学士学位论文文献综述题目绿色荧光蛋白的应用及发展前景
姓名周紫嫣学号
专业生物工程
指导教师周小萍职
称教师
中国·武汉二○一二年四月
目录
摘要······················································································ II 关键词 ···················································································· II Abstract ··················································································· II Key words ················································································ II
1 GPF的发现 (1)
2 GFP的结构及发光原理 (1)
2.1 GFP的结构 (1)
2.2 GFP的发光原理 (2)
3 GFP在生物技术中的应用 (2)
3.1 GFP作为报告基因 (2)
3.2 GFP用于研究病毒与宿主的关系 (3)
3.3 GFP用于药物筛选 (3)
3.4 GFP作为生物传感器 (3)
3.5 GFP用于融合抗体 (4)
3.6 GFP用于计算细胞生长速度 (4)
3.7 GFP用于基因表达调控 (4)
4 GFP存在问题及发展前景 (4)
参考文献 (5)
致谢 (5)
绿色荧光蛋白的应用及发展前景
摘要
绿色荧光蛋白(GFP）是一种由水母（Aequorea Victoria）体内发现的发光蛋白。分子质量为26kDa，由238个氨基酸构成，第65～67位氨基酸(Ser-Tyr-Gly)形成发光团，是主要发光的位置。其发光团的形成不具物种专一性，发出荧光稳定，且不需依赖任何辅因子或其他基质而发光。绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，是常用的报道基因。本文综述了绿色荧光蛋白的发现过程，基本性质，应用及其发展前景。
关键词
绿色荧光蛋白；报告基因；药物筛选；融合抗体
Green fluorescent protein application and development prospect
Abstract
Green fluorescent protein (GFP) is a kind of the jellyfish (Aequorea Victoria) found in the body of the luminous protein. Molecular quality as kDa 26, with 238 amino acids, 65 ~ 67 of amino acid (Ser-Tyr-Gly) form shine group, is mainly the position of the light. The light the formation of the group has no species specificity, a fluorescent stability, and does not need to rely on any auxiliary factors or other matrix and shine. Green fluorescent protein gene into the host cell is stable, for most of the host physiology no effect, the report is a common gene. This paper reviewed the green fluorescent protein discovery process, basic properties, application and development prospect.
Key words
Green fluorescent protein；Report gene；Drug screening；Fusion antibody
1 GPF的发现
2008年的诺贝尔化学奖授予从事有关:“绿色荧光蛋白( GFP) 的发现,表达和发展”并取得重要成就的三位科学家：日本科学家下村修（Osamu Shimomura）；美国科学家马丁·沙尔菲（Martin Chalfie）和美籍华裔科学家钱永健（Roger Y. Tsien）。绿色荧光蛋白( GFP) 是一种在维多利亚多管水母体内所发现的蛋白质。是在1962年由下村修等科学家发现。而水母所发出的绿色荧光,并非由GFP发出,它是因照相中所使用闪光的反射所致。
2 GFP的结构及发光原理
2.1 GFP的结构
由维多利亚多管水母中发现的GFP是一种化学性能稳定的小分子蛋白质，由238个氨基酸残基组成。在蓝色波长范围的光线激发下，发出绿色萤光。GFP的原初结构式通过氨基酸残基65-67(Ser-Tyr-Gly)而生成的荧光发色团(Cody et al，1993)。在GFP的65-67(Ser-Tyr-Gly)可自发的形成一种P-羟基亚苄基咪唑酮的荧光发色团（如图1所示）。
图1 发色团
GFP的晶体结构是11个β-折叠组成的β-桶状结构组成的二聚体，在桶中央有一个α-螺旋。β-
桶状结构直径约3nm，高约4nm。β-折叠彼此紧密结合，像桶板一样形成桶状结构的外围，并且形成了一个规则的氢键带（如图2所示）。桶状结构和位于其末端的短α-螺旋以及环状结构一起组成一个单独的致密结构域，没有可供扩散的配体进入缝隙。这种坚实的结构保证了其稳定和抗热、抗变性的特点（Yang F et al，1996）。蛋白的一级结构大部分用来形成β-折叠和α-螺旋。蛋白质原初结构中,很大一部分用于构筑β-管道，以及线状的α-螺旋体。在能保持GFP荧光发射的条件下，从GFP的N2端和C2端可以除去的N2端残基和C2端的残基(总数达230～238) 是无序的（吴世康，2008）。
图二 GFP的晶体结构
2.2 GFP的发光原理
GFP的激发光谱在400nm处有一主要激发峰，在470nm处有一次要激发峰，发射光谱在505nm处有一尖锐的主要发射峰，在540nm处有一肩峰。这一结果是于1998 年,由Tsien所测得。
GFP的性质和发射光谱的稳定性与其生色团结构的稳定性紧紧相关。GFP表达后折叠，在氧存在的条件下，使得66位氨基酸残基的α，β键间脱氢。由65～67位的氨基酸残基(Ser-Tyr-Gly)环化成稳定的对羟基苯咪唑啉酮(4-P-hydroxybene-5-imidazolinone)，形成生色团（吴沛桥等，2009）。GFP 的生色基团是蛋白质自身催化环化的结果，环化是一个有氧过程，在严格厌氧条件下GFP不能形成荧光，因为GFP的生色团形成需要氧使Tyr66脱氢氧化。生色基团通过Tyr66的脱质子(酚盐)和质子化状态(羟酚基)的转换决定荧光发射（徐飞虎和龚兴国，2002）。
3 GFP在生物技术中的应用
3.1 GFP作为报告基因
报告基因是一种编码可被检测的蛋白质或酶的DNA，如荧光素酶(LUX)基因和β-葡萄糖苷酶(GUS)基因。GFP作为基因报告可用来检测转基因效率，把GFP基因连接到目的基因的启动子之后，通过测定GFP的荧光强度就可以对该基因的表达水平进行检测（吴沛桥等，2009）。
