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微量α﹣葡萄糖苷酶抑制剂筛选模型及抑制类型
的判断方法
朱娟娟，尹忠平，陈继光，上官新晨，彭大勇，蒋艳
（江西农业大学食品科学与工程学院，天然产物与功能食品重点实验室，江西南昌 330045）
摘要：α-葡萄糖苷酶抑制剂能抑制碳水化合物水解，是高血糖人群降低餐后血糖的常用物质。本文基于α-葡萄糖苷酶-PNPG 体外反应体系，建立了微量、快速的α-葡萄糖苷酶抑制剂筛选模型，该模型的主要参数如下：酶浓度为0.05 U/mL ；底物浓度范围为0.05~1 mM ；反应温度为37 ℃；反应时间为6 min 。以该模型检测了阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制作用，并采用Lineweaver-Burk Plots 、Eadie-Hofstee Plots 、Hanes-Wolff Plots 、Eisenthal-Cornish-Bowden Direct Plots 、Non-linear Regression Analysis 五种方法对该酶促反应的动力学数据进行了详细的分析。通过对数据处理的过程和结果的比较发现，该五种方法各有特点，各法所获得的V max 、K m 和K i 存在一定的差异，Non-linear-Regression Analysis 法更加简便、合理及可靠，是酶动力学数据处理的首选方法。采用Non-linear-Regression Analysis 法计算，该模型中酶促反应的V max 为3.91×10-6 mmol/min ，K m 为0.12 mM ，阿卡波糖的K i 为90 μM 。
关键词：α-葡萄糖苷酶抑制剂；模型；动力学
文章篇号：1673-9078(2016)12-164-170 DOI: 10.13982/j.mfst.1673-9078.2016.12.026
A Model for Screening Trace Amounts of α-Glucosidase Inhibitors and
Methods for Judging Inhibition Type
ZHU Juan-juan, YIN Zhong-ping, CHEN Ji-guang, SHANG GUAN Xin-chen, PENG Da-yong, JIANG Y an (Jiangxi Key Laboratory of Natural Product and Functional Food, College of Food Science and Engineering, Jiangxi
Agricultural University, Nanchang, 330045, China)
Abstract: Alpha-glucosidase inhibitors can inhibit carbohydrate hydrolysis and are commonly used to decrease postprandial blood
glucose in individuals with hyperglycemia. A model for the rapid screening of trace amounts of alpha-glucosidase inhibitors was established based on the alpha-glucosidase-pNPG in vitro reaction system. The optimized parameters of this model were as follows: the enzyme concentration, substrate concentration, reaction temperature, and reaction time were 0.05 U/mL, 0.05~1 mM, 37 ℃, and 6 min, respectively. The inhibitory effect of acarbose was determined using this model, and the enzymatic reaction kinetics data were analyzed using five methods (Lineweaver-Burk plots, Eadie-Hofstee plots, Hanes-Wolff plots, Eisenthal-Cornish-Bowden direct plots, and Non-linear regression analysis). Data processing and comparison of results showed that these five methods had distinct characteristics as the K i , K m , and V max calculated by these five methods differed slightly. Non-linear Regression Analysis was more convenient, reasonable, and reliable, and therefore was the first choice for processing the data of enzyme kinetics. By this model, the V max (×10-6 mmol/min) and K m (mM) of enzymatic reaction were calculated to be 3.91 and 0.12, respectively and the K i (μM) of acarbose was 90.
Key words: alpha-glucosidase inhibitor; model; kinetics
据国际糖尿病联盟（IDF ）统计，2013年全世界糖尿病患者约3.82亿[1]。我国约有5000万糖尿病患者，
收稿日期：2015-12-24
基金项目：国家自然科学基金资助项目（31460436，31260368）；江西省自然科学基金项目（20132BAB204004）
作者简介：朱娟娟（1989-），女，硕士研究生，研究方向：天然产物与功能性食品
通讯作者：尹忠平（1971-），男，博士，副教授，研究方向：天然产物与功能性食品
居世界第二位[2]。研究表明，高血糖是糖尿病的主要
特征，也是导致糖尿病并发症的重要原因[2]。糖耐量受损（IGT ）主要表现为餐后血糖升高，因此控制患者餐后血糖水平非常重要。根据IDF 《Ⅱ型糖尿病全球指南》和《中国Ⅱ型糖尿病防治指南》，服用α-糖苷酶抑制剂是Ⅱ型糖尿病治疗的首选方法之一[3,4]。膳食中碳水化合物的消化吸收是影响餐后血糖的关键因素，为了防止餐后高血糖，患者必须控制日常饮食中碳水化合物的摄入量，严重影响了患者的生活质量。
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为了控制好餐后血糖但又不太影响一日三餐，以碳水化合物为主要食物成分、餐后血糖受损的人群通常需要服用α-葡萄糖苷酶抑制剂。因此，筛选新型、高活性α-葡萄糖苷酶抑制剂成为了研究的热点。准确及快速筛选的前提是建立稳定高效的筛选模型，因而建立微量及快速的α-葡萄糖苷酶抑制剂筛选模型具有重要的意义。
为了揭示酶抑制反应动力学机制，研究者建立了Lineweaver-Burk Plots （双倒数作图法）、Eadie-Hofstee Plots 、Hanes-Wolff Plots 、Eisenthal-Cornish-Bowden Direct Plots 和Non-linear Regression Analysis 等多种数据分析方法，其中最为常用的是双倒数作图法。徐俊等[5]的研究表明，利用双倒数作图法判断酶反应抑制类型时须使反应处于非零级状态。当底物浓度过高时，酶促反应为零级反应，反应速度将不随底物浓度改变而改变，此时不适用于双倒数作图分析。本实验室研究发现，当底物浓度相对较低时，反应为非零级，但反应速度会在较短的时间内显著降低。因此，双倒数作图法具有一定的局限性。本文基于α-葡萄糖苷酶-PNPG 体外反应体系，建立了微量及快速的α-葡萄糖苷酶抑制剂筛选模型，以此模型检测了阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制作用，并采用上述五种数据处理方法，对该酶抑制试验数据进行了详细地分析，比较了各方法的优缺点，可为酶抑制反应动力学数据分析和抑制类型判断提供参考和依据。
1 材料与方法 1.1 主要试剂
α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase ，EC 3.2.1.20）、4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl-α-D- glucopyranoside ，PNPG ，026K1516），购自美国Sigma 公司；阿卡波糖，购自广州市亿邦医药科技公司；对硝基苯酚（PNP ）、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、β-巯基乙醇和甘油均为国产分析纯。
1.2 主要仪器设备
酶标仪，SpectraMax M2，Molecular Devices 。
1.3 试验方法
1.3.1 主要反应试剂的制备
PB （磷酸缓冲液）：称取KH 2PO 4 4.559 g ，
K 2HPO 4?3H 2O 7.646 g ，以去离子水定容稀释至500 mL ，调节pH 至6.8，再以0.22 μm 水系滤膜过滤，121 ℃灭菌20 min ，4 ℃贮存备用。
α-葡萄糖苷酶：将α-葡萄糖苷酶冻干粉溶于含50%甘油的PB （0.1 mM ，pH 6.8），配制成100 U/mL 的酶溶液，分装，-20 ℃冻存备用。
PNPG 、PNP 、阿卡波糖和β-巯基乙醇均以0.1 mM pH 6.8的PB 配制。
1.3.2 PNP 测定标准曲线的绘制
以0.1 mM 、pH 6.8 PB 配制PNP 标准溶液，取不同体积加入96孔板中，同时每孔加入1.4 M 的β-巯基乙醇1.5 μL ，再以pH 6.8 PB 补足至200 μL ，得0、0.01、0.02、0.04、0.08、0.1、0.2、0.4、0.8、1、2、4、8、16、32和64（×10-6 mmol/L ）系列标准浓度，每一浓度设置3个平行，于λ=405 nm 下测定吸光度值。以PNP 物质的量n （×10-6 mmol ）为纵坐标，OD 值A 为横坐标，绘制测定标准曲线。测定回归方程为：
Y=37.209X （R 2=0.9998）
式中：X 为吸光度值，Y 为PNP 的物质的量。
1.3.3 微量α-葡萄糖苷酶体外反应模型的建立
参考Luo 等[6]、Gao 等[7]和Y e 等[8]的方法，加以改进，建立基于96微孔板的微量、快速反应模型（α-葡萄糖苷酶-PNPG 反应体系）。具体操作如下：往各反应孔中加入β-巯基乙醇（1.4 M ）1.5 μL 、α-葡萄糖苷酶（1 U/mL ）10 μL ，以0.1 mM 、pH 6.8 PB 补足至180 μL ，混匀后置于37 ℃水浴中孵育20 min ，加入PNPG （1 mM ）20 μL ，37 ℃水浴加热6 min ，在405 nm 波长下测定吸光度值，每个浓度重复3次。
