绿色荧光蛋白紫外特征峰
绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein，简称GFP）是一种在生物体内独特发光的蛋白质。它最早在细菌产生的生物体（海葵）中被发现，并被广泛应用于生物研究领域。GFP的特征峰位于紫外光谱范围内，这为科学家们提供了一种无创且高效的荧光成像工具，广泛应用于细胞生物学、分子生物学、遗传学等多个领域。
GFP的紫外特征峰是指其最大发射波长位于紫外光波段。该波段通常被定义为200至400纳米的范围。GFP的最大吸收波长位于带有大量能量的近紫外光波段，使得它对一些标准荧光探针的最大激发波长不同。这使得GFP能够与其他荧光探针相互区分，为科学家提供了更好的信号选择性。
GFP的紫外特征峰还具有优异的光稳定性和光稳定性。传统荧光染料在照射后往往会发生光漂白现象，即荧光信号会随着时间的推移而减弱。然而，GFP的特异发光性质使其在长时间观察中保持持久的稳定荧光。这一特点使得GFP能够被应用于动态跟踪生物分子的位置和活动，如细胞内蛋白质运动等。
在生物学研究中，GFP的紫外特征峰还被广泛用于基因表达的报告和监测。通过将GFP基因与感兴趣的基因进行融合，研究人员可以实现该基因在活体样本中的实时可视化。这使得我们可以直观地观察基因的表达模式和细胞的定位情况。此外，通过对GFP的改造，可以产
生具有不同颜色的荧光蛋白，如蓝色、黄色和红色，从而实现多荧光
标记的目的。
除了在实验室中的应用，GFP的紫外特征峰还具有广泛的应用前景。例如，在医学领域，研究人员正在利用GFP的发光特性开发新型的诊
断工具和治疗方法。通过将GFP与荧光标记的抗体结合，医生可以更
准确地检测和诊断患者的病情。此外，GFP还可用于光动力疗法，通过激发GFP发光，进而诱导附着GFP的癌细胞死亡。
总之，绿色荧光蛋白的紫外特征峰为科学家提供了一种强大的工具，既可以实现生物分子的实时可视化观察，也可以用于开发新型的
诊断和治疗方法。随着技术的不断进步和深入研究，相信GFP的应用
领域还将不断扩展，为科学研究和医学进步做出更大贡献。
绿色荧光蛋白基因在大肠杆菌中的表达与检测一、背景介绍 1．绿色荧光蛋白 1955年，Davenport和Nicol 在太平洋海里的一种发光生物—维多利亚水母(Aequorea victoria)中发现并发表了荧光蛋白的生物发光现象，但是对生物发光现象的机理并不了解。1962年，日本科学家下村修在水母中纯化鉴定出了一种能催化化学发光的蛋白质分子并将其命名为aequorin，aequorin能将化学能转化为光能，从而产生出波长为470nm的蓝色光(lmax=470nm)，但是水母发出的光是独有的绿色，因此水母发光的蛋白质并非 aequorin。与此同时，发现和分离了一个受紫外线激发能发出绿色荧光的蛋白质—绿色荧光蛋白(GFP)。1971年，Morin和Hastings提出了GFP这个名称。1985到1992年间，科学家 Douglas Prasher 测定完成了aequorin 和GFP 的基因和蛋白质序列，并通过蛋白质序列分析和核磁共振分光术(NMR spectroscopy)确定了GFP发光位点。1994年，美国科学家钱永健开始改造GFP，目前所用的大多数是钱永健实验室改造后的变种，有的荧光更强，有的可激活、变色。1996年，解析得到了GFP的晶体结构，它的发光过程是也在日后的应用中得到了解答。纵观整个过程，从1961年到1974年，下村修的研究遥遥领先，却很少有人注意。在1974年以后，特别是八十年代后，绿色荧光蛋白的研究得到了广泛的重视和发展。 绿色荧光蛋白，分子质量约为28kDa，由238个氨基酸构成，第
65～67位氨基酸(Ser-Tyr-Gly)形成发光团，经共价键连接而成对羟苯甲基咪唑烷酮，它可以被光激发产生荧光，是主要发光的位置。绿色荧光蛋白分子的形状呈圆柱形，就像一个桶，发光的基团位于桶中央，因此，它可形象地比喻成一个装有色素的“油漆桶”。其发光团的形成不具有物种专一性，发出的荧光稳定，且不需要依赖其他基质而发光。 GFP的优点很多：首先，它本身稳定，不需要任何反应底物和辅助因子，且无种属限制，可在多种生物细胞中表达发出稳定荧光，在450～490nm 蓝光激发下,发光能保持 10min 以上。其次，其分子量小，对目的基因的功能无任何影响，融合蛋白具有与GFP一样的荧光性质，对细胞没有毒性。最后，GFP观察方便，利用激光扫描共聚焦显微镜，甚至普通显微镜都可以观察到活细胞内蛋白的变化、活动，用肉眼就可对辨别细胞是否表达及其表达水平。 作为一种新型的报告基因，绿色荧光蛋白在生命科学的各个领域得到广泛的应用：利用绿色荧光蛋白的特有发光机制，可将GFP作为蛋白标签。就是利用 DNA 重组技术，将目的基因与GFP基因构成融合基因，转染或转化至合适的细胞进行表达，而后借助荧光显微镜观察细胞内活体中标记的蛋白质。绿色荧光蛋白也可用于大规模药物筛选。另外，由于绿色荧光蛋白独特的光信号传导机制及其在表达后易被周围化学环境和蛋白之间的相互作用影响的特性，极适用于成为活细胞体内的光学感受器。近年来，由于融合抗体具有发射荧光和与抗原结合两种特性，所以将其用做免疫染色的检测试剂，直接用于流式
荧光蛋白—“绚丽多彩”的故事