常用的质粒克隆载体的报告基因如LacZ ,是利用酶促催化反应,需要加入外源底物和诱导物(如IPTG,X-gal) ,不仅操作繁琐且价格昂贵。现已构建了以GFP S65 T 基因作为筛选标记的新型克隆载体,建立了以绿白斑筛选法筛选阳性重组子的新方法（孙德惠等，2006；范学政等，2005）,替代LacZ 蓝白斑筛选,不需X-gal ,经济简单可行。
作为一种新的报告基因，GFP在生物学研究中得到广泛的应用。利用绿色荧光蛋白独特的发光机原理，可将GFP作为蛋白质标签，利用DNA重组技术将目的基因与GFP基因构成融合基因，转染合适的细胞进行表达，然后借助荧光显微镜便可对标记的蛋白质进行细胞内活体观察。由于GFP相对较小，所以将其和其他蛋白融合不会影响自身发光。1996年，Ehrdardt等人首次报道利用GFP研究细胞分化蛋白FtsZ的定位。研究显示FtsZ在细胞分裂位点形成一个环状物，并且至少有9种蛋白在细胞分裂中起到重要作用，虽然对这些蛋白功能并不是很清楚，但是利用GFP已经搞清楚他们聚合的顺序及蛋白定位中的一些特征。除了用于蛋白的标记定位之外，GFP也可以大量用于细胞器的标记。
3.2 GFP用于研究病毒与宿主的关系
将病毒用GFP活体标记,可以在全真条件而不是模拟条件下实时研究病原体与宿主的系。在研究病毒与宿主关系时，如果用荧光染料标记病原菌的方法，由于病原菌的分裂，染料被稀释，长期以来未取得病原菌侵入活细胞的实时实态过程，而用放射性的核酸探针法及gus等报告基因引入病毒基因组作为报告物等方法必须在分析前对组织进行处理，这样就阻止了感染的继续进行，而GFP基因则能有效克服上述不足（杨朝辉和雷建军，2000）。
Casper将GFP基因插入TMV的基因组体外转录获得感染性RNA，然后导入烟草植株，观察发现在接入点和整个植株均可表达GFP(袁小松和沈继龙，2006)。并发现在系统感染中病毒以两种方式进行运动：一是细胞间慢的传播，伴随病毒复制的GFP表达；二是维管介导的快速运转，病毒不复制，GFP不表达（王晓丽等，2008）。Oparka将GFP编码基因置于根瘤菌组成型启动子之后，利用GFP产生的绿色荧光可清楚的观察到根瘤菌对植物的侵染过程和与之共生的情况。Barret t M等将GFP克隆于苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒的多角体启动子下游,发现感染24h后在昆虫的中肠上皮细胞和血细胞中发现绿色荧光,表明在这些组织中病毒复制表达了极晚期蛋白,随后的感染发生在整个体腔的气管细胞,
并进而发生在其他组织。
3.3 GFP用于药物筛选
许多新发展的光学分析方法已经开始利用活体细胞来进行药物筛选，这一技术能从数量众多的化合物中快速筛选出我们所需要的药物。基于细胞的荧光分析可分为三类：即根据荧光的密度变化、能量转移或荧光探针的分布来研究目标蛋白如受体、离子通道或酶的状态的变化（Jesus E G,et al,1998）。荧光探针分布式利用了信号传导中信号分子的转移功能，将荧光蛋白和信号分子相偶联，根据荧光蛋白的分布可推断信号分子的转移情况，并推断出该分子在转移中的功能。而由于GFP的相对分子量小，可活细胞内可溶对细胞毒性较小，所以常作为荧光探针。
当细胞体内风信号分子和某一特殊受体结合常常会导致配体-受体复合物从某一细胞区域转移到
另一细胞区域，这些受体常被用来做药物筛选的目标，若某一药物具有和信息分子类似的功能，那么该药物就具有潜在的医药用途。利用GFP荧光探针，容易从总舵的化合物中判断哪些具有和信号分子相似的功能，并且这种筛选过程简单方便，成本也很低。利用这个原理已成功构建一个筛选模型用于研究药物介导的糖皮质激素受体（hGR）的转移过程(Steven R K,1999)。
利用GFP来进行药物筛选由于受其必须与迁移的信号分子相偶联，其筛选容量相对较低，但是由于GFP 在细胞内的穿透性强及独特的发光机制，因而在药物筛选中具有相当大的应用潜力。
3.4 GFP作为生物传感器
绿色荧光蛋白由于其独特的光信号传导机制，以及在表达后易被周围化学环境和蛋白之间的相互作用所影响的特性，因而极适于用做活细胞体内的光学感受器。第一个基于GFP的生物感受器为钙离子感受器，由Romoser和Miyawaki几乎同时提出。原理是利用钙调蛋白结合钙离子后引起的空间构象变化导致两种GFP突变体间发生荧光共振能量转移。但是由于大多数蛋白不能像钙调蛋白那样承受较大的空间构象变化，为克服这一缺点，人们开始提出利用基因融合技术将一新的分子识别位点结合到GFP上以构建新的分子感受器。Doi和Yanagawa根据这一原理将TEM1 β-内酰胺酶 (Bla)融合到GFP上。当缺少目标分子时，GFP处于静止状态不会产生荧光。但是当目标分子β-内酰胺酶抑制蛋白(BLIP)与Bla结合后，即使GFP活化产生荧光，而这一变化很容易被检测到。将受体蛋白插入到GFP表面的技术已经成为构建分子感受器的有力工具，这种GFP感受器能被用来检测多种分子，如蛋白质、核酸、激素、药物、金属及其他的一些小分子化合物等，其潜在应用前景极为广阔。
野生型GFP和其很多突变体都具有依赖pH的荧光变化，可用来检测活细胞内的pH。称为Phluprin
可分为：比率Phluorin和盈缺Phluorin。当pH降低时，比率Phluorin的最大激发波长从395nm到475nm 迁移，利用两个最大波长处的荧光强度的比率可以测量pH；当pH值小于6时，盈缺Phluorin在475nm 处没有荧光。当pH回复到中性时，两类Phluorin都会在20 ins内复原。Hanson等[19]在2002年就设计了一系列GFP突变体deGFP，作为双波长比率测量的pH探针，用于细胞内检测。另外GFP也可用于检
测电位、氧化还原水平(J Yh R,2000)。
3.5 GFP用于融合抗体
单链抗体是基因工程抗体中研究较多的一种小分子抗体，它的优越性在于可在宿主细胞内大量表达，易于基因工程操作，尤其易于构建抗体融合蛋白。近年来有许多关于GFP融合单链抗体的研究，如程虹等报道将抗肝癌单链双功能抗体融合GFP真核表达载体并导人小鼠成纤维细胞NIH3T3表达并
获得成功(程虹等，2001)。因为融合抗体具有与抗原结合及发射荧光这两种特性，所以这种人工分子可以用做免疫染色的检测试剂，直接应用在流式细胞仪和免疫荧光的标记及肿瘤检测等。
由于技术原因，一般融合抗体均置于原核表达系统中。为了便于表达蛋白的分离纯化，一般在单链抗体的N端或C端插入-6×His序列，便于用Ni—NTA亲和层析柱纯化目标蛋白。但是由于抗体分子内存在二硫键，而在原核表达系统内由于抗体不能正确折叠，容易形成包涵体，表达出来的目标蛋白无活性，需要在氧化还原体系中进行复性。近来也有报道在动物细胞细胞质中成功表达出具有抗原结合活性的单链抗体(Mhashilkar A M，et al,1995)。若能成功解决融合抗体的表达问题，则在免疫染色及肿瘤检测这一领域融合抗体将扮演极为重要的角色。
3.6 GFP用于计算细胞生长速度
在高水平组合型表达GFP的细胞品系中，在细胞生长对数期，GFP所发出的荧光信号与细胞的数量密切相关。测量的任何荧光强度都可相应的转变成细胞浓度。尽管在细胞生长后期，用荧光信号计算得到的细胞数略低于培养物中的实际数目。但是在常用的台盼蓝计数法中，这个误差是允许的(何海建和陈婷飞，2008)。
3.7 GFP用于基因表达调控