1.3.4 微量α-葡萄糖苷酶体外反应模型主要参数的优化
1.3.4.1 酶和底物浓度的优化
反应体系如1.3.3所述。在确定α-葡萄糖苷酶的浓度为0.05 U/mL 的基础上，选取0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.2、1.4、1.6、1.8和2 mM 12个浓度进行试验，反应6 min 后于405 nm 下测定吸光度值，以吸光度值（A ）对底物浓度（S ）作图，以确定适合的底物浓度范围。
1.3.4.2 反应时间的优化
反应体系如1.3.3所述。α-葡萄糖苷酶的浓度为0.05 U/mL ，底物浓度为0.05、0.075、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8和1 mM ，每隔1 min 测定一次吸光度值，连续测定60 min 。分别以吸光度值（A ）、PNP 生成量（n ）、反应速度（V ）和单位时间内反应速度增减值(?V)对时间（T ）作图，以确定最佳反应时间。
1.3.5 阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定
反应体系如1.3.3所述。底物浓度设为0.05、0.075、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.2和1.4 mM ，反应时
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间为6 min ，测定酶反应速度和IC 50。
酶活抑制率（%）=[(A 空白-A 样品)]/A 空白×l00
式中：A 空白为未加抑制剂（阿卡波糖）的吸光值；A 样品为加入抑制剂时的吸光值。
1.3.6 酶抑制反应动力学数据处理方法
Lineweaver-Burk Plots ：采用Excel 软件，以1/V 对1/S 作图。
Eadie-Hofstee Plots ：采用Excel 软件，以V 对V/S 作图。
Hanes-Wolff Plots ：采用Excel 软件，以S/V 对S 作图。
Eisenthal-Cornish-Bowden Direct Plots ：采用Excel 软件，以-S ，V 数据对作图。
Non-linear Regression Analysis ：采用Origin 8.0软件，以S 为自变量、V 为因变量进行非线性拟合。
主要参数（K m ，V max ，K i ）计算方法如下：
[][]
S K S V V +=
m max ； [][]
S K S V V +=
m 'max ''； []m Ki
I 1m 'K K ）（+
=；
[]
1i ?=
Km
I K
1.3.7 数据分析
利用Excel （2003）和DPS （v6.55）软件作图和进行数据统计分析，以Spss 13.0软件拟合数据计算IC 50。数据以均值±标准差（?x ±SD ）表示。
2 结果与讨论
2.1 α-葡萄糖苷酶体外抑制剂筛选模型的建立及主要参数的优化
本文参考Luo 等[6]、Gao 等[7]和Y e 等[8]的方法，建立了基于96微孔板的微量、快速α-葡萄糖苷酶-PNPG 体外反应体系。反应在0.1 mM 、pH 6.8 PB 中下进行，温度为37 ℃，总体积为200 μL 。为了使模型能更好地适用于α-葡萄糖苷酶抑制剂的筛选及酶抑制动力学研究，本文对酶浓度、底物浓度和反应时间进行了优化。
2.1.1 酶和底物浓度的优化
在酶反应体系中，酶和底物浓度是重要的参数，决定了反应速度的高低，但二者的比值更为重要。我
们发现在一定范围内同比例增加或降低酶和底物浓度，速度-底物浓度图的形状和趋势基本不变，只是反应速度的数值相应的增加或减少。本文基于试验效率和反应后吸光度检测的需要，首先通过试验确定α-葡萄糖苷酶的浓为0.05 U/mL 。在此基础上，设置了0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.2、1.4、1.6、1.8和2 mM 等12个底物（PNPG ）浓度进行优化试验。试验结果（如图1所示）表明，随着底物浓度的增加，反应速度先是快速上升，之后上升趋势逐步变缓，当浓度达到0.6 mM 以后，速度基本保持不变，说明此时反应体系中的酶已被底物饱和。从图1的数据来看，在底物浓度为0.05~1 mM 范围内，速度曲线呈双曲线形，速度和底物浓度之间的相关关系基本上符合米氏方程。因此，反应模型的酶浓度确定为0.05 U/mL ，底物浓度范围确定为0.05~1 mM 。
图1 不同底物浓度下的反应速度
Fig.1 Reaction rates under different substrate concentrations
2.1.2 反应时间的优化
研究已经证实，在酶促反应开始后的较短的一段时间内，反应速度基本保持不变，之后随着底物浓度的降低、产物浓度增加及部分酶分子失活，反应速度会逐步降低[9]。因此，测定酶促反应速度应选在这个近似恒速反应阶段进行。本文在酶浓度0.05 U/mL 的条件下，设置0.05、0.075、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8和1 mM 等10个底物浓度进行试验，连续测定了反应开始后60 min 的吸光度值，结果如图2所示。由图2a 可知，反应10分种后，低底物浓度下的反应速度开始显现降低的趋势，随着时间的推移，高底物浓度下的反应速度也相继出现下降趋势。底物浓度越高，出现下降趋势的时间点越往后推移。图2c 、b 和d 数据分析表明，反应的前10 min ，各底物浓度下各时间点的即时反应速度和平均反应速度随时间的推移稍微有所下降，但降幅很小，据此可判定前10 min 反应基本处于恒速阶段。为了确保低底物浓度下的反应在测定反应速度时仍处于初期的恒速阶段，本文将模型的反应时间确定为6 min 。
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图2 反应速度随时间变化情况分析图
Fig.2 Profile of changes in reaction rate within 60 min 注：a ，前60 min 的反应速度变化情况图；b ，前10 min PNP 的生成量；c ，前10 min 内各时间点的即时反应速度；d ，前10 min 内各时间点的平均速度。
2.2 阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定
图3 Lineweaver-Burk Plots 法对阿卡波糖抑制α-葡萄糖苷酶
活性试验数据处理结果
Fig.3 The inhibitory effect of acarbose on α-glucosidase by
Lineweaver-Burk plots
表1 双曲线作图法计算的阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶抑制作用
的特征参数
Table 1 Characteristic parameters of the inhibition of α-glucosidase by acarbose calculated using Lineweaver-Burk
plots
V max /×10-6 mmol/min
K m /mM K i /mM IC 50/mM
空白组 4.16±0.38a 0.15±0.03c A1 4.52±0.33a 0.32±0.05b 0.08±0.020.13±0.02
A2
4.66±0.57a
0.44±0.04a
注：表中数据后所标注的小写字母表示各处理组间数据在统计学上的差异显著性（p <0.05），A1组（阿卡波糖浓度为0.075 mM 的处理组）、A2组（阿卡波糖浓度为0.15 mM 的处理组）。
基于上述优化后的体外反应模型，本文测定了阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制活性，并采用双倒数作图法处理了测定数据，结果如图3和表1所示。由图3可知，采用双倒数作图，C 组（无抑制剂的空白对照组）、A1组（阿卡波糖浓度为0.075 mM 的处理组）、A2组（阿卡波糖浓度为0.15 mM 的处理组）三组的1/V 和1/S 均呈现出较好的线性相关性，线性回归后的R 2分别达到了0.9830、0.9927和0.9931。三组数据线性回归后的直线近似交于Y 轴上的一点，表明反应体系中加入阿卡波糖基本上没有改变其V max （最大反应速度）。表3所列各组酶反应特征参数的计算值也验证了这一点，虽然加入阿卡波糖后V max 稍有增大，但方差分析显示三者间无显著差异。从图3和表1可以看出，加入阿卡波糖后，反应的表观K m 显著增大，且呈现出明显的量效关系，表明阿卡波糖与酶结合后，降低了酶与底物的亲和性。通过进一步的数据计算，得出了阿卡波糖的K i 和IC 50，分别为80 μM 和130 μM ，表明其对α-葡萄糖苷酶具有较好的抑制作用。综上所述，阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的最大反应速度没有明显影响，但通过降低酶与底物的亲和力抑制了
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该酶的活性，具有竞争型抑制剂的典型的特征，因此属于竞争型抑制剂。本文的研究结果与[10]的报导一致，这也从另一角度证明，我们所建立的α-葡萄糖苷酶抑制剂筛选模型准确、有效，可用于实际筛选。
2.3 五种酶抑制动力学数据处理方法比较
目前研究人员已经建立了多种酶抑制反应动力学数据处理和分析方法，Lineweaver-Burk Plots 、Eadie-Hofstee Plots 、Hanes-Wolff Plots 、Eisenthal- Cornish-Bowden Direct Plots 和Non-linear Regression Analysis 是其中较为常用的五种。本文采用上述五种方法，对阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶抑制作用的试验数据进行了详细的分析和比较，旨在为酶抑制反应动力学数据分析提供参考。
2.3.1 Eadie-Hofstee Plots 处理结果
该法对米氏方程：
[][]S K S V V +=
m max 进行形式变换，推导出：
[]???
?????=S V m -max K V V （1） 这一形式的动力学方程，该方程中变量V 与变量V/[S]呈线性相关关系，所表示的直线的斜率为-K m ，在y 轴上的截距为V max 。本文采用方程（1）对阿卡波糖抑制α-葡萄糖苷酶活性试验数据进行拟合，C 组（无抑制剂的空白对照组）、A1组（阿卡波糖浓度为0.075 mM 的处理组）、A2组（阿卡波糖浓度为0.15 mM 的处理组）数据所拟合出来的方程分别为：
y c =-0.1323x c +3.9184（R 2=0.9311）、
y A1=-0.2669x A1+4.1644（R 2
=0.9571） 和y A2=-0.3597x A2+4.1598（R 2=0.9501）。 （如图4a ），利用拟合直线斜率和截距计算出的V max 、K m 和K i 如表2所示。
2.3.2 Hanes-Wolff Plots 处理结果
该法由米氏方程：
[][]S K S V V +=
m max 推导出：
[][]max
m max 1V K V S V
S +
??????