目录 荧光蛋白—“绚丽多彩”的故事 0 摘要 (2) 关键词 (2) Abstract (2) Key words (3) 第一章荧光蛋白的发现及发展 (3) 1.1 生物发光现象与维多利亚多管发光水母 (3) 1.2绿色荧光蛋白（GFP）的发现 (4) 1.3荧光蛋白的发展 (5) 第二章绿色荧光蛋白的结构及其发光机理 (6) 2.1 绿色荧光蛋白的结构 (6) 2.2 生色团的形成机理 (8) 2.3 GFP的发光机理 (10) 第三章各类颜色荧光蛋白简介 (11) 3.1 蓝色（BFP）和蓝绿色（CFP）荧光蛋白 (11) 3.2 绿色荧光蛋白（GFP） (13) 3.3 黄色荧光蛋白（YFP） (13) 3.4 橙色荧光蛋白（OFP） (14) 3.5 红色荧光蛋白（RFP） (14) 第四章荧光蛋白的应用（以GFP为例） (15) 4.1 利用GFP的定位作用研究生命体内的各种过程 (15) 4.2 利用荧光蛋白检测基因表达水平 (15) 4.3 利用GFP良好的融合性来标记蛋白质 (16) 4.4 利用GFP基因进行杀虫剂效果的评估 (16) 4.5 利用GFP跟踪目的基因 (16) 4.6 GFP做生物传感器 (16) 4.7 GFP在免疫上的应用 (17) 第五章结束语 (17) 参考文献 (18)
摘要绿色荧光蛋白(GFP)是几十年前在水母体内发现的,它可以在蓝光或者紫外光的激发下发射绿色荧光。由于它稳定的结构和光物理性质，又易于在细胞内表达，近几年来已经作为标记物质广泛的应用在生命科学的领域。绿色荧光蛋白的出现及其广泛的应用引起了荧光蛋白的迅猛发展。通过对绿色荧光蛋白氨基酸序列的改造,现在已相继有其他颜色的荧光蛋白出现。当前荧光蛋白的进展方向主要是如何更好的改变蓝色到黄色范围内的荧光蛋白的光学性质,这些不同颜色的荧光蛋白都是绿色荧光蛋白的变异体；以及如何从有机体中得到发射橙黄到远红外颜色光的荧光蛋白,近期科学家们通过努力,已经从水母身上得到了新的得到改进的BFP、CFP、GFP、YFP变异的单分子荧光蛋白。光激活的荧光蛋白现在已成为一种强有力的探针，广泛应用于探究细胞内的动力学过程，并且也促进了超分辨率显微镜的发展。 关键词荧光蛋白光激发变异光转化光交换光稳定性活细胞成像Abstract Green fluorescent protein(GFP) was discovered many years ago from Aequorea Victoria. It can emit green light under excitation of blue UV irradiation.GFP as a maker for gene expression and localization of gene products has been widely used in life sciences for the past years because its stable structure and photophysical property and easy expression in cells. T he emergence of green fluorescent protein and its widespread application has caused the rapid development of fluorescent protein. In the recent years, scientist has find many other fluorescent proteins which can emit light of different colors by improve the amino acid sequence. Courrent fluorescent protein development strategies are focused on fine-turning the photophysical properties of blue to yellow variants derived from the Aequorea Victoria jellyfish green fluorescent protein and on the development of monomeric FPs from other organisms that emit in the yellow-orange to far-red regions of visible light spectrum. The latest efforts in jellyfish variants have vatresulted in new and improved monomeric BFP,CFP,GFP and YFP variants. Photoactivatable FPs are emerging as a powerful class of probes for intracellular dynamics and unexpectedly, as useful tools for the development of superresolution microscopy applications.