Clontech公司构建了一种叫启动子报告载体(Promoter reporter vector) 即是一个没有启动子的GFP质粒, 专门用来测试各种启动子对GFP表达的效率, 以及某些增强子对GFP 表达的调控效果。发现用玉米C4PPDK 基因5' 端的非翻译片段(5'VTR)与花椰菜花叶病毒的35S 启动子连接, GFP在玉米原生质体中的表达效率比对照质粒(只有35S 启动子)提高近15倍，因为5'VTR 片段中含转录增强子。用拟南芥菜热休克(Heat- shock)基因启动子构建GFP表达载体, 用以转化玉米原生质体。发现42℃热激处理中50%原生质体表达GFP 荧光, 37℃处理的荧光较弱, 而常温下培养, 则完全观察不到原
生质体中的GFP荧光（薛启汉，1999）。
4 GFP存在问题及发展前景
由于荧光蛋白自身发射荧光的特性，发光不需要其他协助因子，荧光生色团对热、pH、化学变性剂稳定，且具有比较强的抗光漂白性质。使得GFP在生物学的众多研究领域中有着广泛的应用，但是也存在着一些不足。如检测灵敏度有待提高且其荧光信号强度方面的非线性性质使定量困难；紫外激发对某些GFP有光漂白的光破坏作用，导致荧光信号快速丧失；多数生物具有微弱的自身发光现象，影响某些GFP的检测；新生GFP通过折叠加工成为具有活性的形态，过程十分缓慢等。
考虑上述问题，GFP要在各领域得到更加全面的应用，还需要几个条件：基础理论体系的成熟完善、新型优良突变体的诞生以及与各种现代生物技术的融合。与此同时，随着基因工程技术和细胞工程技术的日益成熟，我们相信，GFP一定会给我们带来更多的应用价值。
参考文献
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致谢
历时近一个月的时间终于将这篇论文完成，在写论文的过程中遇到的困难和障碍，都在同学和老师的帮助下度过了。尤其要感谢我的论文指导老师，她对我进行了无私的指导和帮助，不厌其烦的帮助进行论文的修改和改进。在此向帮助和指导过我的各位老师表示最衷心的感谢！感谢这篇论文所涉及到的各位学者。本文引用了数位学者的研究文献，如果没有各位学者的研究成果的帮助和启发，我很难完成本篇论文。感谢我的同学和朋友，在我写论文的过程中给予我了很多相关素材，还在论文的撰写和排版过程中提供热情的帮助。由于我的学术水平有限，所写论文难免有不足之处，恳请各位老师和学友批评和指正！
绿色荧光蛋白GFP的研究与应用 摘要：绿色荧光蛋白（GFP）是一种极具潜力的标记物，有着广泛的应用前景。通过阅读吴沛桥的《绿色荧光蛋白GFP的研究进展及应用》这篇文献，对GFP有了进一步了解。 关键词：绿色荧光蛋白（GFP）；性质；原理；应用 1 引言 发光是海洋无脊椎动物中普遍存在的现象，一些腔肠动物包括水母、水螅和珊瑚等受到机械性干扰时都可发射绿色荧光，而栉水母类发射蓝色荧光。绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于这些腔肠动物体内的生物发光蛋白。1962 年,Shimomura 等从维多利亚多管水母（Aequoria victoria）中分离纯化生物发光蛋白质——水母蛋白, 并观察到一个在紫外光下发出“非常明亮, 浅绿色荧光”的副产物。1974 年,Shimomura等纯化得到了这种自发荧光的蛋白（即GFP）。 2008年10月8日，瑞典皇家科学院诺贝尔奖委员会将2008年度诺贝尔化学奖授予日裔美国科学家下村修（Osamu Shimomura）、美国科学家马丁·查尔非(Mratin Chalfie)以及美国华裔科学家钱永健(Rorge Y.Tsien)，他们三人因为在绿色荧光蛋白的发现以及改造方面做出了突出成就。 2 GFP的理化性质 从水母体内分离到的GFP基因，长达2.6kD，由3个外显子组成，分别编码69、98和71个氨基酸。GFP本身是一种酸性，球状，可溶性天然荧光蛋白。 GFP性质极其稳定，耐高温，甲醛固定和石蜡包埋不影响其荧光性质。其变性需在90℃或pH<4.0或pH>12.0的条件下用6mol/L盐酸胍处理，一旦恢复中性环境或去除变性剂，虽然变性的蛋白质并不能完全复性，但是复性蛋白质同天然蛋白质对温度、pH变化的耐受性、抗胰蛋白酶消解的能力是相同的。更重要的是，它们在pH7.0~pH12.2的范围内的吸收、发射光谱也是相同的。 3 GFP的荧光原理
绿色荧光蛋白及其在细胞生物学研究中的应用近几十年来，绿色荧光蛋白（GFP）被广泛用于生物学的研究， 特别是在细胞生物学领域，它在基因表达分析、膜蛋白研究，以及定位和追踪细胞外状态变化等方面提供了有力的工具。绿色荧光蛋白最初是从拟南芥中分离出来的，它是一种可以在生物细胞中发出可见的绿光的蛋白质。GFP可以与其他蛋白质结合在一起，可以用来检测特定蛋白质的表达和定位。利用绿色荧光蛋白的特性，我们可以实现转基因技术的可视化，同时实现基因的定位，这使得细胞的动态变化以及基因调控可以被直观定量地观察出来。 在GFP的研究过程中，科学家发现GFP本身也有可以改进的特性，不仅可以让它发出绿色的光，也可以被用来实现转基因技术的可视化。它的发光强度与温度变化和环境改变有关，当温度提升或温度较高时，GFP的发光强度会增强。GFP还可以用来检测特定的一种或多种蛋白质，能够实现精确的蛋白质定位。同时，研究人员还发现GFP的表达能力可以被亚细胞定位，发现细胞内部基因表达的动态变化。 GFP也被用于膜蛋白研究，可以很好地实现膜蛋白在细胞表面的定位，从而有助于我们更好地分析膜结构和功能，为细胞生物学研究带来新的视角。此外，GFP还可以被用于探索和分析细胞外状态变化，它能够通过显示细胞的迁移、聚类、分离等状态变化来揭示细胞的行为和表型特征，成功地帮助了许多细胞生物学研究。 绿色荧光蛋白是一种重要的细胞生物学研究工具，它的出现使得细胞的研究变得更加容易，提高了生物学研究的效率。它不仅可以被
用于基因表达分析和定位，也可以用于膜蛋白研究，使我们更好地了解细胞的行为和表型特征，实现细胞外状态变化的追踪，进而发现基因调控的模式，目前，GFP的技术已经成为细胞生物学研究技术的重要组成部分，将为未来更多的细胞生物学研究带来更多的帮助。 综上所述，GFP在细胞生物学研究中具有重要的意义，它提供了一种强大的分析工具，可以实现基因表达分析、膜蛋白研究和细胞外状态变化的定量观察。它高效地帮助我们探究更多基因调控机制，这在提高科学研究水平方面发挥了重要作用。未来，GFP技术将促进更多功能性细胞研究，以便开发出更多的细胞生物学研究工具，为更多的医学发展带来更多的便利。
发光细菌GFP的表达机理及应用 发光细菌GFP是绿色荧光蛋白的简称，是由Aequorea victoria这种水母所产生 的一种蛋白质。GFP不但具有高度的应用价值，而且还是生物学研究中最有用的 分子标记之一。本文将从发光细菌GFP的表达机理、应用以及未来发展等方面进 行介绍。 一、发光细菌GFP的表达机理 GFP是一种由238个氨基酸组成的蛋白质，主要在海水深处生活的Aequorea victoria珊瑚中产生。GFP通过吸收紫外线光激发，产生荧光。GFP能在任何类型 的生物组织内发光，不会产生有害影响。除了绿色之外，GFP还能产生黄色、蓝色、紫色、红色等颜色的荧光。这些颜色的荧光由不同种类的GFP进行表达，这 些不同种类的GFP都具有不同的结构和光学特性。 GFP的结构包含一个由11肽段组成的β桶状结构和一个由α螺旋段组成的关 键性结构域。通过对这个结构域的分子工程改造，研究人员可以对GFP进行改造，使其在其他物种内表达并发光。 二、发光细菌GFP的应用 GFP已成为生物医学领域的热门研究课题。由于GFP可以与其他蛋白质相结合，并且不会对细胞造成任何影响，能够用于实现对生物系统的准确研究。GFP 可以制作成质粒，通过质粒转染等方法，将其导入到需要研究的细胞内。利用 GFP可准确观察到细胞内各种蛋白质分子的定位和表达等情况。 1、生物病理学：GFP在生物病理学领域已经有了广泛的应用。与其他标记方 法相比，GFP标记具有许多优势。第一，当有多种标记时，GFP在背景噪音中更 易于辨认；第二，直接观察细胞在活体状态下的各种功能，例如细胞的表面形态、细胞器的运动等。
