gfp激发波长和发射波长
gfp激发波长是488nm，发射波长是507nm。gfp是绿色荧光蛋白的简称，是一个由约238个氨基酸组成的蛋白质，从蓝光到紫外线都能使其激发，发出绿色萤光。虽然许多其他海洋生物也有类似的绿色荧光蛋白，但传统上，绿色荧光蛋白指首先从维多利亚多管发光水母中分离的蛋白质。
扩展资料：
1、由于荧光蛋白能稳定在后代遗传，并且能根据启动子特异
性地表达，在需要定量或其他实验中慢慢取代了传统的化学染料。更多地，荧光蛋白被改造成了不同的新工具，既提供了解决问题的新思路，也可能带来更多有价值的新问题。
2、荧光显微镜：GFP和它的衍生物的可用性已经彻底重新定
义荧光显微镜，以及它被用来在细胞生物学和其他生物学科的方式。其中，最令人兴奋的就是用于超分辨显微镜成像。
蛋白标签 蛋白标签（proteintag）是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。随着技术的不断发展，研究人员相继开发出了具有各种不同功能的蛋白标签。目前，这些蛋白标签已在基础研究和商业化产品生产等方面得到了广泛的应用。 美国GeneCopoeia（复能基因）为客户提供50多种蛋白标签，可以满足客户的不同需求，包括各种最新型的标签，如：SNAP-Tag™、Halo Tag™、AviTag™、Sumo等；也提供齐全的各种常用标签，如eGFP、His、Flag等等标签。 以下是部分蛋白标签的特性介绍，更加详细的介绍可在查询克隆产品的结果
TrxHIS His6是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的C末端或N 末端。当某一个标签的使用，一是能构成表位利于纯化和检测；二是构成独特的结构特征（结合配体）利于纯化。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析(IMAC)，对重组蛋白进行分离纯化。使用His-tag有下面优点： •标签的分子量小，只有~0.84KD，而GST和蛋白A分别为~26KD和~30KD，一般不影响目标蛋白的功能； •His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化，前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用，后者在纯化包涵体蛋白时特别有用，用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和亲和层析去除杂蛋白，使复性不受其它蛋白的干扰，或进行金属螯和亲和层析复性； •His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究； •His标签免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫并制备抗体。 •可应用于多种表达系统，纯化的条件温和； •可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。 Flag标签蛋白 Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽（DYKDDDDK），同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。 FLAG作为标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点：
常用荧光染料的激发和 发射波长精选文档 TTMS system office room 【TTMS16H-TTMS2A-TTMS8Q8-
常用荧光染料的激发和发射波长Fluorescent Dye （荧 光染料）Excitation （激发波长， nm ） Emission （发射波长， nm ） Cy2 489 506 GFP(Red Shifted) 488 507 YO-PRO -1 491 509 YOYO -1 491 509 Calcein 494 517 FITC 494 518 FluorX 494 519 Alexa 488 490 520 Rhodamine 110 496 520 ABI,5-FAM 494 522 Oregon Green 500 503 522 Oregon Green 488 496 524 RlboGreen 500 525 Rhodamine Green 502 527 Rhodamine123 507 529 Magnesium Green 506 531