生物技术综合大实验实验报告GFP的分离与纯化 姓名： 专业班级 院系： 指导教师： 完成日期
GFP的分离与纯化 摘要： GFP，在生物领域应用广泛。本实验回顾了GFP提取纯化过程，包括细菌破碎、GFP沉淀、疏水过滤层析、透析、离子交换层析和凝胶过滤层析等步骤，来获得较纯的GFP，并运用SDS-PAGE来检测纯化效果。 关键词：GFP 应用进展层析 SDS-PAGE 绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)是一类存在于这些腔肠动物体内的生物发光蛋白。1962年Shimomura等首先从多管水母(Aequorin victoria)中分离出一种分子量为20kDa的称为Aequorin的蛋白。由于水母整体荧光及提取的蛋白质颗粒荧光都呈绿色，因此，人们将这种蛋白命名为绿色荧光蛋白。1992年Prasher 等克隆了GFP基因的cDNA，并分析了GFP的一级结构；1994年Chalfie 等首次在大肠杆菌细胞和线虫中表达了GFP，开创了GFP应用研究的先河，之后很快发现GFP能在多种异源细胞中表达，GFP在细胞学、分子生物学和医学、病毒学等领域中迅速掀起了一股热潮；1997年10月18~22日在美国New—Jersey专门召开了一次关于GFP的国际会议。1994年钱永健改造了GFP，使得GFP的荧光变强、变色。由此和Shimomura、Martin Chalfie共享了2008年诺贝尔化学。从此，荧光蛋白带来了生物技术的新革命。 GFP本身是一种酸性，球状，可溶性天然荧光蛋白，分子量约27×103，一级结构为一个由238个氨基酸残基组成的单链多肽。在395 nm具有最高光吸收峰，肩峰为473 nm；发射光谱λmax=508~509nm。 GFP性质极其稳定，易耐受高温处理，甲醛固定和石蜡包埋不影
绿色萤光蛋白(green fluorescent protein)，简称GFP，这种蛋白质最早在一种学名Aequorea victoria的水母中发现。其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。这个发光的过程中还需要冷光蛋白质Aequorin的帮助，且这个冷光蛋白质与钙离子(Ca+2)可产生交互作用。 由水母Aequorea victoria中发现的野生型绿色萤光蛋白，395nm和475nm分别是最大和次大的激发波长，它的发射波长的峰点是在509nm，在可见光绿光的范围下是较弱的位置。由海肾(sea pansy)所得的绿色萤光蛋白，仅有在498nm有一个较高的激发峰点。 在细胞生物学与分子生物学领域中，绿色萤光蛋白基因常被用作为一个报导基因(reporter gene)。一些经修饰过的型式可作为生物探针，绿色萤光蛋白基因也可以克隆到脊椎动物(例如:兔子上进行表现，并拿来映证某种假设的实验方法。 我们这边细胞组的基本上都在用这个东东。标记细胞 GFP的分子结构和发光机制 绿色荧光蛋白为一个由238个氨基酸残基组成的单链，GFP有两个吸收峰，主峰在395nm，次峰在470nm，其荧光发射峰在509nm。GFP 的化学性质相当稳定，其变性需要在90℃或pH<4或pH>12的条件下用6mollL盐酸胍处理，这一性质与GFP的结构特性相关。 Yang等的研究表明，GFP是由两个相当规则的内含一个α-螺旋和外面包围l1个β-折叠的β-桶状结构组成的二聚体，β-桶状结构直径约3nm，高约4nm。β折叠彼此紧密结合，象桶板一样形成桶状结构的外围，并且形成了一个规则的氢键带。桶状结构和位于其末端的短α螺旋以及环状结构一起组成一个单独的致密结构域，没有可供扩散的配体进入缝隙。这种坚实的结构保证了其稳定和抗热、抗变性的特点。 GFP的生色基团附着于α-螺旋上，几乎完美的包被于桶状结构中心。位于圆桶中央的α-螺旋含有一个由六肽组成的发光中心，而发光团是由其中的三肽Ser65-Tyr66-Gly67经过环化形成了对羟基苯咪唑啉酮。GFP的生色基团是蛋白质自身催化环化的结果，环化是一个有氧过程，在严格厌氧条件下GFP不能形成荧光，因为GFP的生色团形成需要O2使Tyr66脱氢氧化。生色基团通过Tyr66的脱质子(酚盐)和质子化状态(羟酚基)的转换决定荧光发射，此模型为Yang等的晶体学证据所支持。 GFP在生物技术中的应用研究 1．分子标记 作为一种新型的报告基因，GFP已在生物学的许多研究领域得到应用。利用绿色荧光蛋白独特的发光机制，可将GFP作为蛋白质标签(protein tagging)，即利用DNA重组技术，将目的基因与GFP基因构成融合基因，转染合适的细胞进行表达，然后借助荧光显微镜便可对标记的蛋白质进行细胞内活体观察。由于GFP相对较小，只有238个氨基酸，将其与其他蛋白融合后不影响自身的发光功能，利用GFP的这一特性已经加深了我们对细胞内一些过程的了解，如细胞分裂、染色体复制和分裂，发育和信号转导等。1996年，Ehrdardt等人首次报道了利用GFP的特性研究细胞分化蛋白FtsZ的定位。研究显示FtsZ在细胞分裂位点形成了一个环状物，且至少有9种蛋白在细胞分裂中起重要作用，尽管对这些蛋白功能仍然不是很清楚，但是利用GFP融合蛋白已经搞清楚了它们聚合的顺序以及在蛋白定位中的一些特征。利用GFP来检测目标蛋白的定位已为我们提供了一种对细胞内的一些基本的生理过程进行更详尽观察的新方法。 除用于特定蛋白的标记定位外，GFP亦大量用于各种细胞器的标记如细胞骨架、质膜、细胞核等等。Shi等人曾报道将GFP融合到大肠杆菌细胞膜表面用作标记蛋白，这一技术将有助于提高多肽库的筛选效率、疫苗的研制、构建细胞生物传感器用作环境检测以及探测信号转导过程等等。这些都为传统生物学研究提供了新思路和新方法，成为交叉学科研究的热点。 2．药物筛选 许多新发展的光学分析方法已经开始利用活体细胞来进行药物筛选，这一技术能从数量众多的化合物中快速筛选出我们所感兴趣的药物。基于细胞的荧光分析可分为三类：即根据荧光的密度变化、能量转移或荧光探针的分布来研究目标蛋白如受体、离子通道或酶的状态的变化。