2、分子生物学：GFP已经成为分子生物学中最重要的分子标记技术之一。通 过观察GFP标记蛋白分子的表达、定位和交互关系，有助于更好地理解生物化学 反应。利用GFP标记，研究人员可以更好地分离和分析蛋白质、DNA和RNA， 进一步深入研究生物化学反应。 3、神经科学：大多数神经科学家利用GFP生物标记技术，将化学物质或电压 灵敏的通道与GFP合并。这样，研究人员可以把GFP标记蛋白导入到神经元内， 以便在活体脑组织内准确观察神经元的分布、活性和连接情况。 三、未来发展 GFP目前已经被广泛应用于生物学领域，甚至在Nano杂志上被评为21世纪最有影响的技术之一。如今，基于GFP的发光分子逐渐发展成为多种发光性质的材料，例如长波红光的蛋白质，以及被激发而产生短波长荧光的GFP变体等。 在未来，发光细菌GFP有望被开发成为用于癌症治疗的药物。通过使用基于GFP的技术，研究人员可以更好地理解癌症细胞内发生的生化变化，有助于研发 更为精确的抗癌药物。 总之，发光细菌GFP是一项非常有价值的技术，在多个领域得到了广泛应用。基于GFP的研究将继续拓展我们对生物学及其学科中的分子生物学、细胞生物学 和神经科学的理解。
基于绿色荧光蛋白标记技术的植物细胞分化 研究 植物细胞分化是植物生长发育过程中非常重要的一环，它决定了植物的形态、结构和功能，是保证植物正常生长和发育的关键因素。绿色荧光蛋白标记技术是一种在生物体中检测或观察特定基因表达的有力工具，在植物细胞分化研究中得到了广泛的应用。本文将从绿色荧光蛋白标记技术的基础知识、应用原理、研究进展等方面综述其在植物细胞分化研究中的应用。 一、绿色荧光蛋白标记技术的基础知识 1.1 绿色荧光蛋白的发现和分离 1988年，Osamu Shimomura从蓝色发光水母中发现了绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)。随后，Martin Chalfie发现了GFP的基因序列，并且成功地将其引入小鼠、斑马鱼等模式生物细胞中，使得这些细胞发出了明亮的绿色荧光，开创了GFP应用于生物学领域的新时代。 1.2 GFP的生化特性 GFP是一种含有238个氨基酸的蛋白质，其大约490-510纳米的荧光光谱在黄绿光区域。GFP内部内嵌着一个主要负责荧光产生的色团环结构，称为荧光色团环(fluorescent chromophore)，这个环结构的形成需要一个称为四肽环化酶的酶的作用，它能够将三个氨基酸(Cys-Tyr-Gly)连接成为一个四肽。GFP的很多特性可通过改变它的核苷酸序列或蛋白质翻译后的修饰来进行调节。 二、绿色荧光蛋白标记技术在植物细胞分化研究中的应用原理 2.1 基于突变筛选的植物细胞分化标记技术
透过人工诱变或通过遗传突变等方法，可诱发部分植物基因的表达。将这些基因与GFP合并编码后在自身植物基因组进行定位分析，可以标记该细胞在植物细胞分化过程中所处的位置或时期。这种标记方法要求依赖性较高，因为研究者需要对某一个特定的基因进行变异和筛选才能得到标记，且标记区域为固定染色体某一地点。 2.2 基于转基因技术的植物细胞分化标记技术 另外一种标记细胞分化的技术，是基于转基因技术，将被研究的目标基因与GFP融合编码构建植物转基因体系，作为一个构建植物转基因体系，标记细胞分化的技术来使用。这种技术能够标记该细胞分化到那一步骤或位置，而且转基因技术相比于突变筛选技术的依赖性较低。 三、绿色荧光蛋白标记技术在植物细胞分化研究中的应用 3.1 标记植物分化组织 呈现了逐步的分裂&扩散影像，成为分析植物器官自身发育过程的有力手段。通过标记GFP，发现在叶片基部和植物生长顶端存在表皮细胞层，在根部叶芽及根尖存在扁平细胞尖顶及小突起，细胞的原形性和相邻细胞的分离情况揭示了细胞不断更新的细胞自身细胞墙发育状态。 3.2 标记植物分化器官 利用GFP，可以将发生变化的植物器官分化并做出定量分析。实验表明，根尖中各细胞繁殖状态的变化、芽侧生根和胚果中胚转化的情况均可透过绿色荧光标记识别。标记鲜花柱头或子房中花丝枝粗粘附情况，未成熟地下菜薹嵌合影像，更能发现胚乳（Endosperm）对种子发育的影响等。 3.3 标记植物分化细胞 除了标记组织和器官外，通过GFP标记植物分化细胞，也能对单个细胞分化及小团体细胞的行为有所了解。在根尖的细胞分化研究的过程中，单细胞器官化分
学士学位论文文献综述题目绿色荧光蛋白的应用及发展前景 姓名周紫嫣学号 专业生物工程 指导教师周小萍职 称教师 中国·武汉二○一二年四月
目录 摘要······················································································ II 关键词 ···················································································· II Abstract ··················································································· II Key words ················································································ II 1 GPF的发现 (1) 2 GFP的结构及发光原理 (1) 2.1 GFP的结构 (1) 2.2 GFP的发光原理 (2) 3 GFP在生物技术中的应用 (2) 3.1 GFP作为报告基因 (2) 3.2 GFP用于研究病毒与宿主的关系 (3) 3.3 GFP用于药物筛选 (3) 3.4 GFP作为生物传感器 (3) 3.5 GFP用于融合抗体 (4) 3.6 GFP用于计算细胞生长速度 (4) 3.7 GFP用于基因表达调控 (4) 4 GFP存在问题及发展前景 (4) 参考文献 (5) 致谢 (5)
基于绿色荧光蛋白标记的细胞分化研究 细胞是构成生命体的基本单位，它们的分化过程一直是细胞和分子生物学领域 中研究的热点。为了更好地研究细胞的分化过程，科研人员利用绿色荧光蛋白技术，对细胞的标记、传输和分化进行了深入探究。 一、绿色荧光蛋白技术 绿色荧光蛋白是由美国科学家奥斯彭（Osamu Shimomura）、莫斯（Martin Chalfie）和范德托恩（Roger Y. Tsien）共同开发的。它是一种在紫外或蓝光激发 下能够自发辐射出绿色荧光的蛋白质。基于这种蛋白质的物理特性，科研人员可将它用于对细胞和分子进行标记。 将绿色荧光蛋白引入目标细胞或分子后，激发光对其产生的荧光会随时间变化 而改变。这一特性使绿色荧光蛋白技术成为了低入侵、非毒性、直观且有效的细胞标记技术。它已经成功应用于多个领域中，包括生化、生物物理、生物医学、农业和环境等。 二、使用绿色荧光蛋白标记的细胞分化研究 细胞分化过程是细胞发育的核心过程，与其它接近于血缘关系的细胞分化共同 构成了人体生长发育的基石。利用绿色荧光蛋白技术，科研人员能准确地观察细胞在分化过程中的形态与分子组成的变化。 绿色荧光蛋白技术能够帮助科学家们识别和跟踪某个细胞的发育过程。对于从 干细胞到分化细胞的完整路径，科研人员可以使用不同颜色的标记，疾控它们的“家族树”并分析细胞在发育期间的要素变化。 绿色荧光蛋白还被用于跟踪细胞内的运输和扩散。科研人员可以在单个受精卵 细胞内各标记分子，并跟踪其进入细胞膜等不同部位，从而了解分子在细胞内的运输情况。