Calcium Green 506 533 TO-PRO -1 514 533 TOTO-1 514 533 ABI,JOE 520 548 BODIPY 530/550 530 550 Dil 549 565 BODIPY?R 542 568 BODIPY?558/568 558 568 BODIPY?564/570 564 570 Cy3 550 570 Alexa 546 555 570 TRITC 547 572 Magnesium Orange 550 575 Phycoerythrin,R & B 565 575 Rhodamine Phalloidin 550 575 Calcium Orange 549 576 Pyronin Y 555 580 Rhodamine B 罗丹明555 580 ABI,TAMRA 560 582 Rhodamine Red 570 590
⏹人肉眼对光源波长的颜色感觉 红色 770-622 nm 橙色 622~597 nm 黄色 597~577 nm 绿色 577~492 nm 蓝靛色 492～455nm 紫色 455～350nm ⏹常见显微镜滤光片的波长 在激发波长在Ex范围内才能被激发，只有发射光波长大于BA/EM才能被观察到，背景光的波长只有大于DM才能被观察到。 红色滤光片G-2A Ex 510-560 DM 575 BA 590 绿色滤光片B-2A Ex 450-490 DM 505 BA 520 蓝色滤光片UV-2A Ex 330-380 DM 400 BA 420
其它荧光染料介绍 【菁类染料-Cyanine dyes(Cy2,Cy3,Cy5)】 Cy2耦联基团激发波长为492nm，发光为波长510nm的绿色可见光。Cy2和FITC使用相同的滤波片。由于Cy2比FITC在光下更稳定。要避免使用含有磷酸化的苯二胺的封片剂，因为这种抗淬灭剂和Cy2反应，在染色片储存后会导致荧光微弱和扩散。Cy3和Cy5比其他的荧光团探针要更亮，更稳定，背景更弱。Cy3耦联基团激发光的最大波长为550nm，最强发射光为570nm。因为激发光和发射光波长很接近TRITC, 在荧光显微镜中，可使用和TRITC一样的滤波片。 Cy3在氩光灯(514nm或528nm)下可以被激发出50％的光强，在氦氖灯(543nm)或者汞灯(546nm)下则约75％。Cy3可以和荧光素一起作双标。Cy3还可以和Cy5一起在共聚焦显微镜实验中作多标记。Cy5耦联基团的激发波长最大650nm，发光波长最大670nm。在氪氩灯(647nm)下它们可被激发出98％的荧光，在氦氖灯下(633nm)为63％。Cy5可以和很多其他的荧光基团一起用在多标记的实验中。由于它的最大发射波长在670nm，Cy5很难用裸眼观察，而且不能用汞灯作理想的激发。通常观察Cy5时采用具有合适激发光和远红外检测器的共聚焦显微镜。在水相封片剂中应当加入抗淬灭剂。使用传统的表面荧光显微镜时，不推荐使用Cy5。 【藻红蛋白或藻胆色素蛋白-Phycoerythrin(PE)荧光标记二抗】 存在于被称为藻红的多聚微粒中，位于叶绿素的反应中心，在自然结构中，藻红蛋白吸收光能，吸收后转化成能量，供其发育生长。当藻红蛋白被分离和纯化后，其蛋白质变得具有很强的荧光，能吸收不同波长的光，发出亮红色的荧光，此时不再接受任何外来的光，也不能转移光能。藻红蛋白PE的吸收波长范围较广，最大的吸收波长为566nm，最大的发射波长为574nm。藻红蛋白作为荧光标记物具有以下优点：首先具有强的长波长激发和发射荧光，可避免来自其他生物材料荧光的干扰；并且具有极高的发射量子产率；另外PE具有非常高的水溶性而且与许多生物学或合成材料的多位点稳定交联。 【Aminomethylcoumarin Acetate (AMCA)】 耦联的AMCA吸收光波长最大为350nm，发荧光则为450nm。对于荧光显微镜来说，AMCA可以用汞灯来激发，用紫外滤板来观察。由于AMCA的信号相对较弱，单标实验中不推荐使用AMCA。AMCA和荧光素的荧光波长只有很小的重叠范围，而和发出长波长荧光的荧光基团没有或者只有极少的重叠，因此它最常用于多标记实验中，比如免疫荧光显微镜和流式细胞仪。由于人眼不能很好的检测蓝色荧光，在多标记的实验中，AMCA耦联的二抗应当被用于检测大量的抗原。AMCA和荧光素一样很快淬灭，使用抗淬灭剂可以减轻。且由于肉眼不能很好的检测AMCA所激发的蓝色荧光，因而AMCA耦联的二抗更适用于检测大量存在的抗原。如果