= （2） 其表示的直线斜率为1/V max ，在x 轴上的截距为-K m 。本文利用方程（2）对阿卡波糖抑制α-葡萄糖苷酶活性试验数据进行拟合（如图4b ），C 组、A1组（阿卡波糖浓度为0.075 mM 的处理组）、A2组（阿卡波糖浓度为0.15 mM 的处理组）数据的拟合直线分别为
y c =0.2748x c +0.0261（R 2=0.9938）、 y A1=0.2556x A1+0.0583（R 2=0.9932） 和y A2=0.2558x A2 +0.0806（R 2=0.9903）。 计算出来的V max 、K m 和K i 如表2所示。
2.3.3 Non-linear-Regression Analysis 处理结果
米氏方程：
[][]
S K S V V +=
m max 方程中V 和[S ]两个变量之间为双曲线相关关系，该法利用这一相关关系进行非线性拟合，可直接得出V max 和K m 两个参数，然后通过计算可得K i 。本文采用Origin （8.0）软件对阿卡波糖抑制α-葡萄糖苷酶活性试验数据进行了非线性双曲线拟合，拟合结果如图4c 所示，计算出来的V max 、K m 和K i 如表2所示。
2.3.4 Eisenthal-Cornish-Bowden Direct Plots 处理结果
169
图4 四种酶动力学数据处理方法对阿卡波糖抑制α-葡萄糖苷
酶活性试验数据处理结果
Fig. 4 Results obtained after processing the inhibitory effects of acarbose on alpha glucosidase by four methods of enzyme
kinetics data processing
注：a ，Eadie-Hofstee Plots 法处理结果；b ，Hanes-Wolff Plots 法处理结果；c ，Non-linear-Regression Analysis 法处理结果；d ，Eisenthal-Cornish-Bowden Direct Plots 法处理C （对照组）数据结果；e ，Eisenthal-Cornish-Bowden Direct Plots 法处理A1组（0.075 mM ）数据结果；f ，Eisenthal-Cornish-Bowden Direct Plots
法处理A2组（0.15 mM ）结果
表2 五种数据处理方法所获得的V max /×10-6 mmol/min、Km/mM 及K i /mM (?x±SD)
Table 2 V max /×10-6mmol/min, K m /mM and K i /mM （x -
±SD ）calculated using the five data processing methods
空白组
A1 A2 K i V max K m V max K m V max K m E-H 3.94±0.29a 0.13±0.02c 4.16±0.33a 0.27±0.03b 4.12±0.36a 0.36±0.02a 0.08±0.01ab H-W 3.64±0.15a 0.09±0.02c 3.96±0.38a 0.23±0.04b 3.94±0.38a 0.32±0.03a 0.06±0.02b N-L 3.91±0.21a 0.12±0.01c 4.01±0.26a 0.24±0.01b 4.04±0.27a 0.31±0.02a 0.09±0.02a L-B 4.16±0.38a 0.15±0.03c
4.52±0.33a 0.32±0.05b
4.66±0.57a 0.44±0.04a 0.08±0.02ab E-C
3.93±0.3b
0.14±0.02c
4.11±0.33ab 0.28±0.01b
4.21±0.38a 0.37±0.02a
0.09±0.02ab
注：E-H ，Eadie-Hofstee Plots 、H-W ，Hanes-Wolff Plots 、N-L ，Non-linear-Regression Analysis 、L-B ，Lineweaver-Burk Plots 、E-C ，Eisenthal-Cornish-Bowden Direct Plots ；不同小写字母表示存在显著差异（p <0.05），V max 与K m 组的字母标记是指同种方法不同组别间的比较，K i 组的字母标记则表示不同方法间的比较，且K i 值为A1与A2两组处理所得的均值；A1组（阿卡波糖浓度为0.075 mM 的处理组）、A2组（阿卡波糖浓度为0.15 mM 的处理组）。
Eisenthal 和Cornish-Bowden 于1974报道该法
[11]
，方法如下：以V 和[S ]为数据对，在y 轴上标出数值为V 的点，在x 轴上标出数值为-[S ]的点，两点相连成一条直线，各直线相交于一点，该点的横坐标和纵坐标分别是K m 和V max 值。本文以该法处理阿卡波糖抑制α-葡萄糖苷酶活性试验数据，结果如图4d 、4e 和4f 所示，计算出来的V max 、K m 和K i 如表2所示。
2.3.5 五种数据处理方法比较
本文采用Lineweaver-Burk Plots 、Eadie-Hofstee Plots 、Hanes-Wolff Plots 、Eisenthal- Cornish-Bowden Direct Plots 和Non-linear Regression Analysis 五种酶动力学数据处理方法对阿卡波糖抑制α-葡萄糖苷酶活性
试验数据进行了较为详细的处理和对比分析，发现五种方法各有特点，各法所获得的V max 、K m 和K i 存在一定的差异（见表2）。因此，在酶动力学试验中应注意针对实际情况合理选择数据处理方法。
（1）Lineweaver-Burk Plots 法：操作简便，高质量的试验数据可获得较高的拟合度，但低底物浓度点的误差会被大幅放大。从本文以该法处理阿卡波糖抑制α-葡萄糖苷酶活性试验数据来看，C 组、A1组和A2组三个处理组的V 和[S ]数据经倒数变换后回归出来的直线，难以交于一点。特别值得注意的是，阿卡波糖是竞争型抑制剂[10]，理论上三条直线应交于y 轴上的一个点，但我们进行了很多次试验，可近似交于
靠近y轴的一个点，但很难准确地交于y轴上的一个点。因此，我们建议对该法获得的V max和K m进行单因素方差分析，用统计学的方法来判断加入抑制剂前后的V max和K m有无显著差异，据以来准确判断抑制剂的类型。其它四种方法也不同程度的存在这个问题，均可采用此法来处理和判断。此外，数据经倒数处理可能带来较大的误差，特别是低底物浓度的点，会放大误差，造成结果上的不准确[9]。
（2）Eadie-Hofstee Plots法：处理简便，但拟合度较低。以该法处理阿卡波糖抑制α-葡萄糖苷酶活性试验数据，拟合的R2值均低于0.96，空白组的R2仅为0.9311。
（3）Hanes-Wolff Plots法：操作简便，但低底物浓度点的离散性较大，影响了结果的准确性。
（4）Eisenthal-Cornish-Bowden Direct Plots法：数据处理量大，且所得数据离散性较大，难以获得准确结果。该法以数据对作图时会产生非常多的直线，除非试验数据非常准确，否则这些直线很难于交于一点。因此，本文将所有两两相交的交点坐标加和后进行平均，据此计算V max和K m。
（5）Non-linear-Regression Analysis法：操作简便，不需要对数据进行形式变换，直接以V和[S]进行双曲线拟合，因此没有其它几种方法因数据变换带来的误差。该法另外一个显著的优点是，可适用于较大的底物浓度范围，0.25~5.0 K m的范围均可[9]。虽然这种方法简便易行，且结果准确可靠，但需要专业计算软件。随着计算机技术的快速发展和各种计算软件的普及，这种非线性拟合方法将会得到迅速推广。从本文以该法处理阿卡波糖抑制α-葡萄糖苷酶活性试验数据来看，所得参数V max、K m和K i的标准偏差相对于其它四种方法来说比较小。从表2数据可知，阿卡波糖未改变反应的V max，其主要是通过降低酶与底物的亲和力来抑制酶活，据此可判断其为竞争型α-葡萄糖苷酶抑制剂；此法计算所得的K i均值为90 μM，与相关文献报道一致[10]。
基于以上分析，我们认为Non-linear-Regression Analysis法更加简便、合理和可靠，是酶动力学数据处理的首选方法。
3 结论
本文建立了微量、快速的α-葡萄糖苷酶抑制剂筛选模型，该模型的主要参数如下：酶浓度为0.05 U/mL；底物浓度范围为0.05~1 mM；反应温度为37 ℃；反应时间为6 min。以该模型检测了阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制作用，并采用Lineweaver-Burk Plots、Eadie-Hofstee Plots、Hanes-Wolff Plots、Eisenthal-Cornish-Bowden Direct Plots和Non-linear Regression Analysis五种方法对该酶反应动力学数据进行了详细的对比和分析，结果表明，各法所获得的V max、K m和K i存在一定的差异，Non-linear-Regression Analysis法更加简便、合理及可靠，是酶动力学数据处理的首选方法。