基于绿色荧光蛋白技术的标记方法还能够帮助科研人员量化一些在细胞分化过 程中经历的变化。例如，简化培养环境会导致细胞器重排，细胞形态改变及基质附着的变化；而能调节信号通路的化合物可以通过细胞器结构的变化来获得。 借助绿色荧光蛋白技术，科研人员可以在细胞分化过程中更深入地探讨各种疾 病的发生机理，并帮助设计和开发新的药物治疗方案。 三、结语 基于绿色荧光蛋白标记技术的细胞分化研究为我们提供了更深入的了解细胞发 育和运作机制的可能性，其在医学、科技和基础科学等领域的应用前景广阔。同时，我们也应该注意该技术的潜在风险和应用的道德性问题，以便更好地维护科技与生态环境的平衡。
绿色荧光蛋白(GFP)标记亚细胞定位 绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP)是一种自然存在 于海洋水母Aequorea victoria中的荧光蛋白，其拥有强烈的绿 色荧光。由于其广泛应用于细胞生物学和生物化学领域，GFP 已经成为研究生物过程和信号传递的强有力工具。 GFP的结构由238个氨基酸组成，具有一个单独的蛋白质区域，称为圆柱螺旋(Beta-can)。GFP基因含有GFP编码序列，该序 列通过表达可以产生GFP蛋白质。GFP的荧光性质是由三个 氨基酸残基组成的染色体枢纽部分决定的，即丝氨酸(Tyr66)、谷氨酸(Pro68)和脯氨酸(Ala80)。 在GFP的自然状态下，并不发出荧光。但当该基因被转录和 翻译成蛋白质之后，在有氧条件下，GFP的氨基酸序列会发 生类似于玉米的光合作用过程，使得GFP的荧光激活。 在细胞生物学领域，GFP被广泛用作标记工具，以帮助研究 人员观察细胞内部的某些组分或结构。研究人员可以通过将GFP基因与目标蛋白的基因融合，使目标蛋白在表达时也表 达GFP。由于GFP的荧光性质，这样就可以通过荧光显微镜 直接观察到目标蛋白的位置和分布。 通过GFP技术，科学家们得以研究细胞核或细胞器在发育过 程中的变化，以及探索细胞活动的机制。此外，通过将GFP 基因与多个目标蛋白的基因融合，科学家们可以标记多种细胞结构，并观察它们在细胞活动过程中的相互关系和动态变化。
除了在细胞生物学领域的应用外，GFP还被广泛应用于分子 生物学、生物化学、药物筛选和基因治疗等领域。由于GFP 的高度稳定性和荧光强度，它可以作为生物化学实验中定量和定位特定蛋白质的工具。此外，GFP作为标记基因在基因治 疗研究中也发挥着重要作用，用于追踪和监测基因表达和转导的进程。 尽管GFP已经成为生物科学研究中广泛应用的工具，但也存 在一些局限性。首先，GFP的结构和功能对温度和酸碱度非 常敏感，因此在特殊环境中的应用可能受到限制。此外，GFP 的荧光信号在某些细胞或组织中可能受到强烈的自然荧光干扰，降低其检测的灵敏度。 为了克服GFP的一些局限性，科学家们一直在进行改进和优化。例如，通过对GFP进行突变，已经产生了一系列具有不 同荧光颜色的变体，如蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白等，扩展了荧光蛋白的应用范围。此外，通过结合GFP与其他技术， 如光遗传学和光学显微术，也进一步提高了荧光蛋白在细胞研究中的可用性和灵敏度。 总的来说，绿色荧光蛋白(GFP)是细胞生物学和生物化学领域 中的一种重要工具，通过其高度荧光的特性，可以帮助科学家们观察和研究细胞内的某些组分和结构。尽管GFP仍然存在 一些局限性，但通过不断的改进和优化，它在生物科学研究中的应用前景仍然广阔。随着科技的不断发展，绿色荧光蛋白(GFP)的应用也在不断地拓展。除了在细胞生物学和生物化学 研究中的应用外，GFP还被广泛应用于分子生物学、生物医
绿色荧光蛋白的应用及其最新研究进展 一、关键词： 绿色萤光蛋白、酵母双杂交系统、流式细胞仪、下修村、马丁·查尔菲、钱永健 二、背景 2008年10月8日，三位美国科学家——伍兹霍尔海洋生物学实验室（Woods Hole Marine Biological Laboratory, MBL）的Osamu Shimomura、哥伦比亚大学（Columbia University）的Martin Chalfie以及加州大学圣地亚哥分校（University of California, San Diego）的钱永健（Roger Y onchien Tsien），因在研究和发现绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）方面做出突出贡献而获得诺贝尔化学奖。 绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, GFP）最早由日裔科学家下村修于1962年在水母（Aequorea victoria ）中发现。而后马丁·查尔菲则证明了GFP在作为多种生物学现象发光遗传标记方面的应用价值。钱永健阐明了GFP发光的机制，并且发现了除绿色之外可用于标记的其它颜色。他对细胞生物学和神经生物学领域的贡献具有划时代的意义。他的多色荧光蛋白标记技术让科学家能够用不同颜色对多个蛋白和细胞进行标记，从而实现了同时对多个生物学过程进行追踪。现在，三位科学家的研究成果已经作为标记工具在生物科学中得到广泛应用。 三、GFP的主要性能 GFP在蓝色波长范围的光照激发下发出绿色荧光，其发光过程需要冷光蛋白质Aequorin 的帮助，而且，这个冷光蛋白质可与钙离子（Ca2+）相互作用。GFP的激发光谱在400nm 附近有一个主激发峰，在470nm附近有一个次激发峰。发射光谱在505nm附近有一尖锐的主发射峰，在540nm附近有一肩峰。在Aequorea victoria 中发现的野生型绿色荧光蛋白的分子量较小，由238个氨基酸残基组成，仅为27~30kDa，而编码GFP的基因序列也很短，为2.6kb。。GFP序列中的65-67位残基（Ser65-Tyr66-Gly67）可自发形成荧光发色基团——对羟基苯咪唑啉酮。GFP的晶体结构是由11个β-折叠组成的柱状结构，直径约3nm，长约4nm。柱中央有一个α-螺旋，发色基团在α-螺旋上，非常靠近柱的中心。蛋白的二级结构大部分为α-螺旋和β-折叠。GFP的化学性质相当稳定，无光漂白现象（Photobleaching），用甲醛固定和石蜡包埋亦不影响其荧光性质。在细胞生物学与分子生物学领域中，绿色荧光蛋白基因常被用作报告基因。 四、GFP的应用 1、酵母双杂交系统 原理： 将已知蛋白作为诱饵蛋白，在系统中捕获与其相互作用的蛋白质。人们可用GFP直接监测蛋白质与蛋白质的相互作用,因此GFP广泛使用于此技术。 利用两个增强型GFP（EGFP）片段重建功能，从而开发出一种新型的报告系统以应用于酵母双杂交系统。该系统在基因水平上将EGFP片段分别与诱饵蛋白及要捕获的蛋白融合，在体内共表达，从而研究蛋白与蛋白间的相互作用。与现有的酵母双杂交系统相比，EGFP系统中的诱饵、靶蛋白载体的报告基因和复制控制元件均得到了改进。在酵母中，当蛋白与蛋白发生相互作用时，分开的EGFP能够重新结合而发出荧光。EGFP报告质粒包括pNEGFP和pCEGFP。在乙醇脱氢酶1（ADH1）启动子控制下，诱饵蛋白质粒编码的EGFP