荧光探针分布是利用信号传导中信号分子的迁移功能，将一荧光蛋白与信号分子相偶联，根据荧光蛋白的分布情况即可推断信号分子的迁移状况，并推断该分子在迁移中的功能。由于GFP分子量小，在活细胞内可溶且对细胞毒性较小，因而常用作荧光探针。 在细胞体内分子之间的相互作用非常复杂，其中很多涉及到信号分子在细胞器之间的迁移。例如当信号分子和某一特殊受体结合后常会导致配体-受体复合物从某一细胞区域迁移到另一区域，而这一迁移过程通常会介导一重要的生理功能。因而，这些受体常常被用作药物筛选的目标，若某一药物具有与信号分子类似的功能，那么该药物即具有潜在的医药价值。利用GFP荧光探针，将很容易从数量众多的化合物中判断出那些化合物具有与信号分子相似的能引起配体一受体复合物迁移并介导生理反应的功能，且这一筛选过程简单方便，所需成本也很低。利用这一原理，已经成功构建了一个筛选模型用于研究药物介导的糖皮质激素受体(hGR)的迁移过程。在一96孔板中培养细胞，并以一编码hGR GFP蛋白的质粒转染该细胞。当细胞用待筛选的药物处理后，hGR-GFP从细胞质迁移人细胞核的过程可实时或在某一时段
学士学位论文文献综述题目绿色荧光蛋白的应用及发展前景 姓名周紫嫣学号 专业生物工程 指导教师周小萍职 称教师 中国·武汉二○一二年四月
目录 摘要······················································································ II 关键词 ···················································································· II Abstract ··················································································· II Key words ················································································ II 1 GPF的发现 (1) 2 GFP的结构及发光原理 (1) 2.1 GFP的结构 (1) 2.2 GFP的发光原理 (2) 3 GFP在生物技术中的应用 (2) 3.1 GFP作为报告基因 (2) 3.2 GFP用于研究病毒与宿主的关系 (3) 3.3 GFP用于药物筛选 (3) 3.4 GFP作为生物传感器 (3) 3.5 GFP用于融合抗体 (4) 3.6 GFP用于计算细胞生长速度 (4) 3.7 GFP用于基因表达调控 (4) 4 GFP存在问题及发展前景 (4) 参考文献 (5) 致谢 (5)
走近绿色荧光蛋白 现行高中生物教科书(人教版)中，多处描述了荧光标记技术，并有有关荧光蛋白的描述，如荧光标记的小鼠细胞和人细胞融合实验、荧光标记技术与基因定位、荧光鼠的培育等。2008年10月8日，瑞典皇家科学院把今年的诺贝尔化学奖授予绿色荧光蛋白的发现者和推广者。于是，笔者搜集并整理了有关资料，从绿色荧光蛋白(GFP)的来源、分子结构、发光机制、研究历程以及在生物技术中的应用等方面进行概述。 12008年诺贝化学奖及获奖者简介 日本的下村修、美国的马丁·沙尔菲和美籍华人钱永健于2008年10月8日，因对绿色荧光蛋白(GFP)的研究，分享了今年的诺贝尔化学奖。他们的研究历程，犹如一场接力跑：下村修发现了GFP，沙尔菲确定了它的应用价值；而钱永健则让它变得多样化。 下村修现年80岁，生于京都，长于长崎。1960年获得名古屋大学理学博士学位后赴美，先后在美国普林斯顿大学、波士顿大学和伍兹霍尔海洋生物实验所工作。1962年他发现荧光蛋白，被誉为生物发光研究第一人。从33岁做出重要发现，到46岁完成全部关键实验，他的研究遥遥领先，却一直默默无闻。2001年退休后，年逾七旬的下村修继续在家里的地下室潜心研究。 马丁·沙尔菲现年61岁，美国哥伦比亚大学生物学教授，他在利用绿色荧光蛋白做生物示踪分子方面做出贡献。 钱永健1952年出生于美国纽约，现为美国加州大学圣迭戈分校生物化学及化学系教授、美国国家科学院院士、国家医学院院士，2004年沃尔夫奖医学奖得主。他发明的多色荧光蛋白标记技术，将为细胞生物学和神经生物学发展带来一场革命。 2荧光现象 一些化学物质能从外界吸收并储存能量(如光能、化学能、x线或
DAPI DAPI即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)，是一种能够与DNA强力结合的荧光染料，常用于荧光显微镜观测。因为DAPI可以透过完整的细胞膜，它可以用于活细胞和固定细胞的染色。 在荧光显微镜观察下，DAPI染剂是利用紫外光波长的光线激发。当DAPI与双股DNA 结合时，最大吸收波长为358nm，最大发射波长为461nm，其发散光的波长范围含盖了蓝色至青绿色。DAPI也可以和RNA结合，但产生的荧光强度不及与DNA结合的结果，其发散光的波长范围约在400nm左右。 DAPI的发散光为蓝色，且DAPI和绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein, GFP)或Texas Red染剂(红色荧光染剂)的发散波长，仅有少部分重叠，研究员可以善用这项特性在单一的样品上进行多重荧光染色。 DAPI能快速进入活细胞中与DNA结合，因此DAPI对生物体而言，也被视为一种毒性物质与致癌物。使用过程中应注意操作与抛弃的处理程序。 染色原理： DAPI 为一种荧光染料，可以穿透细胞膜与细胞核中的双链DNA结合而发挥标记的作用，可以产生比DAPI自身强20多倍的荧光，和EB相比，对双链DNA的染色灵敏度要高很多倍。显微镜下可以看到显蓝色荧光的细胞，荧光显微镜观察细胞标记的效率高(几乎为100 %) 。DAPI染色常用于细胞凋亡检测，染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。 DAPI也常用于普通的细胞核染色以及某些特定情况下的双链DNA染色。细胞经热激处理后用DAPI染色3分钟，在荧光显微镜下可以看到到细胞核的形态变化。 a、正常的烟草细胞核：核形完整，染色质均匀。 b、染色质固缩，向外周聚集，形成周边化。 c、染色质进一步固缩，形成很多颗粒物质。 d、细胞核破裂形成碎片，核解体。 染色步骤编辑 在细胞移植前，将DAPI 以一定的浓度加入培养基中，与细胞共同孵育过夜，用PBS 缓
