·综述·2013年8月第20卷第22期
20世纪60年代，日本科学家梅译滨夫提出了酶抑制剂的概念，从而将抗生素的研究扩大到酶抑制剂的新领域。随着酶学研究的深入，对酶结构的认识，已能在分子水平上认识酶的作用机制，并根据酶的作用原理来设计各种酶的专一抑制剂作为药物，来调节体内的异常代谢。
酶抑制剂作为药物的治疗基础是通过限制酶催化底物的反应能力，使底物浓度增高或代谢产物浓度降低，以达到改善症状的目的。在一系列酶促反应中，以抑制限速酶或关键酶的效果最好。在目前上市的药物中，以受体为靶点的药物占52%，以酶为靶点的药物占22%，以离子通道为靶点的药物占6%，以核酸为靶点的药物占3%。酶抑制剂的开发是新药的重要来源。随着现代生物科学技术的发展，酶抑制剂作为药物越来越受到医药界的重视。
药物筛选模型是用于证明某种物质具有药理活性（生物活性、治疗作用）的实验方法，是寻找和发现药物的重要途径之一。在长期寻找药物的实践过程中，建立了大量用于新药筛选的各类模型，在新药发现和研究中发挥了积极的作用。随着生命科学的发展，新的药物筛选模型不断出现，不仅促进了药物的发现，而且对药物筛选的方法、理论、技术都产生了巨大影响[1]。
酶抑制剂的筛选模型主要为动物模型和细胞分子水平筛选模型。动物模型由于规模小、效率低、样品量大、成本高等缺点，不适合作为药物初筛的模型。细胞和分子水平的筛选模型，具有材料用量少、药物作用机制比较明确、可实现大规模筛选和一药多筛等特点[1]，已成为目前酶抑制剂筛选的主要方法。本文就近几年来酶抑制筛选的主要模型进行综述。
1高通量筛选模型
高通量筛选是以分子细胞水平的实验方法为基础，以微型板为实验工具载体，以自动化操作系统执行实验过程，以灵敏快速的检测仪器采集实验数据，以计算机对实验获得的数据进行分析处理，同时对数以万计的样品进行检测。高通量筛选以其高效、快速的优点，已成为酶抑制剂新药发现的主要手段。酶抑制剂的高通量筛选模型，主要为分子水平的筛选模型，也有少量细胞水平的筛选模型。筛选以酶为作用靶点的药物，不仅要观察酶与药物的结合，更要观察药物对酶活性的影响。根据酶的特点，酶的反应底物和产物都可作为检测指标[2]。以酶为作用靶点的高通量检测方法，绝大多数是直接检测酶的活性，主要有基于放射性的方法和基于比色、荧光的方法两大类[3]。
曹鸿鹏等[4]采用荧光分析法建立了流感病毒神经氨酸酶抑制剂的高通量筛选模型，从甲型及乙型流感病毒中制备出神经氨酸酶，以有荧光特性的化合物为酶的底物，利用96孔板建立了适合高通量筛选神经氨酸酶抑制剂的荧光分析法。方法：96孔板中，100μl体系中含有20μmol/L MU-NANA（底物），3μl神经氨酸酶溶液，10μl待测样品溶液，37℃，pH3.5，孵育15min，355/460nm测定荧光强度。
张冉等[5]采用比色法建立了α-葡萄糖苷酶抑制剂的高通量筛选模型。从小肠上段提取α-葡萄糖苷酶，以蔗糖为底物，通过测定体系中葡萄糖的生成量来检测α-葡萄糖苷酶的活性。方法：384孔微板中，20μl体系中含有10μl 酶提取液，30mmol/L的蔗糖5μL，待测样品5μl，37℃，孵育30min，505nm波长下测定吸光度。李婷等[6]也建立了α-葡萄糖苷酶抑制剂的高通量筛选模型。方法：96孔板中，160μl体系含2.5mmol/L和0.2U/mlα-葡萄糖苷酶，37℃，pH7.0，反应15min，400nm波长处测定吸光度。
Vollmer等[7]采用放射法建立了一种以青霉素结合蛋白（PBP）为靶的抗生素的高通量筛选方法。PBP既是糖基转移酶又是肽转移酶，该法是筛选其糖基转移结构域的活性位点上的可结合物。方法：96孔板中加入莫诺霉素混悬液，然后加入3H标记的PBP（细菌膜粗提物）和受试化合物，孵育，过滤去掉非结合的放射性，闪烁计数测得放射性指示PBP与莫诺霉素结合的情况及受试化合物对其的影响。
另外，根据酶的特点，还有一些特殊的方法。肖尚志[8]建立了醛糖还原酶抑制剂的高通量筛选模型。组织贴块法培养大鼠主动脉平滑肌细胞至8～15代时，用胰蛋白酶消化后，接种至24孔板，加入胎牛血清浓度为10%、葡萄糖
酶抑制剂筛选模型研究进展
王振宋洋彭坤
山东阿如拉药物研究开发有限公司，山东济南250101
[摘要]通过查阅文献，综述目前酶抑制剂筛选的主要模型，包括动物模型、高通量筛选模型及固定化酶反应器。并对其应用原理、应用情况及优缺点进行了阐述。
[关键词]酶抑制剂；筛选模型；靶点；验证
[中图分类号]R965.1[文献标识码]A[文章编号]1674-4721（2013）08（a）-0018-03 Research Progress of Screening Model of Enzyme Inhibitor
WANG Zhen SONG Yang PENG Kun
Shandong Arula Pharmaceutical Research&Development Company Limited,Shandong Province,Jinan250101,China [Abstract]After researching relevant literatures,the article summarizes the current main models of enzyme inhibitor including animal model,high throughput screening model,and immobilized enzyme reactor as well as their mechanisms of application,applicable applications,advantages and disadvantages.
[Key words]Enzyme inhibitor;Screening model;Target spot;Confirmation
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浓度为37.5mmol/L的培养液，含药血清20μl，孵育48h 后，收集细胞，离心取上清液，与辅酶NADPH加上足量的底物在一定缓冲体系中反应。由于NADPH为自身含有荧光的物质，故反应后，高效液相色谱367/455nm波长下检测荧光强度便可反映NADPH的消耗情况，从而推算出醛糖还原酶的活性。Hammonds等建立了真核生物拓扑异构酶Ⅱ抑制剂的高通量筛选方法。啤酒酵母菌株经改造后使表达人拓扑异构酶Ⅱα或Ⅱβ。将细胞与受试药物在96孔板上孵育后，在630nm波长处测其吸收度值，从而检测药物对细胞生长情况及酶活性的影响。
高通量筛选模型已成功应用于p56lck激酶、DNA拓扑异构酶、醛糖还原酶、神经氨酸酶、环氧化物水解酶[9]、转谷氨酰胺酶等抑制剂的筛选。
2固定化酶反应器（IMER）
固定化酶是通过物理和化学的方法，将酶固定于特定的载体上制成仍具有催化活性的酶的衍生物。固定化酶不需要高纯度的酶，降低了对酶的需求，对热、有机溶剂和pH的稳定性增加；可以反复长期使用，只需要简单的清洗过程，就可以恢复活性。与溶液中的蛋白质酶解反应相比，固定化的酶具有更高的酶/底物比、更高的酶解效率、更高的稳定性，并能减少酶的自身降解，因此在酶抑制剂的筛选中得到越来越广泛的应用。主要缺点是固定化酶对底物的亲和力略有降低，可能是由于：①酶固定化后，活性中心的氨基酸残基、空间结构和电荷状态发生了变化；②在固定化酶的周围，形成了能对底物产生立体影响的扩散层及静电的相互作用。IMER以阳性药来评价模型的有效性。