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β-葡萄糖苷酶的研究 1837年，Liebig和Wohler首次在苦杏仁汁中发现了β-葡萄糖苷酶。β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)的英文名是β-glucosidase，属于水解酶类，又称β-D-葡萄糖苷水解酶，别名龙胆二糖酶、纤维二糖酶和苦杏仁苷酶。它可催化水解结合于末端非还原性的β-D-糖苷键，同时释放出配基与葡萄糖体。 β-葡萄糖苷酶广泛存在于自然界中，它可以来源于植物、微生物，也可来源于动物。β-葡萄糖苷酶的植物来源有人参、大豆等；微生物来源的报道较多，如原核微生物来源的有脑膜脓毒性黄杆菌(Flavobacterium meningosepticum)、约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsonae)等，真核生物来源的有清酒酵母(Candida peltata)、黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）等；β-葡萄糖苷酶的动物来源有蜜蜂、猪肝和猪小肠等。鉴于β-葡萄糖苷酶的研究广泛，本文对其一些研究进展进行讨论。 1 β-葡萄糖苷酶的分类 β-葡萄糖苷酶按其底物特异性可以分为3类：第一类是能水解烃基-β-葡萄糖苷或芳香基-β-葡萄糖苷的酶，此类β-葡萄糖苷酶能水解的底物有纤维二糖、对硝基苯-β-D-葡萄糖苷等；第二类是只能水解烃基-β-葡萄糖苷的酶，这类β-葡萄糖苷酶能水解纤维二糖等；第三类是只能水解芳香基-β-葡萄糖苷的酶，这类酶能水解对硝基苯-β-D-葡萄糖苷等类似物。 2 β-葡萄糖苷酶的提取、纯化及酶活测定方法 2.1 β-葡萄糖苷酶的提取方法 不同来源的β-葡萄糖苷酶，其提取方法也有所不同。动植物体及大型真菌中的糖苷酶一般需要对酶源进行组织捣碎，然后用缓冲液浸提。常用的缓冲液有磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液等。pH值一般选用酶的稳定pH值；提取温度适于低温，一般为4 ℃。利用微生物发酵法生产β-葡萄糖苷酶是β-葡萄糖苷酶的另一来源，一般微生物发酵都采用液态发酵。对于胞外酶来讲，发酵液即为粗酶液；对于胞内酶，则需对微生物进行细胞破碎，使其释放出β-葡萄糖苷酶。 2.2 β-葡萄糖苷酶的纯化方法 粗提的β-葡萄糖苷酶可采用硫酸铵沉淀或用乙醇、丙酮等有机溶剂沉淀等方法初步分离。β-
α-葡萄糖苷酶(α-Glucosidase)使用说明 货号：G8820 规格：1g/5g 级别：BR 其他名称：α-D-葡萄糖苷酶;α-葡糖苷酶 CAS号：9001-42-7 提取来源：黑曲霉 产品简介： α-葡萄糖苷酶（α-Glucosidase，EC 3.2.1.20）又被称为α-葡萄糖苷水解酶或葡萄糖基转移酶（GTase），是一种α-D-葡萄糖苷酶。它可以从低聚糖类底物的非还原末端切开α-1,4-糖苷键释放出葡萄糖，或将游离的葡萄糖残基转移到另一糖类底物形成α-1,6-糖苷键，从而得到非发酵性的低聚糖。α-葡萄糖苷酶来源广泛，在人体糖原的降解和动植物、微生物的糖类代谢方面具有重要的生理功能。α-葡萄糖苷酶广泛应用于食品和发酵工业、化学工业以及医学应用等行业。 酶活定义： 每小时产生1μg葡萄糖所需的酶量定义为一个α-葡萄糖苷酶活力单位。 酶活检测方法：参见QB2525-2001。 产品特性： 酶活力：300000U/g 最适作用温度：50℃，合适的作用温度：50-55℃。 最适作用pH：5.0，合适的作用pH：4.8-5.4。
外观：淡白色粉末或淡黄色液体，分子量约为68.5KD，无臭无味，溶于水，不溶于乙醚和乙醇。 用途： 生化研究。能水解葡萄糖苷(Glucoside)成葡萄糖和其他组成物质，是一种具有生物催化剂功能的蛋白质。本产品的建议添加量为800U/g干物质，根据实际情况改变添加量。 抑制剂： 铜、钛、钴等金属离子对本品有一定的影响。铅、铝、锌等金属离子对本品有较强的抑制作用。 贮存： 建议密封储藏于干燥、低温的环境中（≤25℃），最好在冷藏条件下（4-8℃）储藏。25℃以下，液体可以储存3个月，保质期内酶活不会降低于产品标示的活力；4℃以下，可较长时间储存。
α-葡萄糖苷酶的研究综述 摘要：α-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.20 ) 因在淀粉加工上具有重要作用，其研究多年来一直受到重视。α-葡萄糖苷酶广泛存在于动物、植物和微生物体内，它可从非还原末端水解低聚糖和多聚糖的α-1,4-葡萄糖苷键，也能作用于淀粉的α-1,6-糖苷键，在高葡萄糖苷受体环境中还可催化转糖苷反应。研究表明α-葡萄糖苷酶在不同领域的开发和应用都具有很好的经济和社会效益。 关键词:葡萄糖苷酶淀粉水解转糖苷反应研究进展 生物技术和酶工程的飞速发展为开发淀粉水解酶提供了技术支持。淀粉水解酶( 包括转化酶) 是一类以淀粉或不同的糖源为底物，根据水解专一性不同，可将淀粉或糖原降解成不同的单糖、低聚糖和水解多糖的水解酶类。同时，有些酶还具有转化功能，通过分子内的转糖苷作用，改变低聚糖的糖苷键链接方式。淀粉酶是生物体内广泛存在的一种水解酶，主要作用于淀粉，如植物体内的淀粉消化、植物根系中淀粉积累、动物体内摄入淀粉的分解、微生物利用碳源等。特别是具有特殊性质和新的应用领域的酶在工业上具有很重要的作用，它们可广泛应用于食品和发酵工业、化学工业以及医学应用等。α-葡萄糖苷酶作为淀粉水解酶家族中的重要一员，对它的研究一直受到人们的高度重视，多年来α-葡萄糖苷酶在不同领域的应用均产生了很好的经济和社会效益。 1、α-葡萄糖苷酶的简介 α-葡萄糖苷酶(EC.3.2.1.20，α-Glucosidases) 为淀粉水解酶类中的一种，主要在细胞外起作用。它从多糖的非还原末端水解底物的α-葡萄糖苷键，产生α-D-葡萄糖，通常把它们归类于水解酶第3类,主要水解二糖、低聚糖、芳香糖苷，能以蔗糖和多聚糖为底物。同时， 它还具有转糖苷作用，可将低聚糖中的，α-1，4-糖苷键转化成α-1，6-糖苷键或其他形式的链接，从而得到非发酵性的低聚异麦芽糖或糖酯、糖肽等。按一级结构可将α-葡萄糖苷酶归为水解酶13类的31家族。α-葡萄糖苷酶通常按底物专一性分为3个类型。Ⅰ型α-葡萄糖苷酶水解芳基葡萄糖苷如对--硝基苯酚α-D-葡萄糖吡喃苷(pNPG ) ，且水解速率比低聚麦芽糖快。Ⅱ型α-葡萄糖苷酶对麦芽糖具有高活性，而对芳基葡萄糖苷活性低。Ⅲ型α-葡萄糖苷酶与Ⅱ型类似，但它水解低聚糖和淀粉的速率基本一样。 2、α-葡萄糖苷酶来源及分布 α-葡萄糖苷酶在自然界分布广泛，种类繁多，性质各异，几乎存在于所有生物体内。目前已经进行研究的α-葡萄糖苷酶除少数来源于植物和动物外，绝大多数均来自于微生物中。细菌、霉菌及酵母菌等一些菌株能分泌此酶，其中产酶较多的是黑曲霉，市场上销售的α-葡萄糖苷酶产品大都为黑曲霉发酵生产所
热稳定葡萄糖脱氢酶的表达及在合成L-叔亮氨酸中的应用 葡萄糖脱氢酶(Glucose Dehydrogenase,GDH,EC1.1.1.47)属于短链脱氢酶/还原酶(Short-chain dehydrogenases/reductase,SDRs)。它具有四个相同亚基(28.2×4kDa),能够催化D-葡萄糖为D-葡萄糖酸内酯,同时还原NAD(P)+为NAD(P)H。 近些年,GDH的研究取得了一定进展,已经应用到很多领域,例如辅酶再生、临床检测和生物燃料电池等。早期的GDH来源主要是动物新鲜肝脏,目前大部分由微生物发酵而来。 国内的GDH产量还不高,主要依靠进口。本文研究的葡萄糖脱氢酶(GDH)来源于巨大芽孢杆菌(Bacillus megtaterium IWG3)的一个突变体GDH-DN46[1],其通过定向进化和96孔板法获得,提高了酶的热稳定性和耐碱性,不管NaCl的存在与否都不会对这种突变酶的催化活性产生影响。 这种氧化还原酶在催化反应中需要依赖辅酶NAD(P)+,但辅酶价格昂贵并且稳定性差,这大大限制了氧化还原酶在工业催化方面的应用[2]。本文以GDH的突变体GDH-DN46作为研究对象,通过构建重组质粒并在大肠杆菌中成功表达,优化表达条件提高酶的活性,研究该酶酶学性质。 将其用于辅酶再生系统,用以催化合成L-叔亮氨酸。同时本论文建立了可利用仿生辅酶的GDH的高通量筛选平台,探索仿生辅酶替代NAD(P)+在工业催化方面的应用。 论文的主要研究内容如下:1.构建了在大肠杆菌E.coli BL21中高效表达GDH的重组表达质粒pET28a-GDH,E.coliBL21(pET28a-GDH)的酶活可达到 0.95 U/mg。对重组菌的培养和诱导条件进行优化,优化后的酶活提高到1.52 U/mg,比