绿色荧光蛋白 开放分类：化学奖相关背景知识技术植物生理学科学自然科学 绿色萤光蛋白(green fluorescent protein)，简称GFP，这种蛋白质最早是由下村修等人在1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发现。其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。由于具有自发荧光等特性，在分子生物学和细胞生物学领域得到广泛应用。GFP作为一种报告分子，在检测蛋白表达、蛋白和细胞荧光示踪、研究蛋白质之间相互作用和构象变化中，起到了重要的作用。 绿色荧光蛋白- 简介及其发光机理 绿色荧光蛋白(GreenFluorescent Protein,简称GFP)是一种在美国西北海岸所盛产的水母中所发现的一种蛋白质。这类学名为Aequorea victoria的水母有着美丽的外表,生存历史超过1.6亿年。1962年，下村修正是在这种水母的发光器官内发现天然绿色荧光蛋白。它之所以能够发光,是因在其包含238个氨基酸的序列中，第65至67个氨基酸(丝氨酸—酪氨酸—甘氨酸)残基,可自发地形成一种荧光发色团。 当蛋白质链折叠时，这段被深埋在蛋白质内部的氨基酸片段，得以“亲密接触”,导致经环化形成咪唑酮，并发生脱水反应。但此时还不能发射荧光，只有当有分子氧存在的条件下，发生氧化脱氢，方能导致绿色荧光蛋白发色团的“成熟”，形成可发射荧光的形式。上述绿色荧光蛋白发色团的形成过程，系由几位科学家分别研究完成的。 绿色荧光蛋白不仅无毒，而且不需要借助其他辅酶，自身就能发光,可以让科学家在分子水 平上研究活细胞的动态过程。当绿色荧光蛋白的基因和我们感兴趣的有机体内所拟研究的蛋白质基因相融合时，蛋白质既能保持其原有的活性，绿色荧光蛋白的发光能力也不受影响。通过显微镜观察这种发光的“标签”，科学家就能做到对蛋白质的位置、运动、活性以及相互作用等一目了然。 在一个活体中有数万种不同的蛋白质,这些蛋白质精细地控制着重要的化学进程。如果蛋白机制发生故障，通常就会t发生疾病。绿色荧光蛋白可帮助研究这类机制，这就是为什么绿色荧光蛋白成为生物科学极其重要的工具。在它的帮助下，科学家还能对各种细胞的命运了如指掌,比如,脑神经细胞是如何发育起来的，或者癌症细胞是如何扩散的……
荧光蛋白参数绿色荧光蛋白计算公式 1. 荧光蛋白简介 荧光蛋白（Fluorescent protein，FP）是一种天然存在于某些动植物等生物体内，具有荧光发射能力的蛋白质。它们有着复杂的结构和特殊的物理化学性质，被广泛应用于生物医学、生物技术等领域。其中，绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）是应用最广泛的一种，也是最常见的一种荧光蛋白。 2. GFP的特征 GFP具有以下几个特点： - 在紫外光作用下，能够发射出稳定的绿色荧光； - GFP分子中有一个色素基团，称为香豆素（chromophore），它是荧光的主要来源； - GFP的分子量为27kDa，由238个氨基酸组成，结构非常稳定； - GFP的荧光发射峰为509nm，与其吸收峰相差约30nm； - GFP的荧光强度受到诸多因素的影响，如温度、pH值、离子浓度等。 3. GFP参数计算 为了更好地了解GFP的性质和应用，我们需要计算一些关键的参数。下面是常见的几个参数及其计算方法：
3.1. 色素基团的构象 GFP的香豆素色素基团是荧光的主要来源，因此了解它的构象非常重要。其中最重要的参数是内环部分的键长和键角。内环存在两种共 振式：高能和低能共振式。其键长和键角分别记为r和θ，则高能共 振式基态能量为E1=-πc^2/2r^2，低能共振式基态能量为 E2=πc^2/2r^2(1-cosθ)。因此，内环的基态能量是 Emin=E1cos^2(θ/2)+E2sin^2(θ/2)。实际计算时，通常采用分子动 力学（Molecular Dynamics，MD）方法，模拟GFP分子中香豆素色素 基团的构象变化。 3.2. 构象与荧光发射 内环的构象对GFP的荧光性质影响非常大。例如，在GFP分子中，香豆素基团紧密嵌入蛋白质的肽链中，使其无法自由旋转。因此，荧 光发射峰和吸收峰之间的距离很小，即Stokes位移很小。该参数通常 用以下公式计算：Stokes Shift = λ_emit - λ_abs，其中λ_emit 是荧光发射峰值波长，λ_abs是吸收峰值波长。 3.3. 荧光效率 荧光效率是指荧光发射光子的数量与吸收的光子数量的比值。在GFP中，荧光效率受到自身的荧光猝灭和非辐射转换的影响。因此，正确计算荧光效率需要考虑这些因素。通常采用荧光寿命法（Fluorescence Lifetime，FLT）来测量荧光寿命，然后根据以下公 式计算荧光效率：ϕ = FLTk_i / (1 + FLTk_i)，其中k_i是猝灭速率 常数。