绿色荧光蛋白在生物科研中的应用与发展 绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP）是一种广泛用于生物科研的 工具蛋白，它源自于一种发光生物——海葵。GFP具有自发的荧光特性，能够发 出绿色的荧光信号，并且能够与其他蛋白质一起被观察、追踪。GFP的发现与利用，为生命科学领域带来了一场革命，被广泛应用于光遗传学、分子标记、细胞成像等多个领域。在本文中，我们将介绍GFP的应用及其在生物科研中的发展情况。 一、GFP的发现与基本原理 1992年，日本科学家下村脩祐在对海葵的研究中，发现有一种名为GFP的蛋 白质，它能够在紫外光的照射下自发发出绿色荧光。1994年，美国生物学家马丁·查尔芬（Martin Chalfie）和罗杰·钱（Roger Tsien）证实了GFP的自发荧光特性，并通过转基因技术成功将GFP导入到非常规高等生物体系中，开创了GFP的应用 前景。 GFP的发光原理与其他荧光染料不同，它并不需要诱导剂的作用或化学反应的 参与。GFP的分子结构由238个氨基酸组成，可以自行折叠成一个波浪形的结构，其中蛋白“心脏”的中心是一个色团，称为色素环（chromophore），这个环的结构 与化学状态有机会决定了GFP发射绿光荧光的特性。GFP的发光特性具有“自发、 可重复、非侵入性、可监测、可定量化、标记靶点准确”的优点，成为生物科学研 究中广泛使用的荧光标记分子。 二、GFP在光遗传学的应用 光遗传学是指应用光敏感蛋白和分子工程技术对生物活动进行精准控制和实时 监测的技术。GFP在光遗传学研究中被广泛应用，主要用于驱动离子通道、激酶 和离子泵的表达。通过对这些因子的定向表达，可以研究光敏感信号的传递、光学信息的处理和细胞感知。
GFP荧光蛋白的应用概述 前言：源于多管水母属等海洋无脊椎动物的绿色荧光蛋白(GFP)，是一种极具应用潜力的标记物，有着极其广泛的应用前景。绿色荧光蛋白的发现具有划时代的重要意义，它不仅为当代生物学研究提供了极为实用的基本研究手段，并且在此基础上改造发展和发现了一些列荧光蛋白，扩展了应用范围。现就GFP的理化性质、荧光特性、改进和应用研究进行了综述。 主要内容： 1、GFP的具体应用： 作为转基因植物和动物的筛选标记 用于定位标记 跟踪观察微生物 发育机理研究 用于细胞筛选 用于免疫学 2、GFP在生物领域的最新应用进展： 显像技术 失踪技术 报告基因 生物光学感受器 筛选技术 抗体生产 （1）显像技术 由于荧光蛋白有多种颜色，且稳定无毒，所以荧光蛋白可是的动物体内复杂的系统结构可视化。Livet等用多种不同的颜色的荧光蛋白对神经系统进行了基因标记，使得我们能够观察到大脑的集成路线图，可以直观地看到神经细以及细胞间的相互作用。另外，荧光蛋白还可用于生物发育领域，能够形象的观察生物体的器官组织结构的变化，随着发育学研究的深入，荧光蛋白必将成为强有力的工具。 （2）失踪技术 一般的荧光染料标记的微生物，由于其生长快、分裂快，染料可在短时间内被稀释，所以不能实时准确地观察微生物侵入活体动物以及细胞的过程。近年发现，荧光蛋白可用于失踪流行性病毒对活体细胞的感染，流行性病毒可被实时监控，借助这一新技术，可以更深入地研究其感染方式。Zhao等发现用GFP标记细菌，可以详细的对细菌的入侵进行时空检测，以确定细菌特异性的感染部位以及传染源的空间位移。GFP克服了一般荧光染料所带有的缺陷，GFP必将会进一步取代一般的荧光染料，有效地帮助学术研究者观察分析细菌病毒的感染方式。
绿色荧光蛋白(GFP 的特性及其在分子生物学研究中 的应用 薛启汉 (江苏省农业科学院农业生物遗传生理研究所,南京210014 薛启汉:男,56岁,大学,研究员。 本综述系联合国教科文组织生物技术合作研究项目部分内容。收稿日 期:1997212202 摘要作为1种新型、方便的活性标记,来自水母的绿色荧光蛋白(GFP 正在多种原核和真核生物研究中应用。近来研究表明,GFP 具有很多理想的特性,适合用作普遍的报告标记,尤其适合于活体细胞或组织。譬如,GFP 在细胞中表达,在蓝光或紫外光照射下可以产生明亮的绿色荧光。而且,GFP 在细胞中呈自主性表达,没有细胞或位置表达的专一性,无需外源反应底物,无需进行细胞或组织的固定和渗透处理,使表达检测很方便。由于GFP 对光漂白、氧化剂、还原剂以及其它许多化学试剂具有极强的稳定性,因此,可用来监测基因表达、信号转导、共转染、蛋白运输与定位,以及细胞系谱分类等。本文就GFP 的特性及其在分子生物学研究中的应用潜力,作一简要阐述。 关键词绿色荧光蛋白(GFP ;分子生物学中图法分类号Q 71 Character istics of the Green Fluorescen t Prote i n (GFP and Its Application i n M olecular B iology Research X U E Q ihan (Institu te of A g robiolog ica l Genetics and P hy siology ,J iang su A cad e my of A g ricu ltu ra l S ciences ,N anj ing 210014
绿色荧光蛋白在生物医学研究中的应用 绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein, GFP）是一种广泛应用于生物医学研 究中的蛋白质标记物。它最初来源于海葵（Aequorea victoria）中的一个蛋白质， 因其绿色荧光而被人们发现，并被广泛用于标记生物分子的研究中。本文将介绍绿色荧光蛋白在生物医学研究中的应用及其优缺点。 I. GFP技术在药物筛选中的应用 药物筛选是一种重要的生物医学研究手段，它通过筛选大量的化合物，找到具 有治疗作用的药物。GFP技术则可以帮助科学家在筛选过程中更加方便地观察细 胞中的药物靶点。以前的药物筛选往往需要使用化学荧光染料，这些染料的发光可能会被药物所抑制，影响筛选结果。而使用GFP标记靶点，则可以直接观察靶点 在细胞内的表达情况，无需使用化学荧光染料。此外，GFP标记靶点也使得科学 家可以在单个细胞的水平上观察相应的实验结果，增加了研究的可靠性和精度。因此，GFP技术在药物筛选中有着广泛的应用前景。 II. GFP技术在细胞成像中的应用 GFP技术在细胞成像中也有着广泛的应用。在一些研究中，科学家将GFP标 记在细胞组织或器官中的某一种蛋白质上，以追踪其在细胞中的运动情况。由于GFP具有高度的特异性和稳定性，因此可以准确的观察标记蛋白质的表达情况。 这种技术使得科学家可以观察特定细胞或组织的病理生理进程，并为疾病的提早诊断和治疗提供了可能性。 III. GFP技术在基因治疗中的应用 基因治疗是一种新兴的治疗疾病的手段，其目的是通过简单而直接的方式将治 疗的基因导入到细胞中，来治疗一些疾病。GFP技术可以帮助科学家更好的观察 基因治疗的效果。在基因治疗过程中，科学家可以使用GFP将目标基因标记出来，
绿色荧光蛋白在药物筛选中的应用随着科技的不断发展，药物研究已经被赋予了越来越重要的地位。在药物研究中，药物筛选是一项非常重要的工作。药物筛选 是指在大量的分子库中寻找具有特定生物活性的化合物的过程。 目前，药物筛选的方法有很多种，其中一种被广泛应用的方法是 绿色荧光蛋白技术。 绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein，简称GFP）是一种 能发出绿色荧光的蛋白质，在药物筛选中具有广泛的应用价值。GFP最早是从海葵中发现的，是一种带有蓝光的蛋白质，在紫外 线的作用下会发出绿色的荧光。这种绿色荧光不仅很强烈，而且 在很多种活细胞中都能够表达。因此，GFP成为了生物学界和医 学界研究生物学和药物筛选的一个重要的研究工具。 通过使用GFP技术，药物研究人员可以在药物筛选中快速、准确地找到具有生物活性的化合物。在药物筛选中，绿色荧光蛋白 通常被用作标记分子。药物研究人员使用基因工程技术将GFP基 因与其他目标基因融合在一起，形成一个新的融合蛋白质。这种 融合蛋白质中的GFP可以发出绿色的荧光，从而标记出目标蛋白。然后，将一个化合物库与这些标有GFP的融合蛋白质进行混合， 以寻找那些能够改变融合蛋白质的活性的化合物。