葡萄糖苷酶抑制剂筛选方法 α-葡萄糖苷酶抑制剂是一类以延缓肠道碳水化合物吸收而达到治疗糖尿病的口服降糖药物。其作用机制为：竞争性抑制位于小肠的各种α-葡萄糖苷酶，使淀粉类分解为葡萄糖的速度减慢，从而减缓肠道内葡萄糖的吸收，降低餐后高血糖。 α-葡萄糖苷酶抑制活性筛选的原理是：对-硝基苯酚-α-D-葡萄糖苷(pNPG)作反应底物；该底物是无色的。经α-葡萄糖苷酶水解后可以释放出对-硝基苯酚(pNP)，pNP在碱性条件下是黄色的，因此可以通过测定410nm处的吸光度反应出pNP的浓度(吸光度与pNP浓度成正比关系)。吸光度越小，说明pNP的浓度越小，即酶被抑制的程度越大。 设不加样品时，测得的吸光度为c0, 加样品后测的吸光度为c1. 那么酶的抑制率可通过1-c1/c0计算出来。 一实验试剂： α-Glucosidase(α-葡萄糖苷酶)、4Nitrphtnylα-D-glucopyranoside(4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷)（PNPG）、Acarbose(阿卡波糖) 均购自Sigma公司，无水Na2CO3、Na2HPO4、KH2PO4等, 均为分析纯。水为超纯水。苦瓜提取物。 二实验器材： Bio Tek酶标仪、电子天平、Eppendorf的移液器、pH计、酶标板、恒温水浴器 三实验方法： （一） 试剂配制 （1）pH值6.8的0.1 mol/L磷酸缓冲液 分别配制0.1 mol/L Na2HPO4和KH2PO4(13.6 g配成1L)，用这两种溶液混匀互调pH 值至6.8即得0.1 mol/L磷酸缓冲液 （2）用pH值6.8的0.1 mol/L磷酸缓冲液配制0.26 U/mlα-Glucosidase （3）底物(PNPG)用pH值6.8的0.1 mol/L磷酸缓冲液配制成浓度为5 mmol/L (1.505mg/ml) （4）反应终止液：0.2 mol/L Na2CO3。 （5）阳性药的配制：精密称取阿波卡糖样品，以磷酸缓冲液为溶剂溶解，配成10 mg/ml 的浓度。 （二） 实验方法 1. 各浓度药液按每孔50 μL加入酶标板，每浓度设三复孔。另设一药物对照孔、空白反应孔及空白对照孔。然后向药物反应孔和空白反应孔加入50 μL 0.26 U/mL的 -葡萄糖苷酶，其他组加50 μL 磷酸缓冲液，经此步骤后，各孔的组成为： 药物反应孔：50 μL药液+ 50 μL酶 药物对照孔：50 μL药液+ 50 μL磷酸缓冲液 空白反应孔：50 μL磷酸缓冲液+ 50 μL酶 空白对照孔：50 μL磷酸缓冲液+ 50 μL磷酸缓冲液 上述反应体系在微型振荡器上震荡30秒，置于恒温37 o C水浴中孵育10min。
2.2实验方法 2.2.1α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定方法 2.2.1.1 反应溶液的制备 （1）配制底物PNPG溶液：精确称取0.3766gPNPG，加适量0.1mol/L磷酸缓冲液（pH为6.8）溶解，再用容量瓶准确定容到50mL，配制成25mmol/L的母液。将母液分别稀释成0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mmol/L7个不同梯度的标准品溶液，备用。 （2）配制α-葡萄糖苷酶的酶溶液：将冻干酶粉（酶活力为14u/mg）用0.01mol/L 磷酸缓冲液（pH为6.8）溶解，配制成2u/mL的母液。再将酶液分别稀释，配制成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0u/mL的酶溶液，备用。 （3）配制DNJ标准溶液（抑制剂）：精确称取0.0010g DNJ 标准品，用容量瓶准确定容到10mL，配制成1000μg/mL DNJ标准母液。将母液分别稀释成、1、5、10、20、40、60μg/mL六个不同梯度的标准品溶液，备用。 （6）0.2mol/L的Na2CO3：称取2.16g Na2CO3于烧杯中，加入适量蒸馏水溶解，并定容到100mL，4℃下保存，备用。 2.2.1.2 PNP标准曲线的绘制 精确称取0.0278g对硝基酚（PNP），加0.01mol/L磷酸缓冲液（pH为6.8）溶解，再用容量瓶定容至10mL，即得20mmol/L母液。用蒸馏水将其母液稀释成浓度分别为1、5、10、20、40、40、80和100μmol/L的标准溶液。取100μl上述标准液，各加入150μL 0.2mol/L 的Na2CO3，混匀1 min ，再于405 nm处测定其吸光度，得标准曲线方程： y=128.13x+0.3579 (R2 =0.9998)，其中y 为浓度，x为吸光值。
Advances in Microbiology 微生物前沿, 2018, 7(2), 79-86 Published Online June 2018 in Hans. https://www.doczj.com/doc/f12126224.html,/journal/amb https://https://www.doczj.com/doc/f12126224.html,/10.12677/amb.2018.72010 Progress of β-Glucosidase from Microorganisms Zhishuai Chang*, Hui Lan, Yali Bao, Zhanying Liu# Inner Mongolia University of Technology, Hohhot Inner Mongolia Received: Jun. 7th, 2018; accepted: Jun. 21st, 2018; published: Jun. 28th, 2018 Abstract β-glucosidase can effectively decrease the inhibitory effect of cellobiose on cellulase activity, which is a bottleneck on the complete hydrolysis of cellulose. Because of its low activity and high cost, the β-glucosidase, which is highly resistant to acid and alkali, is more suitable for industrial production and application by means of genetic engineering technology and expressing in hetero-logous hosts. In this paper, there is a detailed summary about β-glucosidase in the classification and cloning about different sources of β-glucosidase gene, enzyme activity determination and so on, which provides theoretical support for enzyme researches. Keywords β-Glucosidase, Gene Cloning, Enzyme Activity Determination 微生物产β-葡萄糖苷酶研究进展 常治帅*，兰辉，包亚莉，刘占英# 内蒙古工业大学，内蒙古呼和浩特 收稿日期：2018年6月7日；录用日期：2018年6月21日；发布日期：2018年6月28日 摘要 β-葡萄糖苷酶能有效解除纤维二糖对纤维素酶活性的抑制，是限制纤维素彻底水解的重要因素。由于β-葡萄糖苷酶酶活相对较低、成本高等因素，通过基因工程手段对其定向改造，异源表达获得高酶活、耐*第一作者。 #通讯作者。
2009年09月04日 医疗器械不良事件信息通报（2009年第5期）警惕采用葡萄糖脱氢酶吡咯喹啉醌（GDH- PQQ）技术的血糖检测产品潜在风险 警惕采用葡萄糖脱氢酶吡咯喹啉醌（GDH- PQQ）技术的血糖检测产品潜在风险葡萄糖脱氢酶吡咯喹啉醌（GDH- PQQ）血糖检测技术是一种用于血糖检测的酶技术。GDH- PQQ 血糖检测技术不能将血液中葡萄糖和其它糖类物质区分开来。因而，在使用该类产品时，如果患者正在接受含有某些非葡萄糖类物质的治疗，这些糖类物质会使血糖检测结果高于真实值，从而可能会掩盖严重的低血糖症或引起胰岛素的过量使用，进而导致严重的人身伤害或死亡。这些非葡萄糖糖类物质包括：麦芽糖、木糖、半乳糖，其存在于某些药物和生物制剂中，也可能由药物或治疗产品的代谢而产生。 鉴于采用该技术的血糖检测产品的潜在风险，建议医疗机构和患者采取以下措施，加以控制。 一、对医疗机构的建议： 1、尽量避免使用GDH- PQQ技术的血糖检测产品。 2、如使用该类产品，应严格按照产品说明书有关要求使用。 3、严禁将该类产品用于以下患者：正在使用含有非葡萄糖糖类物质的干扰类药品或治疗方案的患者，或无法向患者了解其药物同用情况，如反应迟钝或不能与之进行有效沟通的患者等。这些干扰类药品或治疗方案包括：含艾考糊精的腹膜透析液、含麦芽糖的免疫球蛋白制剂、注射用阿巴西普、放射免疫治疗药物托西莫单抗、静脉注射麦芽糖制剂、手术中使用含艾考糊精的防肠粘连液，以及其它任何含有或代谢为麦芽糖、木糖、半乳糖的药物或治疗方案。 4、在患者入院时应确认其是否正在接受干扰类药品的治疗，并在住院期间定期确认。