绿色荧光蛋白标记铜绿假单胞菌生物膜形成的动态 观察及结构定量分析 作者：陈波曼余加林刘官信胡琳燕李芳杨华 【摘要】 【关键词】生物膜；铜绿假单胞菌；定量分析；结构 ABSTRACT Objective To quantify the sequential development of biofilm spatial structure in biofilm process with Image Structure Analyer (ISA) software, which will provide assistant to further research on the biological behavior of biofilm. Methods P.aeruginosa PAO1 biofilm model in vitro was constructed on glass slice and biofilm development was monitored in different time intervals (6 hours, 1 day, 3 days and 6 days). The fluorescence images stack of different layer in biofilm model were obtained by confocal laser scanning microscopy (CLSM), based on fluorophores from PAO1 with green fluorescent protein (GFP) genetically tagged. Quantitative parameters describing biofilm spatial structure could be acquired after the image information was calculated by ISA software. Results ①The PAO1 biofilm process was investigated successfully by CLSM after genetically tagged with GFP. ②The quantitative dat a from ISA software showed that the thickness of biofilm accumulated during biofilm growth, the rate was more obvious during the first 3 days than the latter 3 days (19.6μm vs. 6.1μm); meanwhile the areal porosity (AP) decreased from 0.98±0.01 at 6h to 0.92±0.02 at 6d, the average diffusion distance (ADD) increased slightly from 1.00±0.009 at 6h to 1.06±0.027 at 6d; the textural entropy (TE) increased from 0.7±0.08 at 6h to 4.3±0.09 at 6d. Conclusions The ISA software could provide useful information of bacterial biofilm spatial structure in PAO1 biofilm process. Quantifying bacterial biofilm structure permitsed correlating biofilm development with biofilm performance. KEY WORDS Biofilm; Pseudomonas aeruginosa; Quantitative analysis; Structure 长久以来，人们对细菌的认识停留在浮游态水平上，但自然界中99%的细菌以生物膜(biofilm，BF)的形式存在。细菌BF是细菌为适应生存环境黏附惰性或活性材料表面形成的一种与浮游细胞相对应的生长方式，具有环境适应能
绿色荧光蛋白紫外特征峰 绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein，简称GFP）是一种在生物体内独特发光的蛋白质。它最早在细菌产生的生物体（海葵）中被发现，并被广泛应用于生物研究领域。GFP的特征峰位于紫外光谱范围内，这为科学家们提供了一种无创且高效的荧光成像工具，广泛应用于细胞生物学、分子生物学、遗传学等多个领域。 GFP的紫外特征峰是指其最大发射波长位于紫外光波段。该波段通常被定义为200至400纳米的范围。GFP的最大吸收波长位于带有大量能量的近紫外光波段，使得它对一些标准荧光探针的最大激发波长不同。这使得GFP能够与其他荧光探针相互区分，为科学家提供了更好的信号选择性。 GFP的紫外特征峰还具有优异的光稳定性和光稳定性。传统荧光染料在照射后往往会发生光漂白现象，即荧光信号会随着时间的推移而减弱。然而，GFP的特异发光性质使其在长时间观察中保持持久的稳定荧光。这一特点使得GFP能够被应用于动态跟踪生物分子的位置和活动，如细胞内蛋白质运动等。 在生物学研究中，GFP的紫外特征峰还被广泛用于基因表达的报告和监测。通过将GFP基因与感兴趣的基因进行融合，研究人员可以实现该基因在活体样本中的实时可视化。这使得我们可以直观地观察基因的表达模式和细胞的定位情况。此外，通过对GFP的改造，可以产
生具有不同颜色的荧光蛋白，如蓝色、黄色和红色，从而实现多荧光 标记的目的。 除了在实验室中的应用，GFP的紫外特征峰还具有广泛的应用前景。例如，在医学领域，研究人员正在利用GFP的发光特性开发新型的诊 断工具和治疗方法。通过将GFP与荧光标记的抗体结合，医生可以更 准确地检测和诊断患者的病情。此外，GFP还可用于光动力疗法，通过激发GFP发光，进而诱导附着GFP的癌细胞死亡。 总之，绿色荧光蛋白的紫外特征峰为科学家提供了一种强大的工具，既可以实现生物分子的实时可视化观察，也可以用于开发新型的 诊断和治疗方法。随着技术的不断进步和深入研究，相信GFP的应用 领域还将不断扩展，为科学研究和医学进步做出更大贡献。