药物研究中使用的GFP技术的具体流程如下： 1. 选取特定的生物标志物，它能够快速、可靠地反映出药物的作用效果。 2. 将该标志物与GFP融合在一起，形成融合蛋白质。 3. 将大量的化合物混合在一起，筛选出那些能够改变融合蛋白质的活性的化合物。 4. 验证那些具有良好活性的化合物，寻找其中可用于临床治疗的药物。 通过应用GFP技术进行药物筛选，可以大大提高药物筛选的效率。因为药物研究人员可以直接观察化合物是否改变了GFP融合蛋白质的荧光强度，从而快速地确认哪些化合物具有生物活性。此外，通过使用GFP技术标记与某种疾病相关的蛋白，药物研究人员可以筛选出新的治疗该疾病的药物。
绿色荧光蛋白紫外特征峰 绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein，简称GFP）是一种在生物体内独特发光的蛋白质。它最早在细菌产生的生物体（海葵）中被发现，并被广泛应用于生物研究领域。GFP的特征峰位于紫外光谱范围内，这为科学家们提供了一种无创且高效的荧光成像工具，广泛应用于细胞生物学、分子生物学、遗传学等多个领域。 GFP的紫外特征峰是指其最大发射波长位于紫外光波段。该波段通常被定义为200至400纳米的范围。GFP的最大吸收波长位于带有大量能量的近紫外光波段，使得它对一些标准荧光探针的最大激发波长不同。这使得GFP能够与其他荧光探针相互区分，为科学家提供了更好的信号选择性。 GFP的紫外特征峰还具有优异的光稳定性和光稳定性。传统荧光染料在照射后往往会发生光漂白现象，即荧光信号会随着时间的推移而减弱。然而，GFP的特异发光性质使其在长时间观察中保持持久的稳定荧光。这一特点使得GFP能够被应用于动态跟踪生物分子的位置和活动，如细胞内蛋白质运动等。 在生物学研究中，GFP的紫外特征峰还被广泛用于基因表达的报告和监测。通过将GFP基因与感兴趣的基因进行融合，研究人员可以实现该基因在活体样本中的实时可视化。这使得我们可以直观地观察基因的表达模式和细胞的定位情况。此外，通过对GFP的改造，可以产
生具有不同颜色的荧光蛋白，如蓝色、黄色和红色，从而实现多荧光 标记的目的。 除了在实验室中的应用，GFP的紫外特征峰还具有广泛的应用前景。例如，在医学领域，研究人员正在利用GFP的发光特性开发新型的诊 断工具和治疗方法。通过将GFP与荧光标记的抗体结合，医生可以更 准确地检测和诊断患者的病情。此外，GFP还可用于光动力疗法，通过激发GFP发光，进而诱导附着GFP的癌细胞死亡。 总之，绿色荧光蛋白的紫外特征峰为科学家提供了一种强大的工具，既可以实现生物分子的实时可视化观察，也可以用于开发新型的 诊断和治疗方法。随着技术的不断进步和深入研究，相信GFP的应用 领域还将不断扩展，为科学研究和医学进步做出更大贡献。
荧光蛋白在生命科学中的应用 荧光蛋白是一种在生物体中普遍存在的分子，其特殊的荧光性质使得它在生命 科学中应用广泛。从基础研究到应用技术，荧光蛋白都扮演着不可或缺的角色。 一、荧光蛋白的发现 荧光蛋白最初是在水母中被发现的。上世纪60年代，美国科学家奥索瓦尔德（Osawa）等人从普通水母中分离出了发光的物质。经过进一步的研究，他们发现 这种物质是一种蛋白质，并具有绿色荧光。这一发现引起了生命科学界的广泛关注，并成为荧光蛋白研究的开端。 二、荧光蛋白的性质 荧光蛋白主要由氨基酸组成，其中最重要的是蛋白质的折叠结构。荧光蛋白的 核心结构是一个环状的肽链，包含环柄和环尾两个区域。环柄包含了内外摆动的苯丙氨酸（Tyr）和色氨酸（Trp）残基，而环尾则包含了荧光染色团。 荧光蛋白的最大特点是能够发出光。它的发光机理是通过吸收外界光束，激发 荧光染色团电子的激发，产生高能激发态。激发态电子回到基态，会释放出光子，产生荧光。 三、荧光蛋白的应用 荧光蛋白在生命科学中的应用有很多。下面将介绍其中的一些典型应用方式。 （一）标记生物分子 荧光蛋白可以通过分子生物学方法定向结合到各种生物分子上，如蛋白质、核 酸或脂质等。荧光标记的生物分子可以用于观察细胞活动、分子交互作用、蛋白分泌与合成等过程，以及各种生物反应、生物信号传导等方面的研究。 （二）绿色荧光蛋白
绿色荧光蛋白（GFP）是一种最常用的荧光蛋白，被广泛用于分子生物学中。GFP不仅自带荧光，而且可背离其宿主基因组，作为外源物质独立表达。因此， 将GFP结合到生物体内的特定靶点上，可以标记和追踪生命活动，对生物学研究 产生了革命性的影响。 （三）荧光共振能量转移 荧光共振能量转移（FRET）是一种非常有效的关于分子间距离和分子间作用 的技术。通过将荧光蛋白标记到生物分子上，可以测量基于FRET技术的分子交互作用，如蛋白质复合物形成和生物反应的过程等，这为分子生物学研究提供了强有力的手段。 （四）荧光细胞成像 荧光蛋白广泛用于细胞成像研究。通过对荧光蛋白基因的转染，可以实现细胞内、细胞外或细胞表面空测成像。这项技术已被广泛应用于许多领域，如疾病诊断、药物筛选、细胞信号转导、神经元成像等。 四、荧光蛋白的发展及前景 自从荧光蛋白发现以来，科学家们不断地改进和开发新的荧光蛋白品种，从最 初的绿色荧光蛋白到现在的很多种荧光蛋白，包括蓝色、红色和黄色荧光蛋白等。随着分子生物学技术的增强和计算生物学的兴起，荧光蛋白在生命科学中将拥有更广泛的应用前景。 总之，荧光蛋白的发现和应用对生命科学的发展起到了决定性的作用。荧光蛋 白标记的技术被广泛应用于细胞生物学、分子生物学、神经科学和药物研究等领域，为科学家们提供了观察和研究生命活动的新思路，助力人类探索生命的奥秘。
GFP:绿色荧光蛋白(GreenFluorescent Protein,简称GFP)是一种在美国西北海岸所盛产的水母中所发现的一种蛋白质。它之所以能够发光,是因在其包含238个氨基酸的序列中,第65至67个氨基酸(丝氨酸—酪氨酸—甘氨酸)残基,可自发地形成一种荧光发色团。 发光机理:当蛋白质链折叠时,这段被深埋在蛋白质内部的氨基酸片段,得以“亲密接触”,导致经环化形成咪唑酮,并发生脱水反应。但此时还不能发射荧光,只有当有分子氧存在的条件下,发生氧化脱氢,方能导致绿色荧光蛋白发色团的“成熟”,形成可发射荧光的形式。上述绿色荧光蛋白发色团的形成过程,系由几位科学家分别研究完成的。 绿色荧光蛋白不仅无毒,而且不需要借助其他辅酶,自身就能发光,可以让科学家在分子水平上研究活细胞的动态过程。当绿色荧光蛋白的基因和我们感兴趣的有机体内所拟研究的蛋白质基因相融合时,蛋白质既能保持其原有的活性,绿色荧光蛋白的发光能力也不受影响。 钱永健的贡献 钱永健及其合作者,还解决了绿色荧光蛋白的晶体结构问题,从而允许能够较合理地对具不同性质的变体合成进行设计。这些新变体有的荧光更强,有的呈黄色,有的呈蓝色,有的呈红色,有的可激活、可变色。这意味着除绿色以外,还可以用其他颜色荧光蛋白标示不同的蛋白质和细胞。 GFP的发光特性GFP吸收的光谱,最大峰值为395nm(紫外),并有一个峰值为470nm的副峰(蓝光);发射光谱最大峰值为509nm(绿光),并带有峰值为540nm的侧峰(Shouder). GFP的光谱特性与荧光素异硫氰酸盐(FITC)很相似,因此为荧光素FITC设计的荧光显微镜滤光片组合同样适用于GFP观察.