常用荧光染料的激发和发射波长 Fluorescent Dye （荧光染料）Excitation （激发波长， nm ） Emission （发射波长， nm ） Cy2 489 506 GFP(Red Shifted) 488 507 YO-PRO -1 491 509 YOYO -1 491 509 Calcein 494 517 FITC 494 518 FluorX 494 519 Alexa 488 490 520 Rhodamine 110 496 520 ABI,5-FAM 494 522 Oregon Green ?500 503 522 Oregon Green ? 488 496 524 RlboGreen ? 500 525 Rhodamine Green 502 527 Rhodamine123 507 529 Magnesium Green 506 531 Calcium Green 506 533 TO-PRO ?-1 514 533 TOTO-1 514 533 ABI,JOE 520 548 BODIPY? 530/550 530 550 Dil 549 565 BODIPY?R 542 568 BODIPY?558/568 558 568 BODIPY?564/570 564 570 Cy3 ? 550 570 Alexa ? 546 555 570 TRITC 547 572 Magnesium Orange ? 550 575 Phycoerythrin,R & B 565 575 Rhodamine Phalloidin 550 575 Calcium Orange ? 549 576 Pyronin Y 555 580 Rhodamine B 罗丹明555 580 ABI,TAMRA 560 582
GFP荧光蛋白发光原理详解 1. 引言 GFP（Green Fluorescent Protein）是一种由Aequorea victoria这种发光水母产生的蛋白质，具有独特的发光性质。GFP的发现和利用对生物学研究产生了巨大影响，尤其在细胞和分子生物学领域。本文将详细解释GFP的发光原理及相关基本原理。 2. GFP结构和特性 GFP是一个由238个氨基酸组成的蛋白质，其结构包括一个11螺旋α-螺旋结构和一个β-折叠片。GFP的核心是一个环状结构，其中三个氨基酸残基（Ser65、 Tyr66和Gly67）形成了环上的氢键网络。这个环被称为“环肽”（chromophore），它是GFP发光的关键。 在正常情况下，成熟的GFP并不会自发地发光。然而，在存在适当激发条件时，它可以吸收能量并在辐射下重新释放能量。 3. GFP荧光机制 GFP荧光机制可以分为两个主要步骤：吸收和发射。 3.1 吸收 在吸收过程中，GFP的分子结构中的环肽通过吸收外界光的能量而处于激发态。这 个过程可以用以下方程式表示： GFP + 光子（hν）→ GFP*（激发态） GFP分子能够吸收波长在395-475纳米之间的紫蓝色光。当这些光线照射到GFP上时，其中一个电子会从基态跃迁到激发态。 3.2 发射 在发射过程中，激发态的GFP分子会释放出能量并返回到基态。这个过程可以用以下方程式表示： GFP*（激发态）→ GFP + 光子（hν） 在这个过程中，电子会从高能级返回到低能级，并释放出一束特定波长的荧光。对于GFP来说，它会产生绿色荧光，波长约为509纳米。