增强型绿色荧光蛋白 【摘要】目的：应用增强型绿色荧光蛋白-C1标记骨髓间充质干细胞，以期为MMSCs的体内移植提供示踪方法。方法: 在体外分离培养大鼠MMSCs，流式细胞仪检测细胞表型，以脂质体介导法转染质粒增强型绿色荧光蛋白基因，荧光显微镜观察基因表达。结果在基因转染24 h后开始表达，48～72 h达高峰，12～14 d后有较多的表达。结论: 由脂质体介导的质粒 可较为安全、有效地转染MMSCs,是一种较为理想的干细胞示踪方法。 【关键词】骨髓间充质干细胞；增强型绿色荧光蛋白；基因转染 ［Abstract］Objective: To develop an appropriate tracing method for transplanted marrow mesenchymal stem cells (MMSCs) in vivo. Methods: MMSCs of rats were isolated from bone marrow and purified by adherent culture in vitro, and the cell membrane‘s marks were
detected with flow cells were transfected with expressing plamid of transient expression was subsequently observed with fluorescent microscopy. initially found in 24h after the transfection，reached peak in 48～72 h，and remained strong express for 12～14 more days. Conclusion: Lipofectamine mediated transfection can make s safely and effectively, which shows that it is an ideal method for stem cell tracking. ［Key words］ marrow mesenchymal stem cells; enhanced green fluorescent protein; gene transfec- tion 骨髓间充质干细胞成为近年来干细胞 研究的热点，其不仅本身可发挥治疗作用，同时也可作为外源基因的载体和表达场所[1]，是基因治疗理想的种子细胞。2007年
荧光光谱、mCherry和GFP：从光的角度看生命 荧光光谱、mCherry和GFP是三个相关的科学概念，它们都涉及到物质在光的作用下发出不同颜色的光的现象。荧光光谱是一种分析和表征物质的方法，mCherry和GFP是两种常用的荧光蛋白，它们可以作为生物实验中的标记物。 生命是多彩的，而光是生命的重要组成部分。光不仅可以为生命提供能量，还可以为生命提供信息。通过观察和分析物质在光的作用下发出的不同颜色的光，我们可以了解物质的结构和功能，甚至可以探索生命的奥秘。荧光光谱、mCherry和GFP就是三个与光相关的科学概念，它们都可以帮助我们更好地理解和利用生命。 荧光光谱是一种利用物质的荧光特性来分析和表征物质的方法。荧光是指某些物质在吸收一定波长的光后，发出比入射光波长更长的光的现象。这种现象可以用量子力学来解释，当物质中的电子从高能级跃迁到低能级时，会释放出一定波长的光子，这就是荧光。荧光光谱可以提供物质的激发光谱和发射光谱，反映了物质的荧光强度、峰位、寿命、量子产率等信息。荧光光谱具有灵敏度高、选择性强、试样量少等优点，广泛应用于生物、化学、材料等领域。 mCherry和GFP是两种常用的荧光蛋白，它们可以作为生物实验中的标记物，用来观察和分析细胞或蛋白质的结构和功能。mCherry是一种红色荧光蛋白，它是从海葵的DsRed蛋白衍生而来的，它可以吸收540-
590 nm的光，发射550-650 nm的光。GFP是一种绿色荧光蛋白，它是从水母的Aequorea victoria蛋白衍生而来的，它可以吸收395-475 nm的光，发射509 nm的光。mCherry和GFP都是单体荧光蛋白，它们具有较高的亮度和稳定性，可以作为融合蛋白或转基因表达的工具。mCherry和GFP还可以用来研究细胞自噬的过程，自噬是一种细胞降解和回收自身组分的机制。通过将mCherry和GFP都与LC3B蛋白融合，可以形成mCherry-GFP-LC3B复合物，这种复合物可以在荧光显微镜下显示出不同颜色的信号。当自噬体形成时，复合物会转移到自噬体膜上，呈现出黄色荧光。当自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体时，酸性环境会使GFP荧光消失，而mCherry荧光不受影响，呈现出红色荧光。这样就可以区分不同阶段的自噬结构，并追踪自噬的动态变化。 荧光光谱、mCherry和GFP是三个从光的角度看生命的科学概念，它们都可以帮助我们更好地理解和利用生命。通过荧光光谱，我们可以分析和表征物质的性质和特征；通过mCherry和GFP，我们可以观察和分析细胞或蛋白质的结构和功能；通过自噬，我们可以探索细胞的降解和回收机制。这些概念都展示了生命的多样性和复杂性，也展示了生命与光的密切关系。
荧光 一、定义 荧光〔fluorescence〕又作"萤光〞,是指一种光致发光的冷发光现象.当某种常温物质经某种波长的入射光〔通常是紫外线或X射线〕照射,吸收光能后进入激发态,并且立即退激发并发出比入射光的的波长长的出射光〔通常波长在可见光波段〕；而且一旦停止入射光,发光现象也随之立即消失.具有这种性质的出射光就被称之为荧光. 二、原理 光照射到某些原子时,光的能量使原子核周围的一些电子由原来的轨道跃迁到了能量更高的轨道,即从基态跃迁到第一激发单线态或第二激发单线态等.第一激发单线态或第二激发单线态等是不稳定的,所以会恢复基态,当电子由第一激发单线态恢复到基态时,能量会以光的形式释放,所以产生荧光. 荧光是物质吸收光照或者其他电磁辐射后发出的光.大多数情况下,发光波长比吸收波长较长,能量更低.但是,当吸收强度较大时,可能发生双光子吸收现象,导致辐射波长短于吸收波长的情况发射.当辐射波长与吸收波长相等时,既是共振荧光. 荧光强度：荧光强度与该种物质的荧光量子产率、消光系数以与含量等因素有关.荧光量子产率Q：量子产率表示物质将吸收的光能转化为荧光的本领,是荧光物质发出光子数与吸收光子数的比值.