目录
摘要 ............................................................................................................................................... IV 关键词 ............................................................................................................................................. V Abstract ......................................................................................................................................... VI Key words .................................................................................................................................... V II 第一章绪论 (1)
1.1 大肠杆菌及其致病机理 (1)
1.1.1 大肠杆菌和大肠杆菌病 (1)
1.1.2 致病性大肠杆菌的毒力因子 (2)
1.1.3 大肠杆菌致病机理 (4)
1.1.4 大肠杆菌病的感染途径 (5)
1.1.5 大肠杆菌病的治疗 (6)
1.2 大肠杆菌对β-内酰胺类药物的耐药性研究进展 (6)
1.2.1 大肠杆菌耐药性的产生 (6)
1.2.2 大肠杆菌耐药性产生的原因 (6)
1.2.3 大肠杆菌对β-内酰胺类药物的耐药机制 (7)
1.2.4 大肠杆菌对β-内酰胺类药物的耐药性研究进展 (9)
1.3 β-内酰胺酶及其抑制剂研究进展 (11)
1.3.1 β-内酰胺酶的产生 (11)
1.3.2 β-内酰胺酶的分类 (12)
1.3.3 β-内酰胺酶抑制剂研究进展 (12)
1.3.4 中药逆转大肠杆菌耐药性的展望 (14)
1.4 本研究的目的与意义 (14)
1.5 本研究的主要内容 (14)
第二章贵州部分地区猪源大肠杆菌的耐药性检测 (16)
2.1 试验材料 (16)
2.1.1 试验菌株 (16)
2.1.2 抗菌药物 (16)
2.1.3 培养基 (16)
2.1.4 主要试验仪器及设备 (17)
2.2药物敏感性试验方法 (17)
2.2.1 抗菌药物原液的制备 (17)
2.2.2 药敏试验抗菌药物浓度范围和配制 (17)
2.2.3 菌液的制备 (18)
2.2.4 菌液接种 (18)
2.2.5 质量控制 (18)
2.2.6 结果判读 (18)
2.3 试验结果与分析 (19)
2.3.1 药物敏感试验结果 (19)
2.3.2 耐药情况分析 (20)
2.4 讨论 (21)
第三章贵州部分地区猪源大肠杆菌ESBL耐药基因检测 (23)
3.1 试验材料 (23)
3.1.1 试验菌株 (23)
3.1.2 四种检测基因的引物 (23)
3.1.3 主要试剂及培养基 (23)
3.1.4 主要试验仪器及设备 (23)
3.2 试验方法 (24)
3.2.1 细菌的活化 (24)
3.2.2 水煮法提质粒DNA模板 (24)
3.2.3 PCR反应条件 (24)
3.2.4 PCR反应体系 (24)
3.3 耐药基因检测结果 (25)
3.4 讨论 (27)
第四章天然β-内酰胺酶抑制剂的筛选试验 (29)
4.1 试验材料 (29)
4.1.1 主要药品及试剂 (29)
4.1.2 主要试验仪器 (29)
4.2 试验方法 (30)
4.2.1 药品溶液的配制 (30)
4.2.2 AM标准曲线的制作 (30)
4.2.3 β-内酰胺酶酶活力测定 (30)
4.2.4 天然中药单体及其与AM混合液在5 min内的紫外吸收变化 (30)
4.2.5 天然中药单体抑酶试验 (31)
4.3 试验结果与分析 (31)
4.3.1 氨苄西林标准曲线 (31)
4.3.2 β-内酰胺酶水解AM引起的吸光度随时间的变化曲线 (32)
4.3.3 药物及药物与AM混合液的紫外吸收变化 (32)
4.3.4 天然中药单体抑酶试验结果 (32)
4.4 讨论 (34)
第五章有效中药单体对产ESBL大肠杆菌的增敏作用研究 (36)
5.1试验材料 (36)
5.1.1 试验菌株 (36)
5.1.2 培养基及试剂 (36)
5.1.3 试验药物 (36)
5.1.4 主要试验仪器设备 (37)
5.2 试验方法 (37)
5.2.1 纸片法筛选产β-内酰胺酶大肠杆菌 (37)
5.2.2 增敏试验方法 (38)
5.3 试验结果与分析 (38)
5.3.1 ESBL大肠杆菌筛选结果 (38)
5.3.2 增敏试验结果 (39)
第六章结论与展望 (45)
6.1 主要结论 (45)
6.2 展望 (46)
致谢 (47)
参考文献 (48)
附录 (53)
原创性声明 (54)
天然β-内酰胺酶抑制剂的筛选研究
摘要
β-内酰胺酶是病原菌对β-内酰胺类药物耐药的主要机制，尤其是超广谱β-内酰胺酶的产生导致该类抗菌药物在临床上治疗感染的疗效下降甚至失效，目前研发β-内酰胺酶抑制剂是解决这一耐药机制的一种有效途径。
本研究首先采用微量肉汤稀释法测定采自贵州不同地区规模化养猪场的482株大肠杆菌对9种β-内酰胺类抗菌药物的敏感性，其次采用PCR法和凝胶电泳法检测482株大肠杆菌所携带的表达超广谱β-内酰胺酶（Extended-Spectrum β-Lactamases，ESBL）的四种耐药基因情况，再次采用紫外分光光度法测定15种中药单体对β-内酰胺酶的抑制作用；最后采用微量肉汤稀释法和平板计数法测有效中药单体对产ESBL大肠杆菌的增敏作用，试验结果如下:
1、482株猪源大肠杆菌对9种抗菌药物表现出不同程度的耐药，其中氨苄西林的耐药率最高，为86.72%；氨曲南的耐药率最低，为38.38%；五重、四重和六重耐药菌株数相对较多，分别为124株、105株和95株；各个地区大肠杆菌菌株耐药情况存在一定的差异。
2、482株猪源大肠杆菌中，TEM，OXA-1，CTX-M-1和SHV基因的总检出率分别为59.13%，46.89%，32.57%和41.70%；其中20株同时检测出四种目的基因，90株同时检测出三种基因，175株同时检测出两种基因，166株仅检测出TEM基因，31株大肠杆菌未检测出这四种目的基因。
3、15种中药单体中，有七种能抑制β-内酰胺酶，且其抑制作用随其浓度的增大逐渐增强。在浓度为10 μg/mL时，芦荟大黄素、苦参碱和香紫苏醇与克拉维酸相比对β-内酰胺酶的抑制作用无显著性差异（P > 0.05）；在浓度为30 μg/mL 时，木犀草素和香紫苏醇与克拉维酸相比无显著性差异（P > 0.05）；在浓度为70 μg/mL 时，芦荟大黄素与克拉维酸相比无显著性差异（P > 0.05）；在浓度为90 μg/mL 时，芦荟大黄素对β-内酰胺酶的抑制效果最好。
4、七个中药单体分别联合头孢他啶、头孢噻肟、氨苄西林、阿莫西林和头孢噻呋五种抗菌药物，对产ESBL大肠杆菌均有不同程度的增敏作用，其中增敏作用效果较好的为芦荟大黄素和大蒜素，效果一般的为木犀草素、香紫苏醇和苦参碱，效果最差的槲皮素和五味子甲素。除了大蒜素以外，其余六种中药单体增