4. 环肽（chromophore）结构解析 环肽是GFP荧光机制的关键部分。它是由三个氨基酸残基（Ser65、Tyr66和Gly67）组成的环状结构，并且形成了氢键网络。 环肽结构变化导致了GFP的发光性质。具体来说，Tyr66氨基酸残基的酚氧基与 Ser65和Gly67之间形成了一个内部氢键。这个氢键网络可以稳定环肽的结构，并 影响荧光发射的波长。 5. GFP荧光蛋白的应用 由于其特殊的发光性质，GFP被广泛应用于生物学研究中。以下是一些常见的应用：5.1 荧光标记 通过将GFP融合到感兴趣的蛋白质中，可以实现对该蛋白质在细胞或组织中位置和动态变化的实时观察。这种方法被广泛应用于细胞定位、蛋白质交互作用等研究领域。 5.2 生物传感器 利用GFP与其他分子或信号相互作用时发生荧光变化的特性，可以构建各种生物传感器。这些传感器可用于检测细胞内离子浓度、代谢产物等，并提供实时监测功能。 5.3 基因表达调控 通过将GFP与特定启动子序列结合，可以构建报告基因系统，用于评估基因的表达水平和活性。这种方法对于研究基因调控机制非常有用。 5.4 蛋白质结构研究 通过对GFP的结构和荧光机制进行深入研究，可以了解蛋白质折叠、稳定性等方面的基本原理。这对于药物设计和蛋白质工程具有重要意义。 6. 结论 GFP作为一种发光蛋白质，具有独特的发光性质和广泛的应用前景。它的发光原理 涉及到吸收和发射两个过程，其中环肽是关键部分。通过深入研究GFP的发光机制，我们可以更好地利用它在生物学研究中的应用，并推动科学进步。 参考文献： 1. Shaner, N.C., Steinbach, P.A., and Tsien, R.Y. (2005). A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods 2, 905-909. 2. Shimomura O, Johnson FH, Saiga Y (1962). Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. 3. Wachter RM (2017). The structural biology of
gfp激发光波长和发射光波长 GFP激发光波长和发射光波长：深入探究 引言 绿色荧光蛋白（GFP）是一种非常流行的荧光蛋白家族成员，自从1990年首次从水螅上分离出来以来，已经成为生物技术和分子生物学领域的研究热点。GFP 是一种蛋白质，能够在特定条件下发出特定颜色的荧光，广泛应用于荧光显微镜和融合蛋白质表达等领域。在使用GFP时，有两个重要的概念需要了解，即GFP 激发光波长和发射光波长。本文将介绍这两个概念的定义和相关背景知识，并探讨它们对GFP应用的影响。 第一部分：GFP的背景知识 GFP的背景知识我们不必过多赘述，因为它在分子生物学和生物技术领域已被广泛运用，但我们仍然需要介绍一下它的简要历史和结构。 GFP的简要历史 GFP最初是在1962年从海葵（Aequorea victoria）的触手中分离出来的。然而，由于当时在结构和化学组成方面的技术限制，GFP的分子结构和工作机制一度不为人们所知。
1990年，Martin Chalfie等人成功地将GFP引入到线虫（Caenorhabditis elegans）的基因表达研究中。随后，Douglas Prasher和Roger Tsien分别研究GFP的发射光波长和在其他生物系统中的应用。由于这些重要研究的贡献，GFP成为了分子生物学和生物技术领域的研究热点，并在2008年赢得了化学领域的诺贝尔奖。 GFP的结构 GFP是由一个238个氨基酸残基组成的蛋白质，其分子结构的最重要特点是三个环状结构。这三个环状结构共同构成了GFP的一个色团（chromophore），这个色团是GFP能够发出荧光的根本原因，因此这个结构是研究GFP的重要关键之一。 值得一提的是，GFP虽然是从海葵中分离出来的，但它实际上是一种正常存在于海葵内的分子。海葵在需要发出荧光时，GFP就会在细胞中储存并释放出来，所以GFP对于海葵来说就像是一种反应器，而我们可以通过基因工程技术在其他生物体系中引入这个反应器，从而实现在生物学中的应用。 第二部分：GFP的光学性质 GFP的荧光性
GFP的简介和应用LT
GFP及其变种分为7种，每一种都有一组不同的荧光激发和发射波长)。GFP无需再加任何底物和辅助因子，在紫外或蓝光激发下就能发荧光，在450~ 490nm蓝光激发下，GFP荧光至少能保持10min以上，不像其他荧光素， 荧光容易淬灭。其中，GFP的一个引人注目的特点，其生色团的形成没有物种的特异性。可以在翻译后2~ 4h通过自动催化作用来合成。Cubitt 等认为生色团自身环化的驱动力来自蛋白质三维结构的形成，由此Kolb等提出一个假说，即环化在新合成的多肽的折叠过程中进行。 1.3 GFP的荧光性质及应用优点 GFP的荧光性质比较特殊，具有诸多优点而备受关注。 （1）易于检测，灵敏度高。 GFP荧光反应不需要外加底物和辅助因子，只需紫外光或蓝光激发，即可发出绿色荧光，用荧光显微镜甚至肉眼就可以观察到。其次，即便是未经纯化的GFP发射的绿光也是相当强的，在正常室内光线下仍清晰可辨。对于单细胞水平的表达也可识别。 （2）荧光性质稳定。