5、应对工作人员和患者进行相关培训，使其知晓使用该类产品时，有些非葡萄糖糖类物质可能会导致血糖测定结果的虚假升高。 6、应考虑在电脑处方录入系统、患者个人资料和检验报告单中增加药物相互作用的警示，以提醒工作人员存在血糖测定结果虚假升高的可能性。 7、应根据实验室血糖测定法对该类产品进行定期校对。 二、对患者的建议 1、根据医护人员的指导意见进行检测血糖。 2、对如使用含有非葡萄糖糖类物质的干扰药品或治疗方案时不应该再使用该类产品。 3、可以通过阅读血糖仪和血糖试纸的说明书及其外盒标识来产品采用的血糖检测技术。如果无法确定，请询问医护人员或生产厂家。 4、如没有使用含有非葡萄糖糖类物质的干扰药品或治疗方案时，该类产品是可以使用的。 5、了解您正在服用的药物，保留一份当前用药清单。 6、如果检测结果与自我感觉不一致，请及时就诊。 https://www.doczj.com/doc/f12126224.html,/WS01/CL0438/41174.html
种类 天然α-葡萄糖苷酶抑制剂（glucosidase inhibitor）主要源于动物、植物、微生物，目前已上市并在临床上应用的α-葡萄糖苷酶抑制剂类降糖药主要有：拜唐苹（阿卡波糖），每片50毫克（德国拜耳）；卡博平（阿卡波糖），每片50毫克（中美华东）；倍欣（伏格列波糖），每片0.2毫克（天津武田）；奥恬苹（米格列醇，miglitol），每片50毫克（四川维奥）。其中拜唐苹及卡博平为医保药物，倍欣与奥恬苹尚未进入医保目录。 拜唐苹：（阿卡波糖），Acarbose 特点：由白色放线菌属菌株发酵而成，为德国拜耳公司出品，仅有微量原形或分解产物为人体吸收，绝大部分经肠道排出。 规格：50毫克/片 剂量：150~300毫克/日 副作用：消化道反应：肠鸣，腹胀，恶心，呕吐，食欲减退，偶有腹泻，一般两周后可缓解，必要是可减量。 倍欣：（伏格列波糖），V oglibose 特点：由日本武田药品有限公司生产，通过抑制α- 葡萄糖苷酶，延缓双糖（淀粉在淀粉酶作用下水解为双糖）在α- 葡萄糖苷酶作用下分解为单糖，延缓葡萄糖与果糖的吸收速度，从而降低餐后血糖。 规格：0.2毫克/片 剂量：0.6毫克/日 副作用：同拜糖平。 编辑本段 作用机制 食物中的淀粉（多糖）经口腔唾液、胰淀粉酶消化成含少数葡萄糖分子的低聚糖（或称寡糖）以及双糖与三糖，进入小肠经α- 葡萄糖苷酶作用下分解为单个葡萄糖，为小肠吸收。在生理的状态下，小肠上，中、下三段均存在α- 葡萄糖苷酶，在服用α- 葡萄糖苷酶抑制剂后上段可被抑制, 而糖的吸收仅在中、下段，故吸收面积减少，吸收时间后延，从而对降低餐后高血糖有益, 在长期使用后亦可降低空腹血糖, 估计与提高胰岛素敏感性有关。 编辑本段 作用特点 （1）抑制小肠上皮细胞表面的α-糖苷酶。药物与酶的结合时间大约是4～6小时，此后酶的活性可恢复。 （2）延缓碳水化合物的吸收，而不抑制蛋白质和脂肪的吸收。 α-葡萄糖苷酶抑制剂 （3）一般不引起营养吸收障碍。 （4）几乎没有对肝肾的副作用和蓄积作用。 （5）主要降低餐后血糖。 编辑本段 临床药效 （1）可显著降低糖耐量受损者发生2型糖尿病的危险。餐后血糖升高是糖耐量受损（IGT）
β-葡萄糖苷酶研究进展 1.1问题的提出及意义 随着能源危机、食物短缺、环境污染等问题正日益严重地困扰着整个世界，寻找开发新能源、节省粮食、减少环境污染显得越来越重要。纤维素类物质是自然界中存在的最廉价、最丰富的一类可再生资源。全世界每年的植物体生成量高达100-500亿吨干物质，其中一半以上为纤维素和半纤维素[1]。纤维素在一定条件下可以被水解成单糖，单糖可再通过微生物发酵生产各种有用的产品，如饲料、燃料、化工原料、食品、药品等，并且可取代目前的淀粉原料发酵生产的各种产品，以及由化工燃料合成生产的部分有机产品[2,3]。开发高效转化木质纤维素类可再生资源的微生物技术，利用工农业废弃物等发酵生产人类急需的燃料、饲料及化工产品，即化工原料的“绿色化”，具有极其重要的意义和光明的发展前景。 纤维素酶是一类能够降解纤维素生成葡萄糖的酶的总称，它是一类复杂的复合物，称之为纤维素酶系,根据其中各酶功能的差异，可将其分为三大类：(1)内切β- 1，4- 葡聚糖酶(endo- β- 1, 4- glucanase，EC3.2.1.4，也称Cx 酶)，作用于纤维素分子内部的非结晶区或羧甲基纤维素，随机水解β - 1 ，4 - 糖苷键，将长链纤维分子截断，产生大量小分子纤维素；(2)外切β- 1，4- 葡聚糖酶(exo- β- 1, 4- glucanase，EC3.2.1.91，也称C1 酶)，作用于纤维素线状分子末端，水解β - 1 , 4 - 糖苷键，每次从纤维素链的非还原端切下一个纤维二糖分子，可以水解微晶纤维素；(3)β-葡萄糖苷酶(cellobiohydrolase,EC2.1.21，简称CBH)，水解纤维二糖和短链的纤维寡糖生成葡萄糖[4]。3种酶协同作用，完成对纤维素的降解。 1837年，Liebig 和Wohler 首次在苦杏仁中发现β-葡萄糖苷酶[5]。后来研究发现，β-葡萄糖苷酶存在于植物[6]、昆虫[7]、酵母、曲霉及细菌体内。它参与生物体的糖代谢，对维持生物体正常生理功能起着重要作用。β-葡萄糖苷酶是纤维素酶系的重要成员，在纤维素水解时，纤维二糖的积累会抑制内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶的活性，而纤维素酶组分中该酶含量最少、活力普遍较低，因此成为纤维素酶解的瓶颈[8]。增加β-葡萄糖苷酶活性，会有效提高纤维素酶解效率。目前，国内外多家研究机构正致力于β-葡萄糖苷酶的分子生物学研究，以期望更好改善纤维素酶的催化效率，利用纤维素资源。 1.2国内外研究现状
α-糖苷酶抑制剂抑制活性测定 实验原理： 食物中的淀粉（多糖）经口腔唾液、胰淀粉酶消化成含少数葡萄糖分子的低聚糖（或称寡糖）以及双糖与三糖，进入小肠经α- 葡萄糖苷酶作用下分解为单个葡萄糖，为小肠吸收。在生理状态下，小肠上，中、下三段均存在α- 葡萄糖苷酶，在服用α- 葡萄糖苷酶抑制剂后上段可被抑制, 而糖的吸收仅在中、下段，故吸收面积减少，吸收时间后延，从而对降低餐后高血糖有益, 在长期使用后亦可降低空腹血糖, 估计与提高胰岛素敏感性有关。 对硝基苯-α-D-葡萄糖苷（pNPG）经α-葡萄糖苷酶水解可产生对硝基苯酚，其在405nm呈特异性吸收，因此可以通过检测对硝基苯酚的生成量检测α-葡萄糖苷酶的活性。 仪器与试剂 缓冲液：0.1M的磷酸钠缓冲液（pH6.8）--每100ml中1mol/l磷酸氢二钠4.6 ml，1mol/l磷酸二氢钠5.4 ml。 酵母α-葡萄糖苷酶：将100U/ml酶原液用0.1M的磷酸钠缓冲液（pH6.8）稀释为1U/ml的酶溶液，冷冻备用。 底物pNPG配制：2mM的pNPG溶解于0.1M的磷酸钠缓冲液中。 阿卡波糖抑制剂配制：200μg/ml溶于0.1M的磷酸钠缓冲液中。 实验内容 1.分组：空白对照组、阴性对照组、阳性对照组、阳性对照组空白、待测样品 大、中、小剂量组、待测样品组空白 空白对照： 170μl缓冲液+30μl 2mM的pNPG 阴性对照组：10μl酶溶液+160μl缓冲液+30μl 2mM的pNPG 阳性对照：10μl酶溶液+60μl缓冲液+100μl阿卡波糖抑制剂+30μl 2mM 的pNPG 阳性对照空白：10μl酶溶液+90μl缓冲液+100μl阿卡波糖抑制剂 待测样品组：10μl酶溶液+60μl缓冲液+100μl待测样品+30μl 2mM的pNPG 待测样品空白：10μl酶溶液+90μl缓冲液+100μl待测样品 2.实验步骤
糖苷酶及其抑制剂的研 究 Document number：PBGCG-0857-BTDO-0089-PTT1998
糖苷酶及其抑制剂的研究 摘要：糖苷酶是生命体正常运转的关键性酶，糖苷酶抑制剂 可抑制糖苷酶的活性，阻断碳水化合物的分解，因此对一些 糖代谢紊乱性疾病如糖尿病、肥胖病等有临床应用价值。本 文研究了糖苷酶中的β－半乳糖苷酶、β－葡萄糖苷酶以及蔗 糖酶的抑制剂。重点研究了β－半乳糖苷酶的分子结构和活性 基团，并从结构出发筛选其抑制剂，发现此酶的抑制剂种类 较少且抑制活性较低。本实验采用混合交叉筛选法筛选了多 种金属离子和氨基酸对β－半乳糖苷酶的抑制作用，同时也筛 选了天然产物和合成化合物。 关键词：糖苷酶β－半乳糖苷酶β－葡萄糖苷酶蔗糖酶抑制剂的筛选混合交叉法 1、前言 糖苷酶和糖基转移酶不仅参与了体内碳水化合物的消化，而且是糖脂、糖蛋白生物合成中寡糖链的修剪酶，它对糖蛋白中寡糖链的形成极为重要；糖链的组成与结构是糖蛋白特异生物功能的识别