荧光蛋白和荧光染料在细胞成像中的应用 细胞成像在生命科学领域中扮演着越来越重要的角色。随着现代生物技术的发展，荧光蛋白和荧光染料成为了细胞成像领域的两个热门研究方向。 荧光蛋白（Fluorescent protein）是一类能够发射荧光的蛋白质。荧光蛋白自身带有荧光团，当吸收特定波长的光后，可发出特定颜色的光。最早被发现的荧光蛋白是从海葵中分离得到的绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein, GFP），由于GFP具有独特的光学性质，被广泛地应用于细胞成像领域。 荧光蛋白的应用 荧光蛋白不仅可以用于研究细胞的结构和功能，还可用于疾病诊断和治疗。荧光蛋白可以被植入到生物体内，并与目标蛋白结合。通过特定的方法，在细胞内或组织内选择性地激活荧光蛋白，这样就可以研究目标蛋白的分布、代谢和功能。在癌细胞等疾病的治疗中，荧光蛋白还可以被用于标记肿瘤细胞，辅助手术切除等治疗操作。 荧光染料的应用 相较于荧光蛋白，荧光染料可以通过直接进入细胞，标记特定的生物分子，从而达到对细胞进行成像的效果。荧光染料具有高亮度、反应快、可选择性等特点，因此被广泛地应用于细胞成像领域。例如：线粒体染色剂JC-1，可用于检测细胞内的线粒体功能；CAL-520，可用于检测细胞内钙信号的变化等。 虽然荧光染料具有明显的优势，但由于存在染色的选择性问题，因此在实际应用中仍有一定的局限性。选用合适的荧光染料可增强成像效果，同时，对于某些需要特定取向成像或观察运动的细胞结构，荧光蛋白仍然更为可取。 结论
细胞成像领域的发展促进了荧光蛋白和荧光染料的不断发展。在细胞成像中荧光蛋白具有选择性强、稳定性高等优点，在研究细胞的结构和功能、疾病治疗等方面均具有广阔的应用前景；而荧光染料由于可选择性强等优点，被广泛地应用于细胞成像领域，独具一格的成像效果赢来了科研人员的赞誉。总之，荧光蛋白和荧光染料二者各具优势，在实际应用中取长补短，将发挥细胞成像技术的更多潜能。
人工荧光蛋白的设计与应用 近些年，人工荧光蛋白越来越受到科学家们的关注，因为它们 具有广泛的应用前景。人工荧光蛋白是一种可以在生物体内表现 出荧光的蛋白质，它们被广泛用于生物检测、成像等方面，是现 代生物技术领域不可或缺的重要工具。本文将介绍人工荧光蛋白 的设计与应用。 1. 人工荧光蛋白的发展历程 人工荧光蛋白起源于天然荧光蛋白，源于19世纪首次发现的 绿色荧光蛋白，其后又出现了红色和蓝色荧光蛋白。这些天然荧 光蛋白在生物学研究中起到了重要作用，但存在一些局限，如发 光波长范围狭窄、化学稳定性等问题。随着生物技术的不断发展，人们开始将荧光蛋白作为一种工具，进行编程、改造，构建出各 式各样的人工荧光蛋白。 20世纪80年代，美国科学家Prasher首次克隆获得绿色荧光蛋 白编码序列，并发表在《生物技术》杂志上，这标志着人工荧光 蛋白的开发进入了一个新时代。之后，人们又通过遗传工程将人 工荧光蛋白引入细胞内，使它们表现出所需的特性。随着技术的
不断进步，人们设计出了许多种不同波长的人工荧光蛋白，使其能适应不同的研究需求。 2. 人工荧光蛋白的结构与工作原理 人工荧光蛋白是一种蛋白质，其构成与天然蛋白质类似，由若干氨基酸残基组成。荧光蛋白的荧光中心是一个色素团，它的组成分为环状亚硫酸盐（chromophore）和具有稳定、容纳、定位等作用的蛋白质骨架。 人工荧光蛋白中，荧光中心的环状亚硫酸盐和蛋白质骨架都可以通过改变氨基酸残基的序列而进行修改。通过在荧光中心中引入化学上的改变，荧光的波长可以发生变化，从而实现不同波长的发光。通过对荧光中心周围的氨基酸序列与立体构象的调整，可以改善蛋白质的荧光强度、荧光量子产率和稳定性，使其适应各种应用场景。 3. 人工荧光蛋白在生物技术中的应用
荧光蛋白的性质和在细胞成像中的应用 随着生物技术的不断发展，荧光蛋白在细胞成像中逐渐得到广 泛应用。荧光蛋白有许多优异的性质，如高分子量、高稳定性和 高亮度等，这些性质使得我们能够用它们来研究细胞和生物分子 的结构和功能。本文将重点介绍荧光蛋白的性质和在细胞成像中 的应用。 一、荧光蛋白的性质 荧光蛋白是一种可以在紫外线照射下发出可见光的蛋白质。它 们最初发现于一些水母和珊瑚中，从其身体中提取出的荧光蛋白 在日光下可以发出惊艳的绿色光芒。后来，在生物技术的帮助下，人们对荧光蛋白进行了深入的研究，发现它们有以下几个重要的 性质： 1. 高分子量 荧光蛋白大约由250个氨基酸残基组成，分子量为27-30kDa， 这使得它们的分子结构非常复杂。
2. 高稳定性 荧光蛋白在室温下可以长时间稳定存储，即使暴露在光线、氧气或其他环境因素之下，它们的发光强度也不会降低。这是由于荧光蛋白的二硫键和三级结构的稳定性使得其能够抵抗环境的影响。 3. 高亮度 荧光蛋白的光发射系数非常高（4-5万分之一），这使得它们可以在细胞成像中被非常敏感地检测到。这个特点使得荧光蛋白成为了一个通用且广泛应用的细胞成像标记。 二、荧光蛋白在细胞成像中的应用 荧光蛋白在细胞成像中有许多应用。我们可以通过改变荧光蛋白的表达方式，选择适合的成像技术和组织的性质来制作各种类型的成像标记。下面将分别介绍一些常见的荧光蛋白应用。 1. 荧光原位杂交
荧光原位杂交是一种检测DNA序列的技术。通过将DNA序列 与荧光蛋白结合，可以在细胞或组织中检测到DNA序列是否存在，因此，这种方法被广泛应用于生物学研究中。 2. 研究生物分子的表达和结构 荧光蛋白可以用于检测基因表达。通过将荧光蛋白与感兴趣的 基因结合，可以将其植入目标细胞或组织中。荧光蛋白会在目标 细胞或组织内表达，从而允许我们观察荧光蛋白所结合的基因表达。 荧光蛋白还可以用于标记某些生物分子的结构。通过将荧光蛋 白和感兴趣的蛋白质结合，我们可以观察蛋白质在细胞内的结构 和位置。 3. 荧光互补检测