GFP对光漂白（一种荧光衰减现象）有较强的耐受性，能耐受长时间的光照，从而延长了可探测时间；GFP在pH7~ 12范围内也能正常发光，对高温（70 ℃）、碱性、除垢剂、盐、有机溶剂和大多数普通酶都有较强抗性。 （3）对细胞无毒害。 从目前的研究结果来看，GFP对生活的细胞基本无毒害，与目的基因融合后，对目的基因的结构功能没有影响，转化后细胞仍可连续传代。（4）构建载体方便。 由于编码GFP的基因序列很短，所以很方便地同其它序列一起构建多种质粒，而不至于使质粒过大影响转化频率。 （5）可直接用于活细胞测定。 GFP 是能在异源细胞内表达后，能自发产生荧光的蛋白，并且GFP的分子量较小，N-端和C-端都能忍受蛋白的融合，是理想的标记物，可进行活细胞实时定位观察，更能接近自然真实的状态。如在活细胞中直接观察蛋白向细胞核、内质网运动的状态，还可实时观察到 外界信号刺激下，目的蛋白的变化过程，借助荧光显微镜观察，使研究更为方便。使用激光共聚
绿色荧光蛋白 (green fluorescent protein)，简称GFP，这种蛋白质最早是由下村脩等人在1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发现。其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。这个发光的过程中还需要冷光蛋白质Aequorin的帮助，且这个冷光蛋白质与钙离子(Ca2+)可产生交互作用。由水母Aequ orea victoria中发现的野生型绿色萤光蛋白，395nm和475nm分别是最大和次大的激发波长，它的发射波长的峰点是在509nm，在可见光绿光的范围下是较弱的位臵。由海肾(sea pansy)所得的绿色萤光蛋白，仅有在498nm有一个较高的激发峰点。 在细胞生物学与分子生物学领域中，绿色萤光蛋白基因常被用作为一个报导基因(reporter gene)。一些经修饰过的型式可作为生物探针，绿色萤光蛋白基因也可以克隆到脊椎动物(例如:兔子上进行表现，并拿来映证某种假设的实验方法。
GFP由238个氨基酸组成，分 子量为26.9 kDa，最初是从维 多利亚多管发光水母中分离 出来的，在蓝光照射下会发出 绿色荧光。来源于水母的野生 型GFP在395 nm和475 nm 分别有主要和次要的激发峰， 它的发射峰在509 nm，处于可见光谱的绿色区域（图1）。来源于海肾的GFP只在498 nm有单个激发峰GFP的化学性质相当稳定，其变性需要在90℃或pH<4或pH>12的条件下用6mollL盐酸胍处理，这一性质与GFP的结构特性相关。 GFP是典型的β桶形结构，包含β折叠和α螺旋，将荧光基团包含在其中（图2）。严密的桶形结构保护着荧光基团，防止它被周围环境淬灭，内部面向桶形的侧链诱导Ser65–Tyr66–Gly67三肽环化，导致荧光基团形成。 在蛋白质编号lema中可以看到GFP发色团的骨架在左边。蛋白质链形成一个圆柱形罐头（蓝色），子链的一部分直接从中间穿过（绿色），发色团刚好在罐头盒的中间，它被保护起来以免受周围环境的影响。这种保护对于发射荧光是必需的。一但发色团吸收一个光子，激活的水分子通常就会夺取它的能量。但是在蛋白质内部改为发射能量稍低的光子来释放能量，使它得到了保护。发色团（如图）由蛋白
荧光光谱、mCherry和GFP：从光的角度看生命 荧光光谱、mCherry和GFP是三个相关的科学概念，它们都涉及到物质在光的作用下发出不同颜色的光的现象。荧光光谱是一种分析和表征物质的方法，mCherry和GFP是两种常用的荧光蛋白，它们可以作为生物实验中的标记物。 生命是多彩的，而光是生命的重要组成部分。光不仅可以为生命提供能量，还可以为生命提供信息。通过观察和分析物质在光的作用下发出的不同颜色的光，我们可以了解物质的结构和功能，甚至可以探索生命的奥秘。荧光光谱、mCherry和GFP就是三个与光相关的科学概念，它们都可以帮助我们更好地理解和利用生命。 荧光光谱是一种利用物质的荧光特性来分析和表征物质的方法。荧光是指某些物质在吸收一定波长的光后，发出比入射光波长更长的光的现象。这种现象可以用量子力学来解释，当物质中的电子从高能级跃迁到低能级时，会释放出一定波长的光子，这就是荧光。荧光光谱可以提供物质的激发光谱和发射光谱，反映了物质的荧光强度、峰位、寿命、量子产率等信息。荧光光谱具有灵敏度高、选择性强、试样量少等优点，广泛应用于生物、化学、材料等领域。 mCherry和GFP是两种常用的荧光蛋白，它们可以作为生物实验中的标记物，用来观察和分析细胞或蛋白质的结构和功能。mCherry是一种红色荧光蛋白，它是从海葵的DsRed蛋白衍生而来的，它可以吸收540-