荧光蛋白分子的亮度由其量子产率与消光系数的乘积决定,与成像检测灵敏度密切相关. 三、荧光蛋白 1、绿色荧光蛋白〔green fluorescent protein,GFP〕 在光谱的绿光区〔500nm-525nm〕已经发现了多种荧光蛋白,而且来源广泛,包括不同种属的Aequorea 、桡足类动物、##鱼以与珊瑚.然而多数有齐聚反应,即使最好的荧光蛋白与EGFP相比,也没有明显的优点.或许目前活细胞成像最好的选择是GFP衍生的Emerald〔祖母绿〕,它与EGFP的特性相似.Emerald包含F64L和S65T 突变,另外还有四个点突变从而改进了折叠、37℃时的突变率以与亮度.虽然Emerald比EGFP更有效,但含有快速光漂白成分,可能在某些环境下其定量成像会受到影响. 下面主要介绍GFP与其衍生型荧光蛋白： 〔1〕来源 绿色荧光蛋白最早由美籍日裔科学家下村修于1962年在水母中发现.这种蛋白质在蓝色波长X围的光照激发下发出绿色荧光,其发光过程需要冷光蛋白质Aequorin的帮助,而且,这个冷光蛋白质可与钙离子〔Ca2+〕相互作用.在水母中发现的野生型绿色荧光蛋白的分子量较小,仅为27~30kDa,而编码GFP的基因序列也很短,为2.6kb. 〔2〕性质 GFP由238个氨基酸残基组成.GFP序列中的65-67位残基〔Ser65-Tyr66-Gly67〕可
绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达 背景知识 绿色荧光蛋白( green fluorescent protein ， GFP)是一类存在于包括水母、水螅 和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时， GFP 发射绿色荧光。它产生荧光无需底物或辅因子。发色团是其蛋白质一级序列固有的。 GFP 由 3 个外显子组成，长 2.6kb ；GFP 是由 238 个氨基酸所组成的单体蛋白 ,相对分子质量为27. 0kMr ，其蛋白性质十分稳定，能耐受 60℃处理。 1996 年 GFP 的晶体结构被解 出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长 420 nm，宽 240 nm，由 11 个围绕中 心α螺旋的反平行β 折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3 个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光 活性很重要的生色团则位于大空腔内。发色团是由其蛋白质内 部第 65-67 位的 Ser-Tyr-Gly 自身环化和氧化形成 . 实验一质粒DNA 的分离与纯化 一、实验目的 掌握一种最常用的质粒 DNA 提取方法：碱裂解法。该法用 于从小量培养物中抽提质粒 DNA ，比较方便、省时，提取的 质粒 DNA 质量较高，可用于 DNA 的酶切、 PCR 甚至测序。 二、基本原理 质粒是一类在细菌细胞内发现的独立于染色体外，能够自主复制的稳定的遗传单位。迄今为止，从细菌中分离得到的质粒都是环型双链 DNA 分子，分子量范围从 1kb 到 200kb 。质粒 DNA 可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下又会可逆地 整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。在大多 数情况下质粒 DNA 复制中的酶体系和细菌染色体复制 10-200 个拷贝。当宿主细胞的蛋白
绿色荧光蛋白（GFP）的研究史 先看一道试题： GFP是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP基因为材料，利用基因工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白，丰富了荧光蛋白的颜色种类。回答下列问题。 （1）构建突变基因文库，科研人员将GFP基因的不同突变基因分别插入载体，并转入大肠杆菌制备出GFP基因的突变基因文库。通常，基因文库是指_______。 （2）新蛋白与突变基因的关联性分析。将上述发黄色荧光的大肠杆菌分离纯化后，对其所含的GFP突变基因进行测序，发现其碱基序列与GFP基因的不同，将该GFP突变基因命名为YFP基因（黄色荧光蛋白基因）。若要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达，实验思路是_______。 答案：（1）将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因（2）将构建好的表达载体（含有目的基因YFP基因）导入酵母菌中进行表达 解析：有关密码子，考生可从以下几方面把握： ①概念：密码子是mRNA上相邻的3个碱基。 ②种类：64种，其中有3种是终止密码子，不编码氨基酸。
③特点：一种密码子只能编码一种氨基酸，但一种氨基酸可能由一种或多种密码子编码；密码子具有通用性，即自然界所有的生物共用一套遗传密码。 将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。 基因工程研究中常用的真核表达系统有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。要通过基因工程的方法探究YFP 基因能否在真核细胞中表达，可将构建好的表达载体（含有目的基因YFP基因）导入酵母菌中进行表达，如果酵母菌发出黄色荧光，说明YFP基因能在真核细胞中表达，反之则不能在真核细胞中表达。 这是2023全国乙卷试题节选。以绿色荧光蛋白（GFP）为情景考查基因工程。 2019高中生物学必修二也提到了绿色荧光蛋白： 那么，什么是绿色荧光蛋白（GFP）？是如何发现的？ 绿色荧光蛋白（GFP）是一个由约238个氨基酸组成的蛋白质，从蓝光到紫外线都能使其激发，发出绿色荧光。近些年其被广泛应用