的表达了GFP，制备出GFP抗体，利用抗原与抗体之间的特异性，在体外对GFP进行检测,可在一定程度上弥补上述GFP检测中可能出现的问题，可以作为一种重要的辅助手段用以提高GFP检测的灵敏度和准确度。 原核表达是将克隆基因插入合适载体后导入大肠杆菌，用于表达大量蛋白质的方法。选用原核表达系统的原因是易于生长和控制、用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞培养的材料昂贵、有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种
学号：班级：姓名： 《生物化学与生物分子学实验》——分子生物学设计性实验开题报告 实验课题:绿色荧光蛋白的基因克隆及表达 指导老师: 作者姓名: 所在院系： 小组编号： 小组成员: 完成时间： 成都医学院 Cheng Du Medical College
题目：绿色荧光蛋白（GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达 立题依据： 随着分子生物学和基因工程技术的迅速发展和广泛应用，人们根据自己的意愿有目的、有计划、有根据、有预见地将外源基因导入动物细胞内, 使外源基因进行表达、阐明基因表达的调控机理或者通过与染色体基因组进行稳定整合,将生物性状传递给子代动物的研究方兴未艾[1]. 1.选材：大肠杆菌 大肠杆菌是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌，它不仅具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖快、成本低廉、可以快速大规模地生产目的蛋白等优点.而且其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统,表达的目的蛋白量甚至能超过细菌中蛋白量的30 ％，因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统。 2.基因标记技术 基因标记技术是近年来发展起来的分子生物学技术。荧光蛋白基因在标记基因方面由于具有独特的优点而引起了科学家的广泛关注，现已被普遍应用到分子生物学研究的各个方面。荧光蛋白是海洋生物体内的一类发光蛋白,分为绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白［2］. 3。绿色荧光蛋白 从水母（Aequorea victoria)体内发现的发光蛋白。分子质量为 26kDa，由238个氨基酸构成,第65～67位氨基酸(Ser-Tyr—Gly）形成发光团，是主要发光的位置。其发光团的形成不具物种专一性，发出荧光稳定,且不需依赖任何辅因子或其他基质而发光.绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，是常用的报道基因.
绿色荧光蛋白（EGFP）克隆并在大肠杆菌表达 详细项目实施计划书 生物技术1001班
①EGFP基因完整的序列: ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTA AACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAG TTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTG CAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGC TACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTC GAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTG GGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGC ATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAG CAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCC CTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATC ACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTA ②PCR引物 引物序列（5’-3’）酶切位点描述 Pl GAC GGATCC ATGGTGAGCAAGGGCGAGGABamHI5’GFP gene P2GCC GAATTC TTACTTGTACAGCTCGTCCATG EcoR I 3’GFP gene