590 nm的光，发射550-650 nm的光。GFP是一种绿色荧光蛋白，它是从水母的Aequorea victoria蛋白衍生而来的，它可以吸收395-475 nm的光，发射509 nm的光。mCherry和GFP都是单体荧光蛋白，它们具有较高的亮度和稳定性，可以作为融合蛋白或转基因表达的工具。mCherry和GFP还可以用来研究细胞自噬的过程，自噬是一种细胞降解和回收自身组分的机制。通过将mCherry和GFP都与LC3B蛋白融合，可以形成mCherry-GFP-LC3B复合物，这种复合物可以在荧光显微镜下显示出不同颜色的信号。当自噬体形成时，复合物会转移到自噬体膜上，呈现出黄色荧光。当自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体时，酸性环境会使GFP荧光消失，而mCherry荧光不受影响，呈现出红色荧光。这样就可以区分不同阶段的自噬结构，并追踪自噬的动态变化。 荧光光谱、mCherry和GFP是三个从光的角度看生命的科学概念，它们都可以帮助我们更好地理解和利用生命。通过荧光光谱，我们可以分析和表征物质的性质和特征；通过mCherry和GFP，我们可以观察和分析细胞或蛋白质的结构和功能；通过自噬，我们可以探索细胞的降解和回收机制。这些概念都展示了生命的多样性和复杂性，也展示了生命与光的密切关系。
. 常用荧光染料的激发和发射波长 Fluorescent Dye （荧光染料）Excitation （激发波长， nm ） Emission （发射波长， nm ） Cy2 489 506 GFP(Red Shifted) 488 507 YO-PRO -1 491 509 YOYO -1 491 509 Calcein 494 517 FITC 494 518 FluorX 494 519 Alexa 488 490 520 Rhodamine 110 496 520 ABI,5-FAM 494 522 Oregon Green ?500 503 522 Oregon Green ? 488 496 524 RlboGreen ? 500 525 Rhodamine Green 502 527 Rhodamine123 507 529 Magnesium Green 506 531 Calcium Green 506 533 TO-PRO ?-1 514 533 TOTO-1 514 533 ABI,JOE 520 548 BODIPY? 530/550 530 550 Dil 549 565 BODIPY?R 542 568 BODIPY?558/568 558 568 BODIPY?564/570 564 570 Cy3 ? 550 570 Alexa ? 546 555 570 TRITC 547 572 Magnesium Orange ? 550 575 Phycoerythrin,R & B 565 575 Rhodamine Phalloidin 550 575 Calcium Orange ? 549 576 Pyronin Y 555 580 Rhodamine B 罗丹明555 580 ABI,TAMRA 560 582
常用