部位，因此糖苷酶活性对糖蛋白生物合成有关键作用，而后者又涉 及到免疫反应、神经细胞的分化、肿瘤的转移以及病毒和细菌的感染. 因此, 糖苷酶不仅是生命体正常运转的关键性酶,同时又是许多疾病的相关酶. 与病毒感染、癌症及一系列新陈代谢紊乱性疾病如 糖尿病、肥胖病有关。由于糖苷酶重要的生物学意义，糖苷酶抑制 剂的研究也引起了人们的极大兴趣。 糖苷酶抑制剂即是可抑制糖苷酶的活性，阻断碳水化合物的分解，抑制淀粉、麦芽糖、蔗糖转变成单糖；影响糖脂、糖蛋白生物合成中寡糖链的修剪；所以糖苷酶抑制剂不但对一些糖代谢紊乱性 疾病如糖尿病、肥胖病等有临床应用价值[1] ，而且可作为抗AIDS病毒[2]、抗鼠白血病毒[3]的潜在治疗试剂。 本论文重点研究了糖苷酶中的β－半乳糖苷酶 β－半乳糖苷酶（β－galactosidase）又称β－D－半乳糖苷水解酶，（β－D－galactosid- -e galacto-hydrolase ,EC.3.2.1.23）,商品名为乳糖酶（Lactase），它广泛存在于豆类及其他各种动植物体内和微生物中。它能够催化β－半乳糖苷化合物中的β－半乳糖苷键发生水解，还具有转半乳糖苷的作用。由于它具有糖苷键结构特 异性，可作为乳糖降解和双糖合成催化剂[4,5]，并有水解生物体内储存的多糖和半乳糖残基.引起血型转化等生理功能[6,7]而受到人们广 泛关注，成为生物化学和酶催化化学的重要研究课题。
?-葡聚糖的研究进展 程彦伟李魁赵江 燕麦β－葡聚糖是一种存在于大燕麦皮中的天然非淀粉类水溶性植物糖，其基本结构是由D葡萄糖以β14，β1-3糖苷键连接而成的线性多糖，这两种糖苷键的比例大致为7：3。 燕麦β－葡聚糖是一种水溶性膳食纤维，因其具有的黏性阻碍淀粉、蛋白质等物质的消化和吸收，并可增殖消化道有益菌，所以可对人体具有一些极为有利的生理功能：具有显著的降血脂、降血糖及提高免疫能力，维持肠道微生态环境等。另外，它还能加快确定人群的免疫细胞。对细菌感染的反应并控制住细菌感染的位置，使感染面尽快恢复；作为化妆品的有效成分，可以提高皮肤抗过敏能力，激活免疫功能，延缓皮肤衰老。燕麦水溶性膳食纤维和燕麦葡聚糖，可有效降低餐后血糖浓度和胰岛素水平，降低胆固醇和预防心血管疾病.燕麦纤维食品易被人体吸收，并且因含热量很低，既有利于减肥，又适合心脏病,高血压和糖尿病患者食疗的需要。 降低胆固醇 早在多年，科学家就发现bata一葡聚糖能够减少肠胃吸收脂肪酸的速率,降低人体胆固醇的合成.随着bata一葡聚糖研究的日趋成熟，学者们先后在动物及人体实验水平上进行了大量的实验,证实了bata一葡聚糖在降低胆固醇和低密度脂蛋白方面具有特 异的生理功能.科学家发现bata一葡聚糖对胆固醇的影响主要在于能显著降低血浆中 总胆固醇(TC)和低密度脂蛋白胆固醇(LDI一TC),而对高密度脂蛋白(HDL)和甘油三醋(TG)没有明显影响仁。燕麦葡聚糖对高血脂人群有明显的降低胆固醇的作用。 有关燕麦葡聚糖降低胆固醇的机理目前有四种假说: ①可结合胆汁酸,增加了胆汁酸的排泄,从而降低胆汁酸水平和血浆胆固醇浓度。 ②可被肠道中微生物发酵而产生短链脂肪酸，可抑制肝脏中胆固醇的合成。 ③可促进LDL一C分解。 ④可在消化道中形成高粘度环境，阻碍消化道对脂肪，胆固醇和胆汁酸的吸收。 降血糖 每天食用葡聚糖燕麦食品后，患者血糖水平可降低约50%，使用燕麦食品有显著降低血糖作用燕麦汗葡聚糖可通过降低血脂含量，改善血液流动性能,加快糖类成分在吸收利用过程中的转运速度和效率，同时对糖尿病所并发的肝肾组织病变有良好的修复作用，并且可有效降低肝糖原的分解，从而导致血糖降低。 增强免疫力 燕麦葡聚糖具有免疫调节作用,燕麦p一葡聚糖可使小鼠淋巴细胞增值,增强小鼠 抵抗细菌侵袭的能力；可刺激小鼠腹膜巨噬细胞释放肿瘤坏死因子(TNF一ALPHAhe)和白介素一1(In-terlukinIL一1)及巨噬细胞p338DI的释放，经灌胃或肠外注射燕麦葡聚糖,小鼠血清免疫球蛋白数量明显增加，说明燕麦葡聚糖具有提高小鼠免疫力的作用。 抗癌功能
口服降糖药α-葡萄糖苷酶抑制剂（AGI）比较总结 （阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇） 一、AGI家族成员 二、AGI作用机制比较 三、AGI抑酶谱差异比较 四、AGI药动学参数差异比较 五、AGI用法用量区别比较 六、AGI降糖差异比较 七、患者用药注意事项 八、AGI常见不良反应比较 九、AGI特殊注意事项比较 α-葡萄糖苷酶抑制剂（AGI）是一种临床常用的口服降糖药，但它到底是一种怎样作用的降糖药物，不同的AGI之间又有怎样的区别呢？今天我们一起来了解一下。 一、AGI家族成员 常见的AGI包括阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇。认识他们从化学结构开始： 表1 阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇三药比较
图1 三药结构比较 二、AGI作用机制比较 糖类是人体最主要的供能物质。 食物中的糖包括多糖（淀粉）、双糖（包括麦芽糖、蔗糖等）、单糖（包括葡萄糖、果糖以及半乳糖）。 除单糖可以直接由小肠上皮细胞吸收入血外，其余均需经α-葡萄糖苷酶水解转化成单糖才能利用，也就是说如果抑制了α-葡萄糖苷酶活性就可以减少糖的吸收。 α-葡萄糖苷酶抑制剂的结构类似这些寡糖，能在寡糖与α-葡萄糖苷酶的结合位点与后者结合，可逆性抑制或竞争性抑制α-葡萄糖苷酶，减少寡糖分解为单糖，从而延缓肠道对单糖，特别是葡萄糖的吸收，使餐后血糖峰值渐变低平、波动减小，糖化血红蛋白（HbA1c）明显降低。如阿卡波糖，它是一种生物合成的假性四糖，其化学结构类似于四个葡萄糖结合成寡糖。 用药教育：
阿卡波糖等和碳水化合物（糖）化学结构相似，它会冒充碳水化合物，与肠道上水解碳水化合物的酶——α-葡萄糖苷酶结合，使真正的碳水化合物无法被水解，从而降低餐后血糖。 阿卡波糖等应在用餐前即刻整片吞服或与前几口食物一起咀嚼服用。如果饭后服用，α-葡萄糖苷酶已经与碳水化合物结合，或碳水化合物已被α-葡萄糖苷酶水解，阿卡波糖等将无法发挥降糖作用。 注意： α-葡萄糖苷酶是麦芽糖酶、异麦芽糖酶、α-临界糊精酶、蔗糖酶和乳糖酶等组成的一类酶的总称。 三、AGI抑酶谱差异比较 三种AGI最大的区别就是抑酶谱不同 表2 三药抑酶谱比较 阿卡波糖主要抑制蔗糖酶、葡萄糖淀粉酶及胰腺α-淀粉酶。 伏格列波糖主要抑制蔗糖酶和麦芽糖酶，且对这两种酶抑制活性远高于阿卡波糖，因不影响淀粉酶，食物中的淀粉在小肠转化为双糖，进入大肠的淀粉很少，故发生腹胀、排气增加等胃肠反应较少。 米格列醇对各种α-葡萄糖苷酶都有抑制作用，其中对蔗糖酶和葡萄糖淀粉酶抑制率最高，其原因可能是与葡萄糖结构更相似，更容易接近酶的
申报资料 Dossier 食品添加剂新品种New food additive 转葡糖苷酶Transglucosidase
公开征求意见的内容： 2、通用名称、功能分类，用量和使用范围 通用名称：转葡糖苷酶Transglucosidase 来源：李氏木霉Trichoderma reesei 供体：黑曲霉Aspergillus niger 功能分类：加工助剂食品用酶制剂 使用范围：主要应用于谷物加工，如低聚异麦芽糖的生产。用量：按生产需要适量使用，在低聚异麦芽糖的生产中的 推荐使用量为每吨干淀粉0.5-1.5公斤。
3、证明技术上确有必要和使用效果的资料或者文件 该商业化的转葡糖苷酶产品将替代本公司目前的由黑曲霉生产的转葡糖苷酶。李氏木霉是公认安全且产蛋白能力较高的微生物。本公司经过多年对该菌种基因、代谢能力的研究与改良，将其作为宿主菌开发并进行DNA重组表达。我们所开发的李氏木霉生产菌（表达了天然黑曲霉的转葡糖苷酶基因）与传统的黑曲霉相比，李氏木霉产酶的效率更高，生产过程更加稳定，从而节约了宝贵的资源，包括原料、能源和水，从可持续发展的观点，李氏木霉比传统的黑曲霉的生产更有优势。 该酶的使用与目前由黑曲霉生产的转葡糖苷酶相同。使用转葡糖苷酶的主要目的是把谷物淀粉中的低聚麦芽糖转化为低聚异麦芽糖（IMO）。在上述应用中，该酶可同时催化α-D-低聚葡萄糖的水解和转苷反应。转苷反应主要发生在葡萄糖基的6-OH上，从而使D-葡萄糖转化为异麦芽糖，以及从麦芽糖转化成潘糖。转苷反应也可发生在D-葡萄糖基的2-OH或3-OH上，形成曲二糖和糖化曲二糖，一部分还发生在4-OH上形成麦芽糖。该酶作用于麦芽糖，可以产生等摩尔浓度的潘糖（4-α-葡糖基麦芽糖）和葡萄糖。转苷反应的结果是低聚麦芽糖被转化成低聚异麦芽糖。
山药多糖提取物对葡萄糖苷酶的抑制实验 2 0 1 6 年5 月
一．所需试剂 （1）PBS缓冲液 称取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4,溶于800ml 蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至6.8，最后加蒸馏水定容至1L 称取NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4?12H2O 3.63g,KH2PO40.24g，溶于900ml 双蒸水中，用盐酸调pH值至6.8，加水定容至1L，常温保存备用。 实际配制500ML即可。 （2）3 mmol/L 谷胱甘肽溶液 谷胱甘肽分子量：307.32，称取46.1mg谷胱甘肽定容至50ml蒸馏水中，即为3 mmol/L 谷胱甘肽溶液。 （3）0.01 mol/L PNPG 溶液 4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷分子量：301.25,称取150.6mg定容至50ml蒸馏水水中，即为0.01 mol/L PNPG 溶液。 （4）0.2 mol/L Na2CO3溶液 Na2CO3分子量：105.99，称取2.12g定容至100ml,即为0.2 mol/L Na2CO3溶液一．实验流程 1】酶活性的测定 1.检测样配置 取67 mmol/L 磷酸盐缓冲液（pH 6.8）1.4 mL、 3 mmol/L 谷胱甘肽溶液40 μL， 0.01 mg/mL α-葡萄糖苷酶溶液60 μL， 37 ℃保温10 min 后， 加0.01 mol/L PNPG 溶液100 μL，摇匀， 37 ℃保温继续反应10 min， 加入0.2 mol/L Na2CO3溶液800μL终止反应， 于400 nm 波长处测定吸光值. 2.参比配置 取67 mmol/L 磷酸盐缓冲液（pH 6.8）1.4 mL、 3 mmol/L 谷胱甘肽溶液40 μL，