2.1α-葡萄糖苷酶抑制剂的固定化酶筛选模型
卢大胜等[10]建立了α-葡萄糖苷酶抑制剂的固定化酶筛选模型。以高脱乙酰度壳聚糖为载体，以三羟甲基磷（THP）为交联剂，将α-葡萄糖苷酶的N端固定，装柱，模拟其在体内小肠壁上的情况。方法：直径0.5cm、长5.5cm 的层析柱中，加入50μl PNPG（0.116mol/L），待测样品，37℃水浴中反应10min，用紫外分光光度计在400nm波长处测定吸收度值。与游离酶相比较，固定化酶筛选模型上的酶由于N端被固定，其空间结构有所制约，从而使与底物的结合受到一定程度的限制，导致其在实验中的活力偏低，但这正是它模拟酶在小肠壁上的情况，所以实验中反映出来的数据更接近于体内。该固定化酶筛选模型可重复使用，适合高效、便利、快速的筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂，还可直接在体外评价α-葡萄糖苷酶抑制剂的作用效果，研究一些已知能够治疗糖尿病的天然产物的作用机制。2.2IMER-HPLC
将酶固定到色谱填料上，用装柱的方式制成IMER，与高效液相系统及质谱系统联用，可以进行酶抑制剂混合物的快速筛选。该法将色谱系统的选择性、快速、无破坏性及重现性与IMER的特异性和灵敏性相结合，可以极大的增强检测的灵敏度，且可用于痕量化合物的检测，因此在药物筛选中具有广阔的前景。
Bartolini等[11]采用IMER-HPLC方法建立了人重组体乙酰胆碱酯酶（hrAChE）抑制剂的筛选模型。采用戊二醛为交联剂，将hrAChE固定于12mm×3mm i.d的CIM整体柱：CIM柱经缓冲溶液平衡后，放入10%的戊二醛缓冲液中暗处搅拌6h后，加入hrAChE稀释（1.74U/100μl）反应过夜。加入10ml，0.1mol/L的氰基硼氢酸溶液，25℃反应2h 后用缓冲溶液冲洗。将CIM柱装于合适支持物中即可用于高效液相色谱法，紫外检测器450nm波长处测吸收度。方法：一定浓度的底物单独进样，其峰面积为A0，含一定浓度底物的抑制剂进样，其峰面积记为A i，则酶的百分抑制率为100-（A i/A0×100）。该模型的建立减少了酶的用量，极大地提高了分析速度，实现了酶抑制剂的快速筛选，以及混合物的筛选。
2.3IMER-HPLC-MS/MS
IMER色谱串联质谱，可以直接获得酶的活性信息、碎片信息、结构信息及亲和信息，实现了酶抑制剂的高通量筛选。
Hodgson等[12]建立了腺苷脱氨酶的IMER色谱串联质谱法。采用溶胶-凝胶技术将腺苷脱氨酶固定于毛细管整体柱：DGS加水制成凝胶，加入适当pH的腺苷脱氨酶溶液中，迅速加入40μl多聚腺苷水溶液，充分混合后转入长80cm，内径250μm，外径360μm的聚酰亚胺涂渍的熔融硅管中。封口，pH6.5，陈化5d。将整体柱切为10cm长度作为色谱柱用于高效液相串联质谱进行抑制剂筛选。采用两元泵液相色谱，A泵以底物为流动相，B泵以底物、待筛样品混合物为流动相，总流速保持不变，通过梯度改变两泵的流速比来调整待筛样品的浓度。通过多反应监测模式在线质谱检测，可分别获得产物、底物浓度，根据产物的减少和底物的增加来评价被筛样品对酶活性的影响，通过定量分析还可获得抑制剂的IC50值、K1值和K m值。IMER色谱串联，降低了筛选成本，减少了分析时间，无需色谱分离过程，实现了酶抑制剂的快速筛选以及酶抑制剂混合物的筛选[13]。
IMER已成功应用于多巴胺β-羟化酶、α-葡萄糖苷酶、β-分泌酶、腺苷脱氨酶、苯乙醇胺N-甲基转移酶等抑制剂的筛选。
3动物模型
动物模型是以动物为药物筛选的对象，以动物对药物的反应，证明某些物质的药理作用，评价其药用价值。药物筛选中应用的动物模型通常是动物的病理模型。理想的动物模型应具备的基本条件：病理机制与人类疾病的相似性、病理表现的稳定性和药物作用的可观察性[14]。
由于很多因素会影响与酶靶点作用的化合物的药理作用，在体外对靶分子或细胞作用较强的物质，在体内可能会被迅速降解或经过旁路途径功能的调整而降低或消除活性成分的作用，许多在体外作用强度较高的酶抑制剂活性成分在生物体内可能显示不出理想的作用效果，因此必须通过动物模型进行复筛[15]。
醛糖还原酶抑制剂筛选的动物模型主要有四氧嘧啶诱导模型和链脲佐菌素诱导模型[16]。动物给药后，提取分离血浆中的红细胞，采用分光光度法、柱层析法、荧光法和ELISA等方法测定红细胞中醛糖还原酶的活性。
神经氨酸酶抑制剂筛选通常采用感染了致死性流感病毒的小鼠或雪貂为对象[17]，通过观察不同给药时间药物对致死性、体重减轻及动脉氧饱和度降低的保护作用，评价药物的作用。
4筛选模型的验证
建立药物筛选模型的目的是为了筛选活性化合物，反应化合物所具有的生物活性，因此，对筛选模型能否准确的反应化合物的生物活性，必须进行验证[18]。
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4.1可行性验证
以阳性抑制剂为对照，考察筛选模型对阳性抑制剂的识别能力。一般将该筛选模型获得的阳性抑制剂的IC 50与文献报道相比较，结果一致，该筛选模型才具有实用性[13]。4.2灵敏性验证
一般以信号本底比、信噪比和Z ′因子来进行评价。信号本底比＞3，信噪比＞10，Z ′因子＞0.4，模型才能灵敏的反应样品的活性。对于高通量筛选，Z ′因子＞10才能满足要求[19]。4.3稳定性验证
考察Z ′因子的日内、日间精密度或阳性抑制剂抑制率的日内、日间精密度，以保证筛选结果稳定，在重复试验中能获得一致的结果[19]。5展望
药物筛选是寻找新药的重要途径，建立相应的药物筛选模型是药物筛选的关键环节。高通量筛选模型的出现实现了酶抑制的快速筛选及一药多筛，极大地促进了酶抑制剂筛选的发展。IMER 与色谱系统联用，实现了混合物的快速筛选，使酶抑制剂的筛选又上新的台阶。近年来，随着计算机技术和生物信息学的快速发展，应用计算机虚拟配体技术进行体外药物筛选已经成为一种与高通量筛选互补的实用化工具，筛选过程无需消耗样品和其他实验材料，既省时又经济。另外生物芯片技术的应用，能够在微小的芯片上获得大量的生物活性数据，在药物筛选中显示出巨大的优势。相信随着科学技术的发展，将会有更多的筛选模型用于筛选，极大地缩短新药发现周期。
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（收稿日期：2013-03-28本文编辑：林利利）
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血管紧张素转换酶抑制剂 （ACEI） 【适应症】 ⑴各期慢性高血压，尤其是合并冠心病、糖尿病、心功能不全、肾功能不全与蛋白尿的高血压患者。 ⑵慢性充血性心力衰竭、无症状性心功能不全患者可改善症状、缩小心脏、延长生命。 ⑶急性心肌梗死特别是合并心功能不全的患者，可改善心肌重构、预防心肌梗死复发、改善生存率。 ⑷慢性肾病合并蛋白尿者，可延缓肾功能不全进展，减轻蛋白尿。 ⑸主动脉关闭不全的患者可降低心脏后负荷，延缓心力衰竭的发生。 ⑹肺动脉高压的患者，可降低肺动脉压力。 ⑺对确诊冠心病或心脑血管疾病的高危患者，长期使用ACEI可减少各种心脑血管事件的发生率与死亡率。 【禁忌症】 ⑴严重双侧肾动脉狭窄：可使肾血流急剧下降，导致急性肾衰竭。 ⑵严重主动脉狭窄。 ⑶肥厚型或限制型心肌病。 ⑷严重颈动脉狭窄。 ⑸缩窄性心包炎。 ⑹严重肾功能不全，可诱发急性肾功能不全与高钾血症。 ⑺严重贫血。
⑻中性粒细胞减少症，可诱发骨髓抑制。⑼妊娠、哺乳妇女严禁使用。 ⑽高尿酸性肾结石。 【副作用】 ⑴低血压。 ⑵肾功能衰竭。 ⑶高钾血症。 ⑷干咳。 ⑸味觉减退，口腔溃疡。 ⑹血管神经性水肿：罕见，易出现在用药的早期，部分患者可有先兆表现即眼睑水肿或面部单侧或双侧水肿，一旦出现立即停药。 ⑺发疹。 ⑻蛋白尿，多见于大量使用卡托普利后。 ⑼中性粒细胞减少或缺乏症。 ⑽轻度呼吸困难和（或）哮喘。 ⑾其他：偶有头痛、眩晕、疲乏、恶心、脱发、急性胰腺炎、抗核抗体阳性等。 【血管紧张素转换酶抑制剂代表药物】 1.卡托普利（Captopril,开博通） 【药理与机制】 ①能竞争性抑制血管紧张素转换酶，减少血管紧张素Ⅱ的生成，从而抑制血管收缩，并减少醛固酮的分泌、水钠潴留作用减轻。交感神经系统活性受抑制、心血管重构改善
抑制肿瘤细胞增殖的药物筛选方法 09级生科3班余振洋200900140156 一、【实验原理】 1．关于恶性肿瘤和抗肿瘤药物： 恶性肿瘤是一种常见病，严重威胁着人类的生存质量，被称为人类健康的第一杀手。多年来人类一直在不断的进行抗肿瘤药物的研究，抗肿瘤药物的筛选是整个研究过程中很重要的个环节，而进行药物的筛选首先离不开合理的筛选方法和系统。寻找选择性强、对实体瘤有效的新型抗肿瘤药物，是摆在抗肿瘤药物研究人员面前的重要任务。世界各国对抗肿瘤药物的筛选都非常重视，投入了大量的人力、物力、财力，每年都有大量的化合物(合成药、天然产物和微生物发酵产物)待筛，抗肿瘤药物筛选方法的发展经历了一个探索的过程。 8O年代中期以前，普遍采用的筛选方法是以体内小鼠白血病／淋巴瘤模型P388和L1210为基础的 J，所有化合物在进一步的临床研究之前必须通过这种小鼠肿瘤模型的筛选。即小鼠白血病P388和L1210作为第一轮初筛，能通过第一轮初筛的化合物才能被允许进入第二轮筛选。这种方法有一个很明显的缺陷就是一些在临床上有活性的药物将被筛选掉，无法保证所有具有抗肿瘤作用的药物都能通过筛选。鉴于以前的筛选方法存在较大的缺陷，1985年之后以NCI为首的一些研究单位普遍开始采用针对疾病的筛选方法来代替针对化合物的筛选方法，即放弃体内小鼠筛选，代之为体外代表各种常见实体瘤的人类肿瘤细胞株筛选。这种筛选系统是一种高通量的抗肿瘤筛选体系，其主要优势有两点：其一是多种细胞株初筛有可能筛选出对特殊的人类肿瘤或对特殊组织亚型有活性的物质；其二是这种体外筛选尤其适合于复杂天然产物提取物中有效成份的证实，过去动物筛选需较大量的天然产物，而现在天然产物的需要量就大大减少，可以指导有效成份的进一步分离纯化，使得从天然产物中发现新的抗肿瘤药物更加便利。 2．关于筛选方法： 下面为现阶段较为普遍采用的一些抗肿瘤药物的筛选方法的实验原理。 1）以端粒酶活性为作用靶点筛选抗肿瘤药物 端粒是染色体特殊结构，起着保护染色体的完整和稳定性的作用，端粒酶是一种核糖核蛋白返转录酶，由RNA和蛋白质组成，可以以自身的RNA为模板合成端粒末端。已发现在正常的体细胞和良性肿瘤组织中端粒酶活性是阴性，而在人体恶性肿瘤组织和人的肿瘤细胞株中都表达了很高的活性。因此，认为端粒酶与恶性肿瘤的发生发展有密切的关系，有可能成为肿瘤治疗的靶点。 2）应用快速荧光素测定法筛选抗肿瘤药物 快速荧光素测定法是一种近几年发展起来的应用非常广泛的体外药物敏感性测定方法，其原理为采用一些特殊的荧光染料，对细胞的特定成份进行染色或标记。或通过细胞酶的作用使无荧光性的材料分解或转换为荧光材料，通过测定荧光强度从而测定出活细胞的量。现在普遍采用一种特殊的荧光染 FDAL1u(Fluoreseein diacetate)，在正常情况下它不具有荧光，但当它加人到具有完整细胞膜的肿瘤细胞的营养液中时，由于细胞分泌的水解酶的作用，FDA
昆明医科大学机能学实验报告 实验日期:2015年9月17日 带教教师: 小组成员: 专业班级:临床医学二大班 缺氧实验 一、实验目得 1、复制不同病因导致小鼠缺氧得模型,了解乏氧性,血液性,组织中毒 性缺氧得分类。 2、观察缺氧对呼吸系统,中枢神系统得影响,以及血液颜色变化。 3、了解影响缺氧耐受性得因素。 二、实验原理 分别复制三型缺氧模型,观察缺氧对机体得影响。 三、实验仪器设备 小鼠缺氧瓶(100ml125ml 带塞广口瓶),一氧化碳发生装置广口瓶,恒温水浴箱,5ml 或2ml 刻度吸管,1ml 注射器,酒精灯,剪刀,镊子,钠石灰,甲酸,浓硫酸,5%硝酸钠,0、1%氰化钾,生理盐水。 四、实验方法与步骤 ①取小鼠四只,标记编号(甲,乙,丙,丁) 分别称重记录 甲:NS(0、1ml/10g) 腹腔注射 乙:0、25%水合氯醛(0、1ml/10g) 放进缺氧装置中 丙:1%咖啡因 (0、1ml/10g) 等待10min 每2min 记录呼吸频率 死亡((记录时间及耗氧量,甲鼠尸体待留)→计算耗氧量 观察皮肤颜色,活动度 丁:放入缺氧装置,40℃水浴锅放入装小鼠缺氧瓶,记录死亡时间,活动状态以及耗氧量 ②一氧化碳中毒性缺氧(小鼠一只):检查装置气密性 ,连接一氧化碳发生装置 , 将一只小鼠放入广口瓶,然后与一氧化碳发生装置连接;先取甲酸1、5ml 放入试管内,再加入浓硫酸1ml 。 连接 加热试管(用酒精得间断加热,加速CO 产生,不可使液体沸腾) 观察记录一般状况* 观察记录如下: 死亡(记录时间), 计算小鼠耗氧率(R)* 3、亚硝酸中毒缺氧(小鼠一只) 观察记录一般状况 小鼠:腹腔注射*5%亚硝酸钠0、3ml 观察记录如下: 死亡(记录时间),计算小鼠耗氧率(R)* 4、取出甲鼠及2,3实验小鼠尸体部分肝叶进行对比,记录颜色。 五、实验结果
抗癌药物的研究与发展 陆志红罗伯特·巴.·戴安修 美国伯明翰阿拉巴马大学药理与毒理学系、临床药理学部癌症是当今世界上大多数国家的主要死因之一。尽管到目前为止已有数十种化疗或辅助抗癌药物可以用于临床治疗，但大多数药物只能使病情缓解，无法达到治愈的目的。虽然一些儿童的癌症或成人皮肤肿瘤有治愈或长期缓解的可能，但大多数死亡率很高而又很常见的癌症如胃癌、食道癌、肺癌等仍缺乏有效的抗癌药物。近年来，各国都在抗癌药物的研究与发展上投入了大量的人力、物力，希望在不久的将来能有所突破。本章就抗癌药物的研究与发展的分子生物学基础、药物的筛选与评价以及非临床研究和临床试验的特点作一综述，以帮助读者对这一领域的进展有所了解。 第一节抗癌药物研究的分子生物学基础 抗癌药物研究的依据是人们对癌症生物学的理解。早期人们对于癌症的了解限于细胞水平，所以大多数药物的发展着眼于细胞分裂分化和免疫等环节。近年来，肿瘤生物学的进展非常迅速，人们对癌症的了解深入到了分子水平，比如癌基因的发现，细胞凋亡学说的形成，肿瘤抑制基因的发现等为抗癌药物的研究与发展提供了新的分子生物学基础。以下简述这些方面的研究进展。 一、细胞分裂 自50年代，人们认为肿瘤细胞比正常细胞分裂快，并应用这一概念发展了一系列的抗癌药物用于干扰或阻止细胞的分裂。主要包括破坏细胞脱氧核糖核酸（DNA）以及蛋白
质代谢的药物。比如烷化剂（Alkylating Agents），DNA拓扑异构酶抑制剂（Topoisomerase Inhibitors）以及抗生素类（Antibiotics）。通过对细胞周期的仔细研究，现在我们知道肿瘤细胞并不比正常细胞分裂得快，只是在任何时间都有较高比例的肿瘤细胞处于分裂期。 二、细胞增殖周期调控中国医药资讯网https://www.doczj.com/doc/f76848087.html, 因为肿瘤细胞失去了正常细胞的控制机制，在癌组织中的细胞更倾向处于细胞分裂期。根据这一理论，许多抗癌药物作用于处于分裂期的细胞。如抑制DNA合成的抗代谢药物（Antimetabolites）和抑制微小管有丝分裂形成的微小管蛋白结合剂（Tubulin—Binding Atents）就是根据此概念发展而来的。 三、肿瘤抗原 研究表明某些癌症组织在免疫学上不同于正常细胞，癌症细胞在一定程度上是“异物”，或者是去分化的细胞，且可能存在特异的肿瘤抗原，这一发现是肿瘤免疫治疗的基础。根据这一概念，人们试图用各种特异及非特异的方法，提高人体对肿瘤的免疫功能。比如用细胞毒性免疫细胞、单克隆抗体、细胞因子（Cytokins）以及核受体结合剂（VitaminD3 、Retinoids）等治疗癌症。 四、癌基因及其活化 80年代以来的研究发现，在某些肿瘤细胞中，一些癌基因被激活。若能抑制癌基因的激活，应可治疗癌症。例如研究发现ras癌基因蛋白的激活需要farnesyl蛋白转移酶的存在，因此farnesyl蛋白转移酶抑制剂被发展成为抗癌药物。另外，许多人类肿瘤，如膀
\篇二：缺氧 缺氧动物模型复制及中枢神经系统功能抑制和低温对缺氧的影响 【摘要】目的：本实验学习复制乏氧性缺氧和血液性缺氧的动物模型方法，观察缺氧过程中呼吸的反应及血液色泽和全身一般情况的变化，并了解温度和中枢神经系统机能状态对缺氧耐受的影响以及对照实验和控制实验条件重要性。方法：通过复制缺氧动物模型，观察不同类型缺氧过程中呼吸、黏膜和血液色泽的变化。通过测定耗氧量和小鼠的存活时间来观察中枢神经系统机能抑制和低温对缺氧的影响。结果：中枢神经系统功能抑制和低温对动物耐受缺氧的影响与对照组相比，存活时间和总耗氧率有显著性差异；复制不同原因造成的不同缺氧类型小鼠都表现出了不同的呼吸频率和存活时间的变化。结论：给小鼠注射氯丙嗪、冰浴降温可显著降低总耗氧率，延长其存活时间（p<0.01）。co中毒、亚硝酸盐可显著缩短小鼠存活时间，降低呼吸频率。美兰可以缓解亚硝酸盐对小鼠的作用，已定程度延长小鼠存活时间，延缓呼吸频率的下降。 【关键词】缺氧氯丙嗪总耗氧率 co 亚硝酸盐美兰存活时间 当供应组织的氧不足，或组织利用氧障碍时，机体的机能和代谢可发生异常变化，这种病理过程称为缺氧。根据缺氧的原因不同可将缺氧分为低张性缺氧、血液性缺氧、循环性缺氧和组织中毒性缺氧四种类型，不同类型的缺氧，机体的代偿适应性反应和症状表现有所不同。 1.材料和方法 1.1实验动物：小白鼠（雌性）。 1.2 药品：氯丙嗪(chlorpromazine) 、钠石灰（soda lime)，亚硝酸钠（ sodium nitrite ) 、亚甲基蓝(美蓝）（methylene blue，mb）、 0.9％nacl (physiological saline solution) 、co(carbon monoxide)。 1.3 器材：100、500ml广口瓶和测耗氧装置。 1.4 方法 1.4.1 中枢神经系统功能抑制和低温对缺氧的影响 取2只性别相同体重相近的小鼠，准确称取体重，并随机分为生理盐水组和氯丙嗪组。氯丙嗪组按0.1ml/10g体重腹腔注射0.25％氯丙嗪，随即安放在冰浴的纱布上 10~15min，使呼吸频率降至70~80次/min；生理盐水组按0.1ml/10g体重腹腔注射生理盐水，室温放置10－15min，作为对照。之后将2只小鼠分别放入100ml的广口瓶内，连接好测耗氧装置。如右图。 1.4.2 不同原因造成的缺氧 取2只性别相同体重相近的小鼠随机分为乏氧性缺氧组和一氧化碳中毒组。乏氧性缺氧组小鼠放入含有5g钠石灰的100ml密闭瓶中；一氧化碳中毒组小鼠放入500ml密闭瓶，注入10ml co气体。 另取2只性别相同体重相近的小鼠随机分为亚硝酸纳组和亚硝酸纳治疗组。亚硝酸纳组小鼠腹腔注射50g/l亚硝酸纳0.2ml，并随即腹腔注射生理盐水0.2ml；亚硝酸纳治疗组小鼠腹腔注射50g/l亚硝酸纳0.2ml后即刻腹腔注射10g/l亚甲基蓝0.2ml 。 2.观察项目 2.1 中枢神经系统功能抑制和低温对缺氧的影响 记录下小鼠的体重w（g）。从密闭测耗氧装置开始记时到小鼠死亡，分别观察氯丙嗪组和生理盐水组小鼠的存活时间t（min）、总耗氧量a（ml）。按以下公式计算出总耗氧率r[ml/（g·min）]： r[ml/（g·min）]= a（ml）÷w（g）÷t（min） 2.2 不同原因造成的缺氧 乏氧性缺氧组和一氧化碳中毒组：处理前分别测出两鼠的正常呼吸频率（次/min）。待塞
谷胱甘肽转移酶（GST） 还原型谷胱甘肽占绝大多数。 谷胱甘肽转移酶 (GST) 是广泛分布于哺乳动物、植物、鸟类、昆虫、寄生虫及微生物体内的一组多功能同工酶。GST是由23-29KDa的不同亚基构成的同源二聚体，每一类GST同工酶中组成的亚基种类有多种，因此编码GST同工酶的基因是一个巨大的超基因家族。 GST主要功能是催化某些内源性或外来有害物质(过氧化物、α, β2不饱和醛酮、烷基或芳香基化合物)的亲电子基团与还原型谷胱甘肽的巯基偶联，增加其疏水性使其易于穿越细胞膜，分解后排出体外，从而达到解毒的目的，有抑制细胞癌变的功能。 通常认为，谷胱甘肽转移酶的作用是催化谷胱甘肽与外来的或内在的有害物质亲电结合排出体外而起到解毒的作用，但是对于治疗癌症药物的研究主要是针对能够抑制谷胱甘肽转移酶（GST）活性的酶抑制剂，而不是GST催化解毒作用。 研究表明，GST的酶活性水平与肿瘤的耐药性密切相关心。因此，GST可能是治疗耐药肿瘤的潜在药物作用靶点。 与GSTs相关疾病有：人类癌症包括胃癌，结肠癌，胰腺癌和肺癌动脉粥样硬化和冠心病。 近年来对GST抑制剂的研究越来越多，研究报道的GST抑制剂主要有：依他尼酸（EA）及其类似物、TLK199及其类似物、黄酮类化合物、双功能基化合物，还有其他一些抗虐药物如乙嘧啶和奎尼丁等等。 抗肿瘤药物与GSH作用模式图：
图中GST-∏是人体内一种Ⅱ相代谢酶，其对肿瘤的耐药作用主要由其解毒功能引起， 其作用机制：①催化谷胱苷肽(GSH)与亲电子药物如各种烷化剂结合，增加其水溶性，加速其排泄而使药效减低；②清除葸环类药物等产生的自由基，减轻药物自由基对细胞的损伤； ③通过直接与药物结合的形式降低药物活性等。 机理解释：图中是一个肿瘤细胞，当治疗肿瘤的药物顺铂进入细胞时，GST就会催化谷胱甘肽GSH与顺铂结合而将其排出体外，所以为了加强药效，就需要使GST的功能受到抑制，GST 抑制剂占据GST酶活性位点，使GST无法催化GSH与顺铂结合，这样就会降低抗肿瘤药物的耐药性。 筛选方法： 方法一：比色法 在该酶的抑制剂筛选中，采用比色法直接测定底物浓度，主要依据产物有紫外或可见光的特征吸收，通过测定反应体系的OD值变化，测定酶和抑制剂的活性。 实验原理：1-氯-2,4-二硝基苯（CDNB）与谷胱甘肽（GSH）在谷胱甘肽转移酶(GST)的作用下生成复合物CDNB-SG,该化合物在340nm 下呈现最大的光吸收值，根据加入样品前后酶活性的变化情况测定样品对GST的抑制活性。 实验材料： 试剂：还原型谷胱甘肽；1-氯-2,4-二硝基苯（CDNB）；次氯酸钠溶液；待筛选样品。 仪器：SpectraMax M5 型连续光谱酶标测试仪；Costar 384孔微板。
缺氧的类型及影响缺氧耐受性的因素 高伟飞 （浙江中医药大学滨江学院10级临床专业临滨1班4组20102090114） 一、实验目的： 1.观察原因和条件在疾病发生发展中的作用 2.复制几种类型缺氧的模型，观察血液颜色的特点，分析其机制 根据大纲要求： 掌握概念：缺氧、低张性缺氧、血液性缺氧、循环性缺氧和组织性缺氧，紫绀、肠源性紫绀。 熟悉并理解原因和条件在疾病发生发展中的作用。 熟悉反映血氧情况的一些指标(氧分压、氧含量、氧容量、氧饱和度，动静脉血氧含量差)。 掌握各型缺氧发生的原因及主要发病机制，掌握各型缺氧的特征（血氧变化的特点和皮肤黏膜颜色变化）。 二、实验原理： 当组织供应组织的氧不足，或组织利用氧障碍时，机体的机能和代谢可发生异常变化，这种病理过程称为缺氧。不同类型的缺氧，其机体的代偿适应性反应和症状也不同。根据缺氧原因不同可将缺氧分为乏氧性缺氧、血液性缺氧、循环性缺氧和组织中毒性缺氧四种类型。 影响机体对缺氧耐受性的因素很多，如年龄、机体的代谢、功能状况以及锻炼适应等。本实验才缺氧的不同环节入手观察呼吸变化及皮肤黏膜的颜色改变。实验通过动物的不同代谢状况、中枢神经系统功能和动物所处环境温度，观察动物的缺氧耐受性。 三、实验对象：小鼠 四、实验材料：电子秤、注射器、钠石灰、广口瓶、测耗氧量装置、剪刀、镊子、滤纸；生理盐水、美兰亚硝酸钠、氯丙嗪、冰块、量筒等 五、实验方法： 1、取2只小鼠，注射及处理： 1号：亚硝酸钠及美兰0.2ml ，左下腹注射 2号：亚硝酸钠及生理盐水各0.2ml ，左下腹注射 注射完，观察，2号小鼠立即死亡，1号小鼠仍存活；然后处死解剖，剪下一片肝脏组
血管紧张素转化酶（ACE）抑制剂 一．发展历史 ACEI 是20世纪80年代发展起来的一类新型抗高血压和抗充血性心力衰竭药，并在抗高血压药作用途径方面取得了突破，WHO 于1993年建议将其作为治疗轻度高血压的首选药物。 1970年，巴西科学家从涉毒中分离出多种可抑制血管紧张素转换酶（ACE）的物质，同年研制出首个ACEI并命名为卡托普利，于1981年在美国上市；1976年，日本药物学家从酞嗓系列诱导体中筛选出第2代ACEI药物依那普利，并于1984年在德国上市。之后ACEI的研究发展迅速，上市新药近百种，用于临床达20种。 二．作用机制与结构特点 1、肾素-血管紧张素（RAS）是人体调节血压的重要激素系统。当血压降低时，肾脏分泌肾素，血管紧张素原在肾素催化作用下水解产生血管紧张素I（AngI），AngI经ACE作用而形成血管紧张素Ⅱ（Ang Ⅱ）。Ang Ⅱ具有很强的收缩血管活性，使血压升高；Ang Ⅱ也能刺激肾上腺皮质分泌醛固酮（ALD），ALD 能促进肾脏对水和钠离子的重吸收，增加体液容量，升高血压。 2、ACEI通过与ACE活性部分的锌匹配体结合而发挥作用，根据其结合基团可分为三类①以巯基结合，如卡托普利；②以膦酸基结合，如福辛普利；③以羧基结合，如依那普利。ACEI能竞争性阻断AngⅠ转化为Ang Ⅱ，从而降低循环和局部AngⅡ的
水平。ACEI可增加缓激肽水平，同时可增加一氧化氮（NO）和有血管活性的前列腺素（前列环素和前列腺素E2）的释放。ACEI 还能阻断Ang1~7的降解，使其水平增加，通过加强刺激Ang1~7受体来进一步起到扩张血管及抗增生的作用。 三、药理作用及临床用途 降低血压 1、抑制RAS：ACEI对血浆中的RAS有直接抑制作用，通过抑制血管紧张素转化酶（ACE）的活性，使血浆中的AngⅡ浓度降低，对抗AngⅡ的缩血管作用。在人体的肾脏、脑、心脏扥局部组织中也存在血管紧张素受体，局部组织的RAS对血管紧张度的调控起重要作用，ACEI对组织中的ACE也有抑制作用，是血压平稳下降的重要环节。 2、降低交感神经兴奋性：AngⅡ可促进肾上腺素能神经末梢释放去甲肾上腺素（NE），ACEI通过降低AngⅡ水平，使交感神经兴奋性下降，减少NE的合成和释放，使血管舒张，血压下降。抑制缓激肽的降解：ACE是一种激肽酶，可降解缓激肽，缓激肽具有较强的扩血管作用。ACEI抑制ACE活性，使缓激肽降解减少，从而保留其扩长血管作用。 3、减少ALD分泌：ACEI通过减少AngⅡ对靶器官的作用，使ALD释放减少，减轻水钠潴留，有利于降低血压，减轻心脏负荷。因为ACEI在扩张血管、减少外周阻力、调节体液平衡方面的明显效果，使其成为临床一线抗高血压药物。ACEI可用于轻、
实验三实验性缺氧 【实验目的】 1.掌握各型（低张性和血液性）缺氧动物模型复制的方法，了解缺氧的分类。 2.观察不同类型缺氧时机体的变化（活动状况、呼吸、粘膜及肝脏的颜色）及存活时间； 3.观察不同年龄和中枢兴奋状态对机体缺氧耐受性的影响，理解条件因素在缺氧发病中的重要性。 4.掌握各型缺氧的发生机制及特点。 5.了解常见血液性缺氧的解救措施。 【实验原理】 导致低张性缺氧最常见的原因包括吸入气氧分压过低和外呼吸功能障碍。本实验将小鼠放置于加入钠石灰的密闭广口瓶内，随着小鼠的呼吸消耗，广口瓶中氧气含量逐渐降低，模拟外环境氧分压过低引起的低张性缺氧。观察低张性缺氧时机体的变化（活动状况、呼吸、粘膜及肝脏的颜色）及存活时间。 影响机体对缺氧耐受性的因素很多，除缺氧时间、速度、类型和程度外，还与缺氧时中枢功能状态和年龄等因素有关。本实验通过应用药物改变小鼠的中枢兴奋状态及选择不同年龄的小鼠，观察不同条件下低张性缺氧小鼠的活动状况和存活时间。 血液性缺氧是由于血红蛋白的数量减少或性质改变从而降低血液携氧能力或血红蛋白结合的氧不易释出所引起的缺氧。本实验将复制两种常见血液性缺氧模型：一氧化碳中毒和亚硝酸盐中毒引起的血液性缺氧。一氧化碳可与血红蛋白结合，形成碳氧血红蛋白而失去结合氧的能力，从而导致血液携氧能力降低而引起机体缺氧。亚硝酸钠是强氧化剂，可使血红蛋白分子内二价Fe2+氧化成为三价Fe3+而形成高铁血红蛋白，高铁血红蛋白同样失去携氧能力而引起血液性缺氧。【实验对象】 成年小鼠（性别、年龄、体重近似、雌雄不拘）、新生小鼠 【实验药品和器材】 3.75%尼可刹米、0.25%氯丙嗪、生理盐水、钠石灰、5%亚硝酸钠、1%亚甲兰、浓硫酸、草酸。 缺氧瓶带气压平衡装置、耗氧量测定装置（图1）、1 ml注射器、5 ml注射器、电子天平、纱布、滤纸、眼科剪、眼科镊、小烧杯、酒精灯、火柴、CO发生装置（图2）、气囊袋。 【实验步骤】
酶抑制剂类抗糖尿病药物的分子水平筛选方法研究进展 张海枝，刘鹏，李川，刘长鹰 天津药物研究院天津市新药设计与发现重点实验室，天津 300193 摘 要：酶抑制剂类抗糖尿病药物是目前药物研究的热点，而药物筛选技术是制约此类抗糖尿病新药研发速度的关键步骤。主要从分子水平总结近年来报道的与糖尿病相关的酶抑制剂类候选药物的筛选方法，包括传统方法和前沿方法，着重介绍极具潜力的毛细管电泳法、质谱法、生物传感法和微通道筛选方法等。 关键词：抗糖尿病药物；酶抑制剂；分子水平；药物筛选方法 中图分类号：R977.3 文献标志码：A 文章编号：1674 - 5515(2014)08 - 0947 - 06 DOI: 10.7501/j.issn.1674-5515.2014.08.028 Research progress on drug screening methods at the molecular level for enzyme inhibitors used as anti-diabetic drugs ZHANG Hai-zhi, LIU Peng, LI Chuan, LIU Chang-ying Tianjin Key Laboratory of Molecular Design and Drug Discovery, Tianjin Institute of Pharmaceutical Research, Tianjin 300193, China Abstract: Various enzyme inhibitors have been demonstrated to be a hotspot in the research area of anti-diabetic drugs, whose development has been greatly limited by the efficiency of diverse drug screening methods. This paper concerns on different types of drug screening methods in the molecular level for enzyme inhibitors used in diabete treatment, including both traditional and advanced methods. Importantly, several screening methods with great potential have been emphasized here, such as capillary electrophoresis, mass spectrometry, biosensors, screening methods based on microchannel and so on. Key words: anti-diabetic drugs; enzyme inhibitors; molecular level; drug screening methods 糖尿病是全世界发病率最高的疾病之一，是一种与胰岛素产生和作用异常相关、以高血糖为主要特征的代谢性疾病。现有报道证实，体内参与血糖调节的多种酶已经成为抗糖尿病药物作用的关键靶点，可为研制治疗糖尿病的药物提供新途径。以靶标酶为作用对象的酶抑制剂可有效抑制血糖的升高，减缓糖尿病并发症的发生和发展，是抗糖尿病药物研发的希望所在[1-2]。目前报道的可用于治疗糖尿病的酶抑制剂包括α-葡萄糖苷酶抑制剂、醛糖还原酶（AR）抑制剂、一氧化氮合酶（NOS）抑制剂、血管紧张素转换酶（ACE）抑制剂、基质金属蛋白酶（MMPs）抑制剂、蛋白质酪氨酸磷酸酶1B （PTP-1B）抑制剂、果糖-1,6-二磷酸酶抑制剂、磷酸二酯酶（PDE）抑制剂、环氧酶-2（COX-2）抑制剂、二肽基肽酶-Ⅳ（DPP-Ⅳ）抑制剂等[3]。 近年来，组合化学的快速发展已经解决了酶抑制剂类候选药物的大批量合成问题，而如何快速高效准确地筛选出此类抗糖尿病新药是药物研发中的关键难题。现有报道中关于酶抑制剂类候选药物的筛选方法较多，根据所选用的材料和药物作用的对象以及操作特点，可将这些方法大致分为4个水平：整体动物水平、组织器官水平、细胞水平和分子水平。其中，基于分子水平的酶抑制剂类药物筛选方法具有反应体积小、筛选速度快、药物作用机制明确，可实现大规模筛选等优点，在药物筛选方面具有广阔的应用前景。基于此，本文详细综述了酶抑制剂类抗糖尿病药物的分子水平筛选方法，力图为此类药物的高通量筛选提供借鉴和参考，以期提高抗糖尿病新药的研发速度。目前文献中报道的与糖尿病相关的酶抑制剂类药物分子水平筛选方法主要 收稿日期：2014-06-28 作者简介：张海枝（1985—），女，湖北黄冈市人，博士，助理研究员，研究方向为分析化学。Tel: (022)23006859 E-mail: zhanghz@https://www.doczj.com/doc/f76848087.html,
血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)通过抑制血管紧张素n生成、阻断肾素一血管紧张素·醛固酮系统作用，及抑制缓激肤降解、增强缓激肚效应，而广泛应用于肾脏病治疗。为了更合理、安全地应用这类药物，全国部分肾病专家于2004年4月24日在北京进行了专题研讨，对《血管紧张素转换酶抑制剂在肾脏病中正确应用的专家建议》进行了第2次修订，经充分讨论，会议达成如下共识。 一、适应证 1.降低系统高血压:持续性高血压促进肾损害进展，引起严重心、脑血管并发症。对肾脏病患者合并的高血压(包括原发性高血压及肾实质性高血压)应积极治疗，并力争达标。尿蛋白<1 g/d时，血压应降达130/80 mmHg(平均动脉压97 mmHg );尿蛋白>1 g/d时，血压应降达125/75 mmHg(平均动脉压92 mmHg )，其中收缩压治疗达标尤其重要。此时，ACEI(或血管紧张素11受体拮抗剂，ARB)应为首选降压药。 2.减少尿蛋白排泄:蛋白尿、尤其大量蛋白尿有不少危害，并能促进肾损害进展，应积极治疗。ACEI能通过多种机制如改善肾小球内高压、高灌注及高滤过，及改善肾小球滤过膜选择通透性而减少尿蛋白排泄。蛋白尿较重时ACEI降尿蛋白效果往往更显著，应尽量将尿蛋白减少至正常或最低水平。 3.延缓肾损害进展:ACEI除能通过上述作用保护肾脏外，还能通过减少肾脏细胞外基质蓄积(减少产生，促进降解)，拮抗肾小球硬化及肾间质纤维化而延缓肾损害进展。 ACEI针对上述第2,3适应症发挥的疗效，部分为非血压依赖性效应，因此，这两个适应症对无高血压的肾脏病患者也适用。 糖尿病患者(包括1型及2型)应从尿白蛋白排泄率增高开始即应用ACEI 上述各适应症疗效已被许多临床循证医学试验验证。 二、使用方法 ACEI类药均需从低剂量开始应用，然后逐渐加量至起效，老年人尤应如此，避免降血压过度。 1.降低高血压:若非血压极高需迅速降压，一般宜首选长效ACEI治疗。 为了有效降压，ACEI常需与其它降压药物配伍应用，一般常需3种或更多种降压药联合应用才能有效控制血压。联合用药常首选用小剂量利尿剂(肌醉清除率>25ml/min时可用唆嗦类利尿药，<25 ml/min时用拌利尿剂，排钠利尿可提高AC降压疗效，但必须小量使用，勿导致脱水)。若降压效果不满意，可再加钙通道阻滞剂(包括双氢毗陡及非双氢毗r}类)、p受体阻断剂或a及p受体阻断剂(心率慢者不用)，以及其它种类降压药。血管紧张素n受体拮抗剂也可与ACEI联合应用。 用ACEI降血压时，需限制食盐人量。 2.减少尿蛋白及延缓肾损害进展:为有效减少尿蛋白排泄及延缓肾损害进展，ACEI常需较大剂量(比降血压 所需用量大)，或联合应用血管紧张素11受体拮抗剂，且 用药时间要久(常需数年)，同时应限制饮食中蛋白质及 盐摄人量。 三、副作用 1.咳嗽:此可能与激肤酶被抑制相关，血中缓激肚、前列腺素及P物质浓度增高引发咳嗽。严重者应停ACEI，改用血管紧张素11受体拮抗剂。 2.血清肌醉增高:用药头两个月血清肌醉( Scr)可轻度上升(升幅<30% )，为正常反应，勿停药;但是，如果用药过程中Sc:上升过高(升幅>30%.-50% )，则为异常反应，提示肾缺血。出现后一情况时应停用ACEI，并努力寻找肾缺血病因设法解除，假若肾缺血能被纠正且Scr恢复正常，则可再用ACEI，否则，不宜再用。
抗肿瘤药物体内筛选标准操作规程概述： 抗肿瘤药物是指能够直接杀伤或抑制肿瘤细胞生长或增殖的一类药物，作用机制包括抑制肿瘤细胞核酸或蛋白质的合成、干扰大分子物质代谢、干扰微管系统、抑制拓扑异构酶等。 本操作规程包括与抗肿瘤药物申请临床试验和申请上市有关的非临床有效性和安全性研究的内容，其中着力强调非临床有效性和安全性之间的关联性，以及非临床研究和临床试验之间的关联性。旨在一方面为抗肿瘤药物的非临床研究提供技术参考；另一方面，通过技术要求引导科学有序的研发过程，使国内此类药物的研发更趋规范和合理。 本操作规程仅代表目前对抗肿瘤药物非临床研究的一般性认识。具体药物的非临床研究应在本指导原则的基础上，根据药物的自身特点制订研究方案。 研究目的： 建立一套包括抗肿瘤药物体内作用的药效学研究和评价体系及相应的标准操作规程以 及抗肿瘤药物安全性和作用新机制的研究。 ①有效性研究 抗肿瘤药物有效性研究的目的主要在于探索受试物的作用机制、作用强度、抗瘤谱等，为之后的安全性评价以及临床试验中适应症、给药方案的选择提参考信息。 ②安全性评价 安全性评价的目的主要包括：（1）估算 I 期临床试验的起始剂量；（2）预测药物的毒性靶器官或靶组织；（3）预测药物毒性的性质、程度和可逆性；（4）为临床试验方案的制订提供参考。 研究计划： (a)小鼠急性毒性测试
按照急性毒性测试的常规方法，选用昆明种小鼠，通过腹腔注射方式给药，测定体外抗肿瘤活性突出的化合物的半数致死量（LD50），参考给药小鼠体重变化情况，评价化合物的急性毒性，并确定小鼠体内抗肿瘤活性测试的给药剂量。 (b)小鼠体内抗肿瘤活性测试 根据动物体内抗肿瘤活性测试的标准方法，选用昆明种小鼠，皮下接种肉瘤S180或肺癌H22瘤株，选择体外活性突出且急性毒性较低的化合物，设定合适的剂量通过腹腔注射方式给药，以临床常用抗肿瘤药物环磷酰胺作为阳性对照药物，测定肿瘤生长抑制作为体内活性评价指标。 (c)专利保护范围内的化合物的继续合成 申请保护范围较大的专利，合成部分可能具有良好活性的新的化合物，拓展研究范围，发现活性更强的化合物，并申请新的发明专利。并可针对具体化合物申请从属专利，延长高活性化合物的保护期限。 （d）体外抗肿瘤活性的广泛筛选 采用MTT法或台盼蓝染色法，测定化合物对多种人肿瘤细胞株的增殖抑制活性，确定化合物在不同瘤株间抗肿瘤活性的选择性，为裸鼠模型实验提供依据。 （e）抗肿瘤作用机理的深入研究 根据抗肿瘤（f）人癌裸鼠移植瘤模型实验活性化合物作用机理特征，选用微管蛋白聚合等实验从分子水平确认化合物的作用机理；利用人脐静脉血管内皮细胞探讨化合物对内皮细胞骨架的影响及诱导凋亡的途经，从细胞水平上阐明化合物的作用机理。 根据抗肿瘤新药审批办法的要求，采用裸小鼠皮下接种模型和/或原位移植瘤模型，以相对肿瘤增值率和生存时间为指标，确定化合物的抗肿瘤活性。 （g）动物体内药物代谢动力学实验
血管生成实验模型研究进展 吴家明1 ,陆 茵 1,2 ,郜 明1,张伟伟 1 (1.南京中医药大学中医药研究院,江苏南京 210029;2.江苏省方剂研究重点实验室,江苏南京 210029) 收稿日期:2007-09-21,修回日期:2007-11-01 基金项目:国家自然科学基金资助项目(No 30371727,30772766);江 苏省自然科学基金资助项目(No BK2003113) 作者简介:吴家明(1980-),男,硕士生,研究方向:肿瘤血管生成与 抗肿瘤转移研究,E 2mail:nj w ujia m ing@https://www.doczj.com/doc/f76848087.html,; 陆 茵(1963-),女,教授,博士生导师,研究方向:肿瘤血管生成与抗肿瘤转移研究,通讯作者,Tel:0252 86798154,E 2mail:luyingreen@https://www.doczj.com/doc/f76848087.html, 中国图书分类号:R 205;R 332;R 3632332;R 36413 文献标识码:A 文章编号:1001-1978(2008)01-0011-04摘要:抗血管生成已经成为治疗肿瘤转移、糖尿病视网膜病变、风湿性关节炎等疾病的重要策略之一。血管生成模型作为一种研究工具在探讨血管形成机制、发现促进或抑制血管生成药物等研究中发挥十分积极的作用。如何寻找适合的血管生成模型是研究人员在研究中常遇到的问题。该文就主要常用模型做较全面的介绍,并对其优缺点进行评价。关键词:血管生成;模型 血管生成(angi ogenesis )是指在原有的毛细血管和(或)微静脉基础上通过血管内皮细胞的迁移和增殖,从已存在的血管处以芽生或非芽生(套迭)形式形成新的、以毛细血管为主的血管系统过程 [1] 。血管生成是许多促进或抑制血管 生成的分子参与调节的一个平衡过程[2]。血管生成过多与肿瘤、糖尿病性视网膜病变等疾病有关[3],抑制血管生成已经成为治疗这些疾病的重要策略。因此寻找血管生成抑制剂成为研究热点。血管生成研究需借助血管生成模型进行,血管形成的许多过程都可以在血管生成模型中模拟完成,包括内皮细胞增殖、迁移、毛细血管网状结构的形成等。本文就常用体内、体外及整体模型进行综述。 1 体外模型 体外模型主要分为细胞水平及组织学水平两类,常用的体外模型有以下4种。 1.1 内皮细胞增殖实验(cell proli fera ti on a ss ay) 内皮细 胞活化增殖是血管生成的起始阶段。目前主要有两种测定细胞增殖的方法即净细胞数测定和细胞周期分析。 1.1.1 净细胞数测定 M TT 法(四甲基偶氮唑比色法)是 测定活细胞数的化学定量方法,操作简便,价格低廉。但它不适合测定对细胞代谢有影响的药物,因为这类药物能影响 MTT 测定的活细胞数。另外通过胸腺嘧啶核苷参入法测定DNA 合成来测定细胞增殖能力。抑制细胞增殖可能是由于 药物的抑制作用,也可能是药物的毒性作用引起。因此,这种方法常需要结合细胞凋亡实验的数据才可以更好地评价药物对细胞增殖的影响。 1.1.2 细胞周期分析 近年来有报道通过细胞周期分析来 评价药物对细胞增殖的影响,细胞短时间暴露到溴脱氧尿苷 (B rd U )中可以促使B rdU 参入细胞DNA 中。碘化丙啶(P I ) 染色后测定细胞的总DNA 量,再用荧光激活细胞分析仪测定细胞中B rd U 和P I 的量可得出细胞周期信息[4]。但实验用的内皮细胞处于增殖状态,与体内静止状态的内皮细胞是不同的,实验结果与体内还是存在一定差异。 1.2 内皮细胞迁移实验(cell m i gra ti on a ss ay) 常用迁移 模型有两种:①细胞损伤模型:在培养血管内皮细胞的培养皿上用刀片划出#形区,经P BS 洗涤后再用含011%明胶的 ME M 培养20h,细胞用甲醇固定,Gie m sa 染色。在光镜下计 数从损伤边缘迁移出的细胞数,需要注意的是划出的损伤区域一定要精确。②Boyden 室模型,Boyden 室由两层组成,两层之间为胶原包被的多孔的多聚碳酸盐滤膜;血管内皮细胞放于上层,同时加入待测药物,共同培养6h 后,除去上层的细胞,下层细胞用甲醇固定,HE 染色,光镜下计算下层的血管内皮细胞数。龙淼云等[5]采用本模型研究证明了血管生成抑制因子arresten 对huvec 迁移有抑制作用。Boyden 室模型优点在于它对药物浓度梯度差异很敏感。但对实验技术要求较高且计数方法不同可能会造成统计结果误差较大。因此有必要建立一个严格的计数标准以减少因方法不同产生的误差。 1.3 小管形成实验(tube for ma ti on a ss ay) 小管形成实验 能模拟人体内毛细血管生成的过程,包括内皮细胞出芽增殖和毛细血管网结构形成等步骤,接近人体内血管生成的实际过程。内皮细胞在基质胶、纤维蛋白胶、胶原等基质上培养时能形成网状结构。用电子显微镜来分析小管间的紧密连接,从而定量血管生成情况[6]。需要指出的是似乎所有的内皮细胞都能在细胞外基质上形成管状结构,有些非内皮细胞也能在基质胶上形成管腔结构[7]。实验一般采用24孔培养板,但它底面积大,Matrigel 用量多,计数区域大只能随机选择几个典型区域且数据分析耗时长。Sanz 等[8]采用384孔和1536孔培养板培养可节约胶的用量,借助计算机可以计算整个孔的小管及小管之间的连接数及小管的长度和面积。改进方法后减少了原来分析困难及重现性差的缺点。 1.4 大鼠动脉环实验(ra t aorti c r i n g a ss ay) 1990年N ic 2osia 等首次将此模型应用于血管生成研究中。取下大鼠主 动脉后,剪成1mm 宽的血管环,再用纤维蛋白胶或胶原蛋白胶包埋,然后以无血清的MC DB131培养液培养。培养过程中每天计算主动脉环产生的新生微血管数并进行定量分析。用不同胶培养的大鼠主动脉环新生血管的生长曲线不同。胶原包埋的主动脉环,培养1wk 时血管数达到顶峰,第 2wk 开始萎缩。用纤维蛋白胶包埋时能使血管数顶峰期维 ? 11?中国药理学通报 Chinese Phar m acological B ulletin 2008Jan;24(1):11～4
葡萄糖苷酶抑制剂筛选方法 α-葡萄糖苷酶抑制剂是一类以延缓肠道碳水化合物吸收而达到治疗糖尿病的口服降糖药物。其作用机制为：竞争性抑制位于小肠的各种α-葡萄糖苷酶，使淀粉类分解为葡萄糖的速度减慢，从而减缓肠道内葡萄糖的吸收，降低餐后高血糖。 α-葡萄糖苷酶抑制活性筛选的原理是：对-硝基苯酚-α-D-葡萄糖苷(pNPG)作反应底物；该底物是无色的。经α-葡萄糖苷酶水解后可以释放出对-硝基苯酚(pNP)，pNP在碱性条件下是黄色的，因此可以通过测定410nm处的吸光度反应出pNP的浓度(吸光度与pNP浓度成正比关系)。吸光度越小，说明pNP的浓度越小，即酶被抑制的程度越大。 设不加样品时，测得的吸光度为c0, 加样品后测的吸光度为c1. 那么酶的抑制率可通过1-c1/c0计算出来。 一实验试剂： α-Glucosidase(α-葡萄糖苷酶)、4Nitrphtnylα-D-glucopyranoside(4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷)（PNPG）、Acarbose(阿卡波糖) 均购自Sigma公司，无水Na2CO3、Na2HPO4、KH2PO4等, 均为分析纯。水为超纯水。苦瓜提取物。 二实验器材： Bio Tek酶标仪、电子天平、Eppendorf的移液器、pH计、酶标板、恒温水浴器 三实验方法： （一） 试剂配制 （1）pH值6.8的0.1 mol/L磷酸缓冲液 分别配制0.1 mol/L Na2HPO4和KH2PO4(13.6 g配成1L)，用这两种溶液混匀互调pH 值至6.8即得0.1 mol/L磷酸缓冲液 （2）用pH值6.8的0.1 mol/L磷酸缓冲液配制0.26 U/mlα-Glucosidase （3）底物(PNPG)用pH值6.8的0.1 mol/L磷酸缓冲液配制成浓度为5 mmol/L (1.505mg/ml) （4）反应终止液：0.2 mol/L Na2CO3。 （5）阳性药的配制：精密称取阿波卡糖样品，以磷酸缓冲液为溶剂溶解，配成10 mg/ml 的浓度。 （二） 实验方法 1. 各浓度药液按每孔50 μL加入酶标板，每浓度设三复孔。另设一药物对照孔、空白反应孔及空白对照孔。然后向药物反应孔和空白反应孔加入50 μL 0.26 U/mL的 -葡萄糖苷酶，其他组加50 μL 磷酸缓冲液，经此步骤后，各孔的组成为： 药物反应孔：50 μL药液+ 50 μL酶 药物对照孔：50 μL药液+ 50 μL磷酸缓冲液 空白反应孔：50 μL磷酸缓冲液+ 50 μL酶 空白对照孔：50 μL磷酸缓冲液+ 50 μL磷酸缓冲液 上述反应体系在微型振荡器上震荡30秒，置于恒温37 o C水浴中孵育10min。
抗肿瘤药物体内筛选标准操作规程 概述： 抗肿瘤药物是指能够直接杀伤或抑制肿瘤细胞生长或增殖的一类药物，作用机制包括抑 制肿瘤细胞核酸或蛋白质的合成、干扰大分子物质代谢、干扰微管系统、抑制拓扑异构酶等。 本操作规程包括与抗肿瘤药物申请临床试验和申请上市有关的非临床有效性和安全性 研究的内容，其中着力强调非临床有效性和安全性之间的关联性，以及非临床研究和临床试 验之间的关联性。旨在一方面为抗肿瘤药物的非临床研究提供技术参考；另一方面，通过技术要求引导科学有序的研发过程，使国内此类药物的研发更趋规范和合理。 本操作规程仅代表目前对抗肿瘤药物非临床研究的一般性认识。具体药物的非临床研究 应在本指导原则的基础上，根据药物的自身特点制订研究方案。 研究目的： 建立一套包括抗肿瘤药物体内作用的药效学研究和评价体系及相应的标准操作规程以 及抗肿瘤药物安全性和作用新机制的研究。 ①有效性研究 抗肿瘤药物有效性研究的目的主要在于探索受试物的作用机制、作用强度、抗瘤谱等， 为之后的安全性评价以及临床试验中适应症、给药方案的选择提参考信息。 ②安全性评价 安全性评价的目的主要包括：（1）估算I期临床试验的起始剂量；（2）预测药物的毒性靶器官或靶组织；（3）预测药物毒性的性质、程度和可逆性；（4）为临床试验方案的 制订提供参考。 研究计划： （a）小鼠急性毒性测试 按照急性毒性测试的常规方法，选用昆明种小鼠，通过腹腔注射方式给药，测定体
外抗肿瘤活性突出的化合物的半数致死量（LD5o），参考给药小鼠体重变化情况，评价化合物的急性毒性，并确定小鼠体内抗肿瘤活性测试的给药剂量。 （b）小鼠体内抗肿瘤活性测试 根据动物体内抗肿瘤活性测试的标准方法，选用昆明种小鼠，皮下接种肉瘤 S180或肺癌H22瘤株，选择体外活性突出且急性毒性较低的化合物，设定合适的剂量通过腹腔注射方式给药，以临床常用抗肿瘤药物环磷酰胺作为阳性对照药物，测定肿瘤生长抑制作为体内活性评价指标。 （c）专利保护范围内的化合物的继续合成 申请保护范围较大的专利，合成部分可能具有良好活性的新的化合物，拓展研究范围， 发现活性更强的化合物，并申请新的发明专利。并可针对具体化合物申请从属专利，延长高活性化合物的保护期限。 采用MTT法或台盼蓝染色法，测定化合物对多种人肿瘤细胞株的增殖抑制活性，确 定化合物在不同瘤株间抗肿瘤活性的选择性，为裸鼠模型实验提供依据。 （e）抗肿瘤作用机理的深入研究 根据抗肿瘤（f）人癌裸鼠移植瘤模型实验活性化合物作用机理特征，选用微管蛋白 聚合等实验从分子水平确认化合物的作用机理；利用人脐静脉血管内皮细胞探讨化合物对内 皮细胞骨架的影响及诱导凋亡的途经，从细胞水平上阐明化合物的作用机理。 根据抗肿瘤新药审批办法的要求，采用裸小鼠皮下接种模型和/或原位移植瘤模型, 以相对肿瘤增值率和生存时间为指标，确定化合物的抗肿瘤活性。 （g ）动物体内药物代谢动力学实验 选择在人癌裸鼠移植瘤模型实验中活性良好的化合物，开展动物体内药物代谢动力学实验，考查化合物的吸收、分布、代谢、排泄性质。 （h）动物亚急性，长毒实验 根据抗肿瘤新药审批办法的要求，测定动物亚急性、长毒性质，进行药物安全性评价。 基本方法: ①小白鼠的灌胃法