荧光染料的使用 吖啶橙：吖啶橙是最经典的灵敏的荧光染料，它可对细胞中的DNA和RNA同 时染色而显示不同颜色的荧光，DNA呈绿色荧光，RNA呈橙红色荧光。EB:染色DNA和RNA荧光素双醋酸酯(FDA): FAD本身无荧光，无极性,可透过完整的原生质膜。一旦进入原生质体后，由于受到酯酶分解而产生具有荧光的极性物质荧光素。它不能自由出入原生质膜，因此有活力的细胞能产生荧光，无活力的原生质体不能分解FAD无荧光产生。5mgFDA溶于1ml丙酮中，避光4C下贮存, 使用时取0.22mlFDA贮存液加入5ml0.65mol/L甘露醇中•使用时,使最终浓度为0.01%。荧光染料HO33342和若丹明123:活细胞双荧光染色观察细胞核和线粒体。一般的生物染料不能穿透细胞膜，只有当细胞被固定后改变了细胞膜的通透性，染料才能进入细胞内。但有些活体染料能进入活细胞，并对细胞不产生毒性作用。荧光染料HO33342和若丹明123都是活体染料。Ho33342能与细胞中DNA 进行特异的结合，若丹明123能与线粒体进行特异的结合。采用两种荧光染料的混合染液可对一个活细胞的核和线粒体同时染色。 荧光组化实验中应注意的几个问题：1 •每种荧光染料，均有自己的最适PH值, 此时荧光最强。当pH改变时，不仅荧光强度减弱，而且波长将有所改变，因此荧光检测时要在一定的PH值的缓冲液中进行。2•—放荧光染色在20C以下时荧光比较稳定，温度升高常出现温度猝灭。 3 •在荧光观察中，常因激发光的增 强而使样品荧光很快衰竭，造成观察和照相困难。为此最好用能量小的长波长光进行观察，需照相时再适当增强激发光。4•一般荧光染液的浓度在万分之一以下，甚至亿万分之一，也能使标本着色。在一定的限度内，荧光强度可随荧光素的浓度增加而增强，但超过限度，荧光强度反而下降，这是由于荧光分子间的缔合而使自身荧光猝灭所致。
光漂白(photonic bleaching)是在光照条件下使其发生化学反应或是构象改变,而失去发荧光的特性,就是所谓的漂白.它常用于生物体内扩散速率常数的测定. 光漂白抗性就是抗光漂白性吧~~我是这么理解的。 下面的是搜索的关于绿色荧光蛋白^_^ ·GFP的发光特性 GFP吸收的光谱,最大峰值为395nm(紫外),并有一个峰值为470nm的副峰(蓝光);发射光谱最大峰值为509nm(绿光),并带有峰值为540nm的侧峰(Shouder). GFP的光谱特性与荧光素异硫氰酸盐(FITC)很相似,因此为荧光素FITC设计的荧光显微镜滤光片组合同样适用于GFP观察. 尽管450～490nm(蓝光)是GFP的副吸收峰,但由于长波能量低,细胞忍受能力强,因此更适合于活体检测. GFP的性质 GFP荧光极其稳定,在激发光照射下,GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比荧光素(fluorescein)强,特别在450～490nm蓝光波长下更稳定. GFP需要在氧化状态下产生荧光,强还原剂能使GFP转变为非荧光形式,但一旦重新暴露在空气或氧气中,GFP荧光便立即得到恢复.而一些弱还原剂并不影响GFP 荧光.中度氧化剂对GFP荧光影响也不大,如生物材料的固定,脱水剂戊二酸或甲醛等. GFP融合蛋白的荧光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高,抗光漂白能力强,因 此更适用于定量测定与分析. 但因为GFP不是酶,荧光信号没有酶学放大效果,因此GFP灵敏度可能低于某些酶类报告蛋白. 由于GFP荧光是生物细胞的自主功能,荧光的产生不需要任何外源反应底物,因此GFP作为一种广泛应用的活体报告蛋白,其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的. 常用的显微技术 共聚焦显微镜 原理：共焦显微镜[Confocal Laser Scanning Microscope(CLSM或LSCM)]在反射光的光路上加上了一块半反半透镜(Beam Splitter)，将已经通过透镜的反射光折向其它方向，在其焦点上有一个带有针孔（Pinhole）的挡板，小孔就位于焦点处，挡板后面是一个光电倍增管（photomultiplier tube，PMT）。可以想像，探测光焦点前后的反射光通过这一套共焦系统，必不能聚焦到小孔上，会被挡板挡住。于是光度计测量的就是焦点处的反射光强度。其意义是：通过移动透镜系统可以对一个半透明的物体进行三维扫描。共聚焦显微镜能提供无比精确的三维成像，以及对亚细胞结构和动力学过程的精准测试。 传统的光学显微镜使用的是场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰；激光扫描共聚焦显微镜利用激光束经照明针孔形成点光源对标本内焦平面的每一点扫描，标本上的被照射点，在探测针孔处成像，由探测针孔后的光电倍增管（PMT）或冷电耦器件（cCCD）逐点或逐线接收，迅速在计算机监视器屏幕上形成荧光图像。照明针