α-葡萄糖苷酶抑制剂常见不良反应 文章目录*一、α-葡萄糖苷酶抑制剂的常见不良反应*二、a-葡萄糖苷酶抑制剂的疗效*三、α-糖苷酶抑制剂的临床应用 α-葡萄糖苷酶抑制剂的常见不良反应1、α-葡萄糖苷酶抑制剂的常见不良反应 胃肠道反应:腹胀、腹痛、腹泻、胃肠痉挛性疼痛、顽固性便秘等。其他尚有肠鸣、恶心、呕吐、食欲减退等。长期应用或减少剂量可缓解。乏力、头痛、眩晕、皮肤瘙痒或皮疹等较少见。合用其他降糖药,如胰岛素、磺脲类或二甲双胍类药物时有发生低血糖的可能。 2、α-葡萄糖苷酶抑制剂的作用机制 食物中的淀粉(多糖)经口腔唾液、胰淀粉酶消化成含少数葡萄糖分子的低聚糖(或称寡糖)以及双糖与三糖,进入小肠经α- 葡萄糖苷酶作用下分解为单个葡萄糖,为小肠吸收。在生理的状态下,小肠上,中、下三段均存在α- 葡萄糖苷酶,在服用α- 葡萄糖苷酶抑制剂后上段可被抑制, 而糖的吸收仅在中、下段,故吸收面积减少,吸收时间后延,从而对降低餐后高血糖有益, 在 长期使用后亦可降低空腹血糖, 估计与提高胰岛素敏感性有关。 3、α-葡萄糖苷酶抑制剂是什么 碳水化合物在肠道的吸收要依靠小肠粘膜细胞分泌的小葡 萄糖昔酶的帮助,抑制小葡萄糖昔酶的作用,即能减少碳水化合 物在肠道的吸收。目前已研制出数种小葡萄糖昔酶抑制剂,研究
最多的是阿卡波糖。它的安全性和有效性已经临床研究给予肯定,常用剂量为50—100毫克,每日2—3次。另一种米格列醇,与阿卡波糖的临床效果相似,治疗剂量为50—100毫克,每日3次。 a-葡萄糖苷酶抑制剂的疗效1、中国人饮食的主要成分是淀粉和蔗糖,其不能被小肠直接吸收,需要在小肠绒毛上的多种a—葡萄糖苷酶(如葡萄糖淀粉酶、麦芽糖酶、蔗糖酶、异构麦芽糖酶等)的作用下生成单糖(葡萄糖及果糖)后才能被吸收。a—葡萄糖苷酶抑制剂可逆性竞争抑制小肠粘膜刷状缘的a—葡萄糖苷酶,抑制了淀粉、蔗糖、麦芽糖的分解,使葡萄糖的吸收减慢,使餐后血糖曲线较为平稳,从而降低餐后高血糖。 2、肥胖型的糖尿病患者,用运动疗法、饮食治疗不能满意控制血糖的患者,可以选用。葡萄糖耐量减低(1GT)患者。用a—葡萄糖苷酶抑制剂可以明显降低餐后高血糖。2型糖尿病患者应用磺脲类口服药或双胍类口服药治疗疗效不满意,尤其是餐后血糖控制不佳时应加用。1型糖尿病患者可作为胰岛素的辅助治疗药物,可减少胰岛素用量和稳定血糖。1型糖尿病患者用胰岛素治疗的患者反复出现午餐前低血糖者。 α-糖苷酶抑制剂的临床应用阿卡波糖:商品名拜唐苹、卡博平,每片50毫克。为预防肠胀气,可由小剂量开始,开始剂量25毫克,每日1～2次,观察数日,若无胃肠道副作用出现,即可增加
β-葡萄糖苷酶的研究 来源：添加时间：2011/2/24 13:43:00 β-葡萄糖苷酶的研究 1837年，Liebig和Wohler首次在苦杏仁汁中发现了β-葡萄糖苷酶。β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)的英文名是β-glucosidase，属于水解酶类，又称β-D-葡萄糖苷水解酶，别名龙胆二糖酶、纤维二糖酶和苦杏仁苷酶。它可催化水解结合于末端非还原性的β-D-糖苷键，同时释放出配基与葡萄糖体。 β-葡萄糖苷酶广泛存在于自然界中，它可以来源于植物、微生物，也可来源于动物。 β-葡萄糖苷酶的研究 1837年，Liebig和Wohler首次在苦杏仁汁中发现了β-葡萄糖苷酶。β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)的英文名是β-glucosidase，属于水解酶类，又称β-D-葡萄糖苷水解酶，别名龙胆二糖酶、纤维二糖酶和苦杏仁苷酶。它可催化水解结合于末端非还原性的β-D-糖苷键，同时释放出配基与葡萄糖体。 β-葡萄糖苷酶广泛存在于自然界中，它可以来源于植物、微生物，也可来源于动物。β-葡萄糖苷酶的植物来源有人参、大豆等；微生物来源的报道较多，如原核微生物来源的有脑膜脓毒性黄杆菌(Flavobacterium meningosepticum)、约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsonae)等，真核生物来源的有清酒酵母(Candida peltata)、黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）等；β-葡萄糖苷酶的动物来源有蜜蜂、猪肝和猪小肠等。鉴于β-葡萄糖苷酶的研究广泛，本文对其一些研究进展进行讨论。 1 β-葡萄糖苷酶的分类 β-葡萄糖苷酶按其底物特异性可以分为3类：第一类是能水解烃基-β-葡萄糖苷或芳香基-β-葡萄糖苷的酶，此类β-葡萄糖苷酶能水解的底物有纤维二糖、对硝基苯-β-D-葡萄糖苷等；第二类是只能水解烃基-β-葡萄糖苷的酶，这类β-葡萄糖苷酶能水解纤维二糖等；第三类是只能水解芳香基-β-葡萄糖苷的酶，这类酶能水解对硝基苯-β-D-葡萄糖苷等类似物。 2 β-葡萄糖苷酶的提取、纯化及酶活测定方法 2.1 β-葡萄糖苷酶的提取方法 不同来源的β-葡萄糖苷酶，其提取方法也有所不同。动植物体及大型真菌中的糖苷酶一般需要对酶源进行组织捣碎，然后用缓冲液浸提。常用的缓冲液有磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液等。pH值一般选用酶的稳定pH值；提取温度适于低温，一般为4 ℃。利用微生物发酵法生产β-葡萄糖苷酶是β-葡萄糖苷酶的另一来源，一般微生物发酵都采用液态发酵。对于胞外酶来讲，发酵液即为粗酶液；对于胞内酶，则需对微生物进行细胞破碎，使其释放出β-葡萄糖苷酶。 2.2 β-葡萄糖苷酶的纯化方法 粗提的β-葡萄糖苷酶可采用硫酸铵沉淀或用乙醇、丙酮等有机溶剂沉淀等方法初步分离。β-葡萄糖苷酶的进一步纯化，往往是根据具体情况，采用多种方法逐步分离。目前分离β-葡萄糖苷酶的方法较多，其中离子交换柱层析和凝胶过滤柱层析两种手段结合使用最为普遍，多数是先离子交换柱层析，后用凝胶过滤柱层析。离子交换柱层析方法中常用的是阴离子交换层析，如DEAE阴离子交换层析；同时，阳离子交换层析法也有一定的使用。除上述两种分离方法外，也有其它层析方法用于分离β-葡萄糖苷酶，如使用疏水层析法和羟基磷灰石层析法等。此外，也有人采用双水相萃取和亲和层析的方法来分离β-葡萄糖苷酶，但关于这方面的研究报道较少。 2.3 β-葡萄糖苷酶活性测定方法 β-葡萄糖苷酶的活性测定方法很多，常见反应底物有对硝基苯-β-D-葡萄糖苷(pNPG)、纤维二糖、水杨苷等。由于酶与pNPG作用产生的对硝基苯可用分光光度法在400 nm处测定，方法简单、反应快速、反应活性大，所以大多数实验采用pNPG作为底物的分光光度法测定酶活性。由于测定葡萄糖含量的方法很多，也有人通过测定葡萄糖含量来确定酶活力。孙迎庆等用多种方法测β-葡萄糖苷酶活性，如以二糖或寡糖为底物，用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶测定产生的葡萄糖量的方法来确定β-葡萄糖苷酶活性；用水杨苷为底物，将水杨苷裂解为水杨醇和葡萄糖，然后将酶解产物中的水杨醇用4-氨基安替吡啉作显色剂显色，用分光光度法在515 nm下比色测定β-葡萄糖苷酶活性。 3 β-葡萄糖苷酶的酶学性质 不同来源的β-葡萄糖苷酶在氨基酸序列、分子量、比活力、等电点、最适反应pH值、pH值稳定性范围、最适反应温度和热稳定性范围上均有很大差别（见表1）。 3.1 β-葡萄糖苷酶的分子量大小 β-葡萄糖苷酶由于其来源不同，它们的相对分子量也可能不同，而且它们的结构和组成也有很大差异。β-葡萄糖苷酶的相对分子量范围一般在40～250 kDa之间，而其结构可能是由单亚基、双亚基或多亚基构成。此外，有的菌株本身含有胞内和胞外β-葡萄糖苷酶，因此，有时来源于同一菌株的β-葡萄糖苷酶是两种不同分子量酶的混和物，甚至是多种不同分子量酶的混合物。 3.2 β-葡萄糖苷酶最适pH值及pI值 目前很多的研究结果表明，β-葡萄糖苷酶为酸性蛋白酶，其最适反应pH值一般在3.0～7.0范围内，其中许多酵母、细菌的胞内β-葡萄糖苷酶的最适反应pH值接近6.0左右；一般β-葡萄糖苷酶的pH值稳定性范围较广，在pH值3.0～10.0范围内，糖苷酶的稳定性较好。对大部分β-葡萄糖苷酶而言，它们的pI值都在酸性范围，并且变化不大，一般在3.5～5.5之间。如来源蜜蜂的β-葡萄糖苷酶，其pI值接近4.5～4.8。 3.3 β-葡萄糖苷酶的最适反应温度和热稳定性 β-葡萄糖苷酶的最适反应温度为40～110 ℃。一般来说，来自古细菌的β-葡萄糖苷酶其热稳定性和最适反应温度要高于普